Yöntem makalesi

Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometrisi ile Proteinlerin Konformasyonel Karakterizasyonu için Kapiler Elektroforez Bazlı Hidrojen/Döteryum Değişimi

2.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62672

⸱

8 Haziran 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, 2Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, 3Department of Chemistry, University of British Columbia

Bu makalede

Özet

Burada, yukarıdan aşağıya kütle spektrometrisi ile birlikte kılcal elektroforez bazlı hidrojen / döteryum değişimi (HDX) yaklaşımı için bir protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşım, eşzamanlı diferansiyel HDX ve elektroforetik ayırma gerçekleştirerek, farklı durumlardaki proteinler ve farklı proteoformlar da dahil olmak üzere farklı protein türleri arasındaki yüksek dereceli yapılardaki farkı karakterize eder.

Özet

Çözelti içinde bir arada bulunan çoklu protein durumlarının konformasyonel heterojenliğinin çözülmesi, protein terapötiklerinin karakterizasyonunda ve moleküler tanımadan enzimatik katalize kadar biyolojik fonksiyonlar için kritik olan konformasyonel geçiş yollarının belirlenmesinde ana engellerden biri olmaya devam etmektedir. Hidrojen / döteryum değişimi (HDX) reaksiyonu, yukarıdan aşağıya kütle spektrometrik (MS) analizi ile birleştiğinde, protein yüksek dereceli yapıları ve dinamiklerini uygunlaştırıcıya özgü bir şekilde karakterize etmek için bir araç sağlar. Bu tekniğin konformasyonel çözme gücü, protein durumlarını bozulmamış protein seviyesinde ayırmanın ve HDX reaksiyonları sırasında deuterated olmayan protik içeriği en aza indirmenin verimliliğine büyük ölçüde bağlıdır.

Burada, konformasyonel çözünürlüğü iyileştirmeyi amaçlayan HDX MS yaklaşımının kılcal elektroforez (CE) tabanlı bir varyantını tanımladık. Bu yaklaşımda, proteinler kılcal elektroforetik ayırma sırasında deuterated bir arka plan elektrolit çözeltisinden (BGE) geçerken HDX reaksiyonlarına uğrarlar. Çözeltide bir arada bulunan farklı protein durumları veya proteoformlar, farklı yük-boyut oranlarına göre verimli bir şekilde ayrılabilir. Proteinler ve protik çözücü molekülleri arasındaki elektroforetik hareketlilikteki fark, artık deuterated olmayan çözücüyü en aza indirir ve HDX işlemi sırasında neredeyse tam bir deuterasyon ortamı sağlar. Akışlı mikroflaköz CE-MS arayüzü, püskürtücünün çıkışındaki söndürme ve denatüre edici değiştirici çözelti ile hızlı bir karıştırmanın ardından salınan protein türlerinin verimli elektrosprey iyonizasyonuna izin verir. Çevrimiçi yukarıdan aşağıya MS analizi, salınımlı bozulmamış protein türlerinin küresel deuterasyon seviyesini ve daha sonra gaz fazı parçalarının deuterasyonunu ölçer. Bu yazıda, sütte bir arada bulunan doğal protein varyantları da dahil olmak üzere sistemler için diferansiyel HDX'te bu yaklaşım gösterilmektedir.

Giriş

Farklı konformasyonel, bağlanma veya modifikasyon durumlarındaki protein türlerini ayırt etmek ve yapısal farklılıklarını karakterize etmek, moleküler tanımadan enzimatik katalize kadar biyolojik olaylarda yer alan bu türler arasındaki geçiş yollarının izlenmesi ve bu olayların altında yatan mekanizmaların anlaşılması için önemlidir. Konvansiyonel biyofizik teknikler, yetersiz çözünürlük ve çözümdeki dinamik bilgi kaybı gibi sınırlamalar nedeniyle tam bir çözüm sağlamamaktadır. Kütle spektrometresi (HDX MS) ile birleştirilmiş hidrojen / döteryum değişimi, proteinlerin yapısal ve konformasyonel özelliklerini, proteinlerin kararsız hidrojen atomları ile kasıtlı olarak tanıtılan 2H 2 O çözeltisinden 2 H arasındaki değişim yoluyla döteryum (2H) ile etiketleyen bir tekniktir. Hidrojen bağında rol oynayan veya protein içindeki çözücüden ayrılan protonlar kolayca değiş tokuş yapmazlar1. Bu nedenle, değiştirilebilir bir bölgedeki döviz kuru, daha yüksek dereceli yapılara katılımına büyük ölçüde bağlı olduğundan, protein yapıları, 1H ile 2 H arasındaki farklı atomik kütlelere dayanarak 2H-alımının kapsamını ve oranını araştıran MS tarafından yüksek uzamsal çözünürlükte ortaya çıkarılabilir. Son yıllarda, HDX MS, protein konformasyonlarını ve dinamiklerini incelemek için olağanüstü başarılı bir teknik haline gelmiştir2.

HDX MS'in klasik aşağıdan yukarıya yaklaşımında, farklı konformasyonel, bağlanma veya modifikasyon durumlarındaki protein türlerinin topluluğu, bozulmamış protein seviyesinde ayrılmadan proteolizlenir ve bu da ortaya çıkan proteolitik fragmanları kıvrımlı döteryum içeriğine sahip analiz ederek bireysel türlerin karakterize edilmesini imkansız kılar. Buna karşılık, yukarıdan aşağıya yaklaşımda, farklı döteryum içeriğini içeren farklı protein durumları veya proteoformlar, bir MS taramasında bozulmamış protein kütlelerinin çoklu dağılımlarına yol açar. Bu, bireysel türlerin, uygun bir kütle filtresi (dörtlü kutup gibi) kullanılarak her kütle dağılımına karşılık gelen iyonların kütle seçimi ve sonraki tandem MS analizi 3,4,5,6'daki konformasyonel farklılıklarının karakterizasyonu ile ayrılmasını sağlar. Bununla birlikte, bu stratejide protein durumlarını veya proteoformları ayırmanın etkinliği, karşılık gelen kütle dağılımlarındaki farkın derecesi ile sınırlıdır.

Kapiler elektroforez (CE), protein türlerini çözelti fazındaki farklı yüklerine ve hidrodinamik boyutlarına göre yüksek verimlilikle ayırmak için bir araç sağlar7. CE'yi HDX ile birleştirmek, çözelti aşamasında protein durumlarının veya proteoformların ek olarak ayrılmasını sağlar. Ek olarak, CE kılcal damarının küçük hacmi, arka plan elektrolit çözeltisi (BGE), yani çalışan tampon olarak tamamen deuterated bir çözeltinin kullanılmasına izin verir ve kılcal damarı protein numuneleri için bir HDX reaktörü olarak oluşturur. Elektroforez işleminde proteinler ve protik reaktifler arasındaki elektroforetik hareketlilik farkı nedeniyle, CE sırasında HDX'in yürütülmesi, minimum kalıntı deuterated olmayan içeriğe sahip protein analitleri için neredeyse tam bir deuterasyon ortamı ile sonuçlanır, böylece HDX verilerini kullanarak yapısal analizin duyarlılığını arttırır. Bu nedenle, protein üst düzey yapılarını duruma veya proteoforma özgü bir şekilde karakterize etmek için yukarıdan aşağıya MS ile birlikte CE tabanlı bir diferansiyel HDX yaklaşımı geliştirdik8.

Bu yazıda, materyal hazırlama, deneysel prosedür ve veri analizi adımlarını detaylandırarak bu yaklaşım için protokoller açıklanmaktadır. Yöntem performansını veya veri kalitesini etkileyebilecek faktörler kısa notlarda listelenmiştir. Burada sunulan temsili sonuçlar, farklı proteinlerin karışımlarının diferansiyel HDX verilerini ve süt9'da bulunan başlıca peynir altı suyu proteini olan sığır β-laktoglobulinin (β-lg) doğal varyantlarını içerir. CE tabanlı HDX sırasında β-lg'nin iki bol varyantının, yani A ve B10,11'in ayırma verimliliğini, tekrarlanabilirliğini ve 2H-etiketleme performansını ve konformasyonlarının varyanta özgü karakterizasyonunu gösteriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: MS analizine müdahale edebilecek kirleticileri en aza indirmek için mümkün olduğunca yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) sınıfı veya MS sınıfı reaktifler kullanın. Elektroforetik voltaj veya elektrosprey voltajının neden olduğu bir elektrik çarpması olasılığını önlemek için ölçüm sırasında CE-MS arayüzüne çıplak elle dokunmayın.

1. Malzeme hazırlama

  1. CE için kaynaşmış silika kılcal damarın modifikasyonu
    1. HPC tozunu (moleküler ağırlık [MW]: 100 kDa) suda ~ 12 saat boyunca manyetik bir karıştırıcı üzerinde veya katı parçacıkların tamamen kaybolmasına kadar sürekli karıştırılarak suda çözerek% 5 (w / w) hidroksipropil selüloz (HPC) çözeltisi hazırlayın12. Bir ultrasonicator ile görünür hava kabarcıklarını kaldırın.
    2. Yaklaşık 85 cm uzunluğunda kaynaşmış silika cam kılcal damarı (iç çap [ID]: 50 μm, dış çap [OD]: 360 μm) bir CE cihazına monte edin. Aseton13 gibi organik bir çözücüyü sürekli olarak infüze ederek, CE'nin otomatik örnekleyicisini 10-15 dakika boyunca 40 psi'lik bir infüzyon basıncında kullanarak kılcal damarı durulayın.
    3. Temizlenmiş kılcal damarı, otomatik örnekleyiciyi kullanarak 40 psi'lik bir infüzyon basıncında (genellikle ~ 40 dakika sürer) HPC çözeltisi ile doldurun. Kılcal damarda serbest hava akışını sağlamak için HPC dolu kılcal damara 40 psi'de hava demleyin, suya daldırıldıktan sonra kılcal damardan atılan hava kabarcıkları ile gösterilir.
    4. HPC kaplı kılcal damarı, Şekil 1'de gösterilen sıcaklık programını izleyerek, kılcal damardan akan azot gazı (25 psi) ile sıcaklık programlanabilir bir fırında (ideal olarak sıcaklık programlı bir gaz kromatografının sıcaklık kontrollü kolonlu fırını) pişirin.
    5. Kılcal damarı dışarı çıkarmadan önce fırını oda sıcaklığına soğutun. CE ayrımı için bu HPC modifiye kılcal damarı kullanın.

figure-protocol-1
Şekil 1: Kılcal pişirme için önerilen bir sıcaklık programı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Arka plan elektrolit (BGE) çözeltisi ve değiştirici çözelti8
    1. Uygun miktarda amonyum asetat2 H 2O'da çözerek istenen konsantrasyonda (örneğin, 10 mM) 1-10 mL BGE hazırlayın 200 μL-aliquots BGE ayrı BGE şişelerine yerleştirin ve BGE ile havadaki su buharı arasındaki HDX reaksiyonunu en aza indirmek için şişeleri parafilm ile kapatın.
    2. Formik asit kullanılarak pH'ı 2,5'e ayarlanmış% 75 (v / v) metanol ve% 25 (v / v) su ile 10 mL'lik bir değiştirici çözelti hazırlayın.
      NOT : Yanzincirlerdeki döteryum atomları ve korunmasız omurga amidleri MS tarafından tespit edilmek üzere muhafaza edilmeliyse, değiştirici çözeltiyi hazırlamak için 2 H2O ve deuterated metanol kullanın.
  2. Protein numunelerinin tuzdan arındırılması
    1. İstenilen konsantrasyonda deuterated olmayan suda bir amonyum asetat çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Elektroforez sırasında yüksek elektrik akımını ve bunun sonucunda ortaya çıkan Joule ısıtma etkisini önlemek için 100 mM'den daha düşük bir konsantrasyon önerilir.
    2. Gerektiğinde, formik asit (pH < 6.8 için) veya amonyum hidroksit (pH > 6.8 için) kullanarak amonyum asetat çözeltisinin pH'ını istenen seviyeye ayarlayın.
    3. Protein çözeltisinin orijinal tamponlarını, uygun bir MW kesimine sahip santrifüj filtre kullanarak en az beş sıralı konsantrasyon ve 4 ° C'de seyreltme adımlarından geçen bir amonyum asetat çözeltisi (istenen konsantrasyonda deuterated olmayan suda hazırlanır; amonyum hidroksit ile 7.5'e ayarlanmış pH) ile değiştirin.
      NOT: Tuzdan arındırılacak protein numuneleri, önceki üretim prosedürlerinden (örneğin, saflaştırma veya formülasyon) veya liyofilize protein tozunun çözülmesiyle hazırlanabilir. Bu adımda numune çözeltilerinden çıkarılacak "tuzlar", genel olarak uçucu olmayan tüm küçük iyonları veya molekülleri ifade eder. Bu türler elektroforez işlemi sırasında proteinlerden verimli bir şekilde ayrılabilse de, elektroforetik çözünürlükten ödün vermemek ve böylece kütle spektrometresinin kirlenmesini en aza indirmek için bu adım önerilir. Protein analitlerinin spesifik tuzlar veya katkı maddeleri ile stabilize edilmesi gerektiğinde, bunları BGE'ye dahil edin.
    4. Mikro hacimli bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.

2. CE tabanlı HDX MS analizinin yapılması

NOT: Bu yaklaşımda kullanılan kütle spektrometresi, Fourier dönüşümlü iyon siklotron rezonansı (FTICR) veya orbitrap gibi ultra yüksek çözünürlüklü bir kütle analizörü, parçalanma için öncü iyonların kütle seçimine izin veren bir kuadrupol gibi bir kütle filtresi ve güvenilir tandem MS verileriyle (ideal olarak parça iyonlarının izotopik olarak çözülmüş sinyalleri) yukarıdan aşağıya analiz gerçekleştirmek için elektron transfer ayrışması (ETD) veya elektron yakalama ayrışması (ECD) fonksiyonları ile donatılmalıdır.

  1. CE ve MS ayarlarının optimizasyonu
    1. Bozulmamış proteinlerin (MS1) ve gaz fazı parçalarının (MS2) ölçümü için MS ayarlarını optimize etmek üzere metal kaplı bir borosilikat cam kılcal damardan ("statik" nanoESI şeması) önceden yüklenmiş numuneyi veya metal yayıcıdan sürekli olarak demlenen numuneyi püskürterek standart bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) kaynağı kullanarak bir pilot MS ölçümü gerçekleştirin. İlgilenilen protein türlerini, iyonlarının topluluğunun kütle seçimi ile tek bir yük durumunda, ardından öncü iyonların ETD veya ECD'si ile parçalayın.
      NOT: Temel ayarlar, çözünmeyi etkileyen parametreleri, öncü iyonların kütle seçimini (diğer türlerden gelen parazitleri önlemek için) ve parçalanma verimliliğini içerir. Kütle seçim penceresinin hem merkezi hem de genişliği, HDX'ten sonra analit iyonlarının ortaya çıkan kütle dağılımına uyacak şekilde arttırılmalıdır. CE'deki bir protein türünün elüsyon penceresi tipik olarak 0,5 dakika ila 2 dakika arasında değiştiğinden, karşılaştırılabilir bir zaman penceresinde biriken MS2 taramalarına dayanarak parçalanma verimliliğini değerlendirin. Bu parametrelerin optimal değerleri proteine özgüdür; okuyucular, örnek ayarlar 8,14 için daha önce yayınlanmış raporlara yönlendirilir.
    2. Protein türlerinin ayrılması ve HDX reaksiyon sürelerine eşdeğer göç süreleri için CE ayarlarını optimize etmek için optik dedektör ile donatılmış bir CE cihazı, yani bir fotodiyot dizisi (PDA) dedektörü veya bir UV dedektörü kullanarak bir pilot CE ölçümü gerçekleştirin.
      NOT: Bu adım, CE'nin optik dedektörünün kullanılabilirliğine bağlı olarak isteğe bağlıdır. Optik dedektörün yokluğunda, CE ayarları, bölüm 2.2'nin tamamlanmasının ardından, bölüm 2.3'te açıklanan talimatlar izlenerek CE-MS kullanılarak optimize edilebilir. Temel ayarlar, ayırma verimliliğini etkileyen parametreleri, elektroferogramlarda gösterilen tepe şekillerini ve elüsyon sürelerini içerir.
  2. CE-HDX kurulumunun ön koşullandırılması
    1. Oda sıcaklığında en az 30 dakika ultrasonikasyon kullanarak% 50 metanol,% 49 su ve% 1 formik asit (v / v) karışımı ile akışlı mikroftek CE-MS arayüzünü temizleyin.
    2. HPC modifiye kılcal damarın bir CE cihazına monte edilmesinden sonra, otomatik örnekleyiciyi kullanarak kılcal damarı BGE ile 10 dakika boyunca durulayın ve kılcal damarı BGE ile dolu bırakın.
    3. Modifiye edici çözelti için infüzyon borusu olarak uygun uzunlukta değiştirilmemiş erimiş silika kılcal boru (ID: 50 μm, OD: 360 μm) elde edin. Değiştirici boruyu, bir birlik ve uygun manşon kullanarak künt bir uçla gaz geçirmez bir cam şırıngaya bağlayın ve tüpü en az 10 dakika boyunca bir infüzyon pompası kullanarak değiştirici çözelti ile durulayın.
    4. İlgili çözeltilerle yüklenmiş HPC kaplı CE kılcal ve değiştirici borunun çıkışlarını, Şekil 2'de gösterildiği gibi, temizlenmiş CE-MS arayüzüne yerleştirin.
    5. Değiştirici çözeltinin arayüzün ucuna ulaştığından emin olmak için değiştirici infüzyon için şırıngayı manuel olarak veya infüzyon pompasıyla ilerletin. Birleştirilmiş CE-MS arayüzünü bir kütle spektrometresinin nanoESI kaynak muhafazasına monte edin.

figure-protocol-2
Şekil 2: CE tabanlı HDX MS kurulumunun şematik gösterimi. Bu rakam8'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: BGE = arka plan elektrolit çözeltisi; CE = kılcal elektroforez; MS = kütle spektrometrisi; HDX = hidrojen/döteryum değişimi; ESI = elektrosprey iyonizasyonu; FTICR = Fourier dönüşümlü iyon siklotron rezonansı; ETD = elektron transferi ayrışması; ECD = elektron yakalama ayrışması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Eşzamanlı CE ayrımı, HDX reaksiyonu ve MS analizi
    NOT: Deuterated BGE'nin mühür açıldıktan sonraki 1 gün içinde kullanılması önerilir.
    1. CE-MS arayüzüne 3-5 kV'luk bir püskürtme voltajı uygulayın.
    2. Değiştirici çözeltiyi infüzyon pompası ile 0,1 ila 10 μL/dak arasında değişen bir akış hızında demlemeye başlayın ve CE-MS arayüzünün ucunda kararlı bir elektrosprey sağlayın.
    3. BGE'yi içeren numune şişesini otomatik numune alma cihazına yerleştirin ve boş elektroferogramlar ve boş kütle spektrumları elde etmek için adım 2.3.4'te kullanın.
    4. Otomatik numune alma cihazını kullanarak numunenin istenen miktarda enjekte edilmesine izin vermek için numune çözeltisini 2 psi'de ve uygun bir süre boyunca enjekte edin. Enjeksiyon hacmi ile enjeksiyon parametreleri arasındaki ilişkiyi kullanarak enjeksiyon hacmini tahmin edin15 denklem (1) ile tanımlanmıştır.
      figure-protocol-3 (1)
      V inj enjeksiyon hacmi, Δp enjeksiyon basıncı, dc kılcal damarın iç çapı, A kılcal damarın kesiti, t inj enjeksiyon süresi, η kılcal damardaki sıvının viskozitesidir ve L kılcal damarın uzunluğudur.
    5. CE ayrımını 30 kV'luk bir elektroforetik voltaj ve 0 ila 2 psi arasında değişen infüzyon basıncı uygulayarak başlatın ve elektroferogramı edinin. Bu arada, iyon akım grafiğinin zamanın bir fonksiyonu olarak alındığı ve karşılık gelen MS taramalarının otomatik olarak tek bir spektrumda birleştirilmediği kromatografik modda MS verilerinin elde edilmesine başlayın.
      NOT: Proteinler, bu adımda elektroforetik göçleri sırasında BGE'deki2 H2O molekülleriyle temas noktasında kendiliğinden HDX reaksiyonuna girerler. CE için optik algılama, MS algılamaya ek olarak kullanılabilir. Kolon üzerinde algılama, kaynaşmış silika kılcal damarın çıkış ucundaki belirli bir poliimid kaplamanın çıkarılmasını gerektirdiğinden, CE-MS arayüzünün montajı sırasında kılcal hasarı önlemek için ek özen gösterilmelidir.
    6. Boş elektroferogramı ve kütle spektrumlarını referans olarak kaydedin.
      NOT: Boş veriler, temel çıkarma yerine sorun giderme için kullanılmalıdır.
    7. Protein numune çözeltilerinin istenen konsantrasyonlarını içeren numune şişelerini otomatik numune alma cihazına yerleştirin. 2.3.4-2.3.5 adımlarını izleyerek protein örnekleri için elektroferogramları ve kütle spektrumlarını edinin. Elektroforetik olarak ayrılmış MS1 spektrumlarını ve 2H etiketli protein türünü elde etmek için yeterli sayıda MS taraması toplayın.
    8. MS1 spektrumlarını aynı koşuda edindikten sonra veya sonraki, ayrı bir çalışmada ilgili türler için tandem MS ölçümleri gerçekleştirin.
    9. Gerektiğinde, infüzyon basıncını veya CE kılcal damarının uzunluğunu değiştirerek migrasyon sürelerini / HDX reaksiyon sürelerini ayarlayın. HDX reaksiyon süresinin migrasyon süresinden daha kısa olması gerekiyorsa, CE işlemi sırasında kılcal damarda hem deuterated hem de deuterated BGEkullanan daha önce açıklanan 8 yaklaşımını kullanın.
    10. CE kılcal damarını BGE ile her ölçümden sonra en az 10 dakika boyunca 20 psi basınçta yıkayın.
    11. Deneylerin tamamlanmasının ardından, CE-MS arayüzünü ve depolama için tüm boruları temizleyin.
    12. Doğrudan infüzyon modunda MS ile HDX "uç nokta" örneğinin (daha önce6,16'da açıklanan yaklaşımlar kullanılarak hazırlanabilen) bir veri setini edinin.
      NOT: Bu adım yalnızca CE tabanlı HDX için deuterated değiştirici çözümü kullanıldığında gereklidir.

3. Veri analizi

  1. CE verilerinin analizi
    1. Tepe noktası sayısı, göç süreleri ve ayırma verimliliği dahil olmak üzere elektroforetik özellikleri belirlemek için elektroferogram olarak aşağıdaki grafiklerden birini kullanın: (a) CE cihazının optik dedektörü tarafından elde edilen UV emilimi ve göç süresi (varsa); (b) MS tarafından elde edilen toplam iyon akımı (TIC) grafiği; (c) MS tarafından elde edilen ekstrakte iyon akımı (EIC/XIC) grafiği.
      NOT: EIC/XIC, yukarıda belirtilen elektroferogram formatları arasında genel olarak optimum sinyal/noise oranını (S/N) sağlar. Herhangi bir enstrümantal önyargının yokluğunda bile, UV emilimi proteinin kütle konsantrasyonu ile orantılı iken, MS sinyalinin molar konsantrasyonla orantılı olması dikkat çekicidir. Bu nedenle, CE ve MS türevi elektroferogramlar arasındaki tepe modellerindeki farklılıkları gözlemlemek mantıklıdır.
    2. Yarı kantitasyon için elektroferogramlarda gösterilen tepe noktalarının eğrisinin (AUC) altındaki alanı kullanın. Protein komplekslerini içeren örnekler için, TIC / EIC elektroferogramlarından kütle konsantrasyonu verilerini çıkarmak için daha önce17'de açıklanan yaklaşımı kullanın.
  2. MS verilerinin analizi
    1. MS1 ve MS2 spektrumlarını, sırasıyla karşılık gelen elüsyon pencerelerinde edinilen MS1 ve MS2 taramalarını birleştirerek elde edin.
    2. Bozulmamış proteinin (M (bozulmamış protein)) kütlelerini ve fragmanlarını aşağıdaki iki yöntemden biriyle belirleyin.
      1. İzotopik olarak çözülmüş sinyal kümelerine yol açan iyonların ortalama kütlelerini hesaplayın.
      2. Karşılık gelen izotopik zarfların takılmasından kaynaklanan Gauss benzeri eğrilerin merkezini kullanın6.
    3. Parça iyonlarının kütle listesini oluşturmak ve bunları tanımlamak için Biopharma Finder, ProSight18 veya MASH Suite19 gibi yazılımları kullanın.
  3. HDX verilerinin analizi
    1. Denklemi kullanarak bozulmamış bir protein türünün genel döterasyon seviyesini belirleyin (2).
      figure-protocol-4 (2)
      burada M (2 H) veya M (1 H) 2H veya 1H atom ağırlıklarıdır. Yıldız işareti, 2H etiketli numunenin verilerini gösterir.
    2. Belirli bir segmentin omurga-amidlerinin kümülatif korumasını veya kümülatif deuterasyonunu belirleyin.
      1. Deuterated değiştirici çözümü ile elde edilen veriler için, kümülatif koruma seviyesini belirlemek üzere (3) ve (4) denklemlerini kullanın.
        figure-protocol-5 (3)
        figure-protocol-6 (4)
        P(S k(N)), 1'denk'ye kadar olan kalıntıları kapsayan N-terminal segmentinin toplam korumasıdır, P (S m (C)),m kalıntılarını içeren C-terminal segmentinin toplam korumasıdır, M (2 H) veya M (1 H) 2H veya 1H atom ağırlıklarıdır ve M (c i) veya M (z i), c i veya zi iyonlarının moleküler ağırlıklarıdır.
        NOT: Çift yıldız işareti, HDX "uç nokta" örneğinin verilerini gösterir.
      2. Deuterated olmayan bir değiştirici çözelti ile elde edilen veriler için, kümülatif döterasyon seviyesini belirlemek üzere (5) ve (6) denklemlerini kullanın.
        figure-protocol-7 (5)
        figure-protocol-8 (6)
        Burada D(S k(N)), 1'denk'ye kadar olan kalıntıları kapsayan N-terminal segmentinin kümülatif döteryum alımıdır; D(S m(C)), m kalıntılarından oluşan C-terminal segmentinin kümülatif döteryum alımıdır.
    3. Yerel bir omurga amid grubunda döterasyon seviyesini belirleyin
      1. Deuterated değiştirici çözeltisiyle elde edilen veriler için, yerel koruma düzeyini belirlemek üzere (7), (8), (9), (10) ve (11) denklemlerini kullanın.
        c-iyonlarından çıkarılan veriler için
        figure-protocol-9 (7)
        z-iyonlardan çıkarılan veriler için
        figure-protocol-10 (8)
        Burada P(R i), kalıntıi'deki bir omurga amidinin korunmasıdır ve "total" alt simgesi, proteinin toplam kalıntı sayısını gösterir.
        Sonraki parça iyonlarının eksik olduğu kalıntı bölgeleri için, (9) ve (10) denklemlerini kullanarak P(Ri) atayın.
        c-iyonlarından çıkarılan veriler için
        figure-protocol-11 (9)
        z-iyonlardan çıkarılan veriler için
        figure-protocol-12 (10)
        Daha sonra, denklemi (11) kullanarak yerel bir omurga amid grubundaki döterasyon seviyesi D(Ri)'yi belirleyin.
        figure-protocol-13(11)
      2. Deuterated olmayan bir değiştirici çözümle elde edilen veriler için, yerel koruma düzeyini belirlemek üzere (12), (13), (14) ve (15) denklemlerini kullanın.
        c-iyonlarından çıkarılan veriler için
        figure-protocol-14(12)
        z-iyonlardan çıkarılan veriler için
        figure-protocol-15(13)
        Burada D(R i), kalıntıi'deki bir omurga amidinin korunmasıdır ve "toplam" alt simgesi, proteinin toplam kalıntı sayısını gösterir.
        Sonraki parça iyonlarının eksik olduğu kalıntı bölgeleri için, (14) ve (15) denklemlerini kullanarak D(Ri) atayın.
        c-iyonlarından çıkarılan veriler için
        figure-protocol-16 (14)
        z-iyonlardan çıkarılan veriler için
        figure-protocol-17 (15)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

BGE'nin infüzyon basıncının değiştirilmesi, ayrılacak proteinlerin HDX reaksiyon süresine eşdeğer olan hem ayırma verimliliğinin hem de migrasyon süresinin ayarlanmasını sağlar (Şekil 3). Daha düşük bir infüzyon basıncı, deney süresi pahasına CE zirvelerinin daha iyi ayrılmasına neden olur (Şekil 3A). Daha uzun bir migrasyon / HDX reaksiyon süresi, protein analitlerinin daha yüksek düzeyde deuterasyonuna neden olur (Şekil 3B-D

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

CE kılcal damarının iç duvarının kaplanmasının amaçları, CE işlemi sırasında elektroozmotik akışın ve protein emiliminin en aza indirilmesini içerir13. Elektroozmotik akış, nötr veya zıt yüklü türleri dedektöre sürme kabiliyeti nedeniyle küçük moleküllerin geleneksel CE analizi için faydalı olsa da, benzer boyutlara ve çözeltideki net yüklere sahip protein türlerinin ayırma verimliliğini tehlikeye atar. Kılcal damarın HPC ile kaplanması, kılcal damarın iç duvarındaki silanol gruplarının neden oldu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

D. D. Y. Chen, akışlı mikroflaköz CE-MS arayüzünü ticarileştiren Biyomoleküller için Sağlık Enstitüsü Bilgisi'nin kurucularından biridir. Diğer yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (NSFC 21974069) gelen hibelerle desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Hücre Analizi Enstitüsü, Shenzhen Körfezi Laboratuvarı, Çin'den destek aldı; Jiangsu Biyomedikal Fonksiyonel Malzemeler İşbirlikçi İnovasyon Merkezi; ve Nanjing Normal Üniversitesi, Çin'deki Jiangsu Anahtar Biyomedikal Malzemeler Laboratuvarı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
amonyum asetatFisher Chemical A/ 3446/50& ge; % 99
CESI 8000 plus kılcal elektroforez sistemiSciex, ABD
santrifüjEppendorf5406000097
filtreMerckUFC20102410 kDa kesme
döteryum oksitEnerji KimyasalE090001% 99,9 D
formik asitAcros Organics 
erimiş silika cam kılcalPolymicro Technologies1068150017ID 50μ m, OD 360 ve mu; m
gaz kromatografisiAgilentGC6890N
hidroklorik asitSigma Aldrich258148
hidroksipropil selülozAladdinH113415MW 100000
manyetik karıştırıcılarDLAB8030101212
metanolFisher ChemicalA456-4MS sınıfı
mikro hacim UV-Vis spektrofotometreDeNovix84677JK7731
miyoglobinSigma AldrichM1882
Orbitrap Fusion Lumos kütle spektrometresiThermo Fisher Scientific, ABD
PA 800 Plus Farmasötik Analiz CE SistemiBeckman Coulter, ABD
Q Exactive UHMR kütle SpektrometresiThermo Fisher Scientific, Almanya
sodyum  hidroksitSigma AldrichS5881
ubiquitinSigma AldrichU6253
ultrasonicatorSCIENTZSB-5200
& beta; -laktoglobulinSigma AldrichL0130
santrifüj 270480250

Kaynaklar

  1. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169(2020).
  2. Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
  3. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
  4. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
  5. Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
  6. Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
  7. Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
  8. Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
  9. Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
  10. Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
  11. Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
  12. Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
  13. Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
  14. Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
  15. Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille's law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
  16. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  17. Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
  18. Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
  19. Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
  20. Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
  21. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  22. Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
  23. Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173(2019).
  24. Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
  25. Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein KonformasyonuProtein Terap tikleriElektroforetik Ay rmaD teryum EtiketlemeElektrospray yonizasyonuProtein VaryantlarFragment yon Analizi

İlgili makaleler