Protein Düşük Yatan Konformasyon durumlarını tespit etmek için Yüksek Basınçlı NMR Deneyleri

Proteinlerin ve protein komplekslerinin daha yüksek enerjili, seyrek nüfuslu konformasyon durumlarının birçok biyolojik yolda kilit rol oynadığı uzun zamandır kabul edilmektedir^1,2,3. Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)^4,Kimyasal Değişim Doygunluk Transferi (Tsİ)⁵ve karanlık durum değişim doygunluk transferi (DEST)⁶ darbe dizisi (diğerleri arasında) tabanlı deneyler sayesinde, çözelti NMR spektroskopisi geçici uygun durumları karakterize etmek için bir seçim yöntemi olarak ortaya çıkmıştır⁷. Bu deneylerle birlikte, daha yüksek enerji konformasyonel alt durumlarının göreli popülasyonunu artırmak için sıcaklık, pH veya kimyasal denatürantlar gibi pertürbasyonlar da tanıtılabilir. Benzer şekilde, protein dengesi de yüksek hidrostatik basınç uygulanarak bozılabilir. İlgili konformasyon değişiklikleriyle ilişkili hacim değişiminin büyüklüğüne bağlı olarak, basıncın birkaç yüz ila birkaç bin çubuk artması, daha yüksek bir enerji durumunu önemli ölçüde stabilize edebilir veya bir proteinin^{tamamen ortaya}çıkmasına neden olabilir 8 ,^9,10. Protein NMR spektrumu tipik olarak hidrostatik basınçla iki tür değişiklik gösterir: (i) kimyasal kayma değişiklikleri ve (ii) pik yoğunluk değişiklikleri. Kimyasal kayma değişiklikleri, protein yüzey suyu arayonundaki değişiklikleri ve/veya protein yapısının hızlı bir zaman ölçeğinde (NMR zaman ölçeğine göre) yerel sıkıştırmasını yansıtır^11. Büyük doğrusal olmayan kimyasal kaymalar gösteren çapraz geçişler basınç bağımlılığı, daha yüksek enerji konformasyon durumlarının varlığını gösterebilir^12,13. Öte yandan, pik yoğunluk değişiklikleri, katlanmış/katlanmış durum popülasyonlarındaki değişiklikler gibi yavaş bir zaman ölçeğinde büyük konformasyon geçişlerine işaret eder. Katlanır ara maddelerin veya daha yüksek enerji durumlarının varlığı, belirli bir proteinin farklı kalıntıları için ölçülen açma üzerine hacim değişiminin büyüklüğündeki büyük varyasyonlardan tespit edilebilir^14,15,16,17. Deneyimlerimize dayanarak, tipik olarak iki durumlu klasörler olarak sınıflandırılan küçük proteinler bile, yerel katlama stabiliteleri hakkında yararlı bilgiler sağlayan basınca karşı tekdüze olmayan yanıtlar sergiler. Burada açıklanan, heterojen nükleer ribonükleoprotein ^A1'in(hnRNPA1) izole RNA tanıma motifi 2'yi (RRM2) model protein olarak kullanarak, amide tepe yoğunluğu ve 1 H kimyasal kayma basınç bağımlılığının kazanılması ve analizi için bir protokoldür.

NOT: Burada açıklanan protokol, (i) 2,5 kbar dereceli alüminyum sertleştirilmiş zirkonya tüpü^18,(ii) NMR spektrumunun analizi için SPARKY¹⁹ yazılımı ve (iii) bir eğri uydurma yazılımına sahip yüksek basınçlı bir pompa ve hücre gerektirir.

1. Numune hazırlama, yüksek basınç hücresinin montajı ve deneylerin ayarlanması.

1. Tampon seçimi: Fosfat ve Tris^20,21gibi anionik ve katyonik tamponların eşit karışımını kullanın.
   NOT: Fosfat ve MES gibi anionik tamponların pKa'ları önemli bir reaksiyon hacmi (yani, asit ve iyonize ürünlerin kısmi molal hacimlerindeki fark) ile ilişkilidir. Bu nedenle, bu tür tamponların pH'ı basınç değişiminden önemli ölçüde etkilenebilir (~0,25-0,5 pH birim/kbar).
2. Gerekli numune hacminin standart 3 mm çapında NMR tüpüne (~300μL) benzer olduğundan emin olun.
3. ^{15 N}etiketli numuneyi zirkonya tüpüne cam pipet ile sokun. Tüpün altındaki örnek koltuklardan emin olun. Numunenin iletim sıvısı (örneğin su) ile karışmasını önlemek için 200 μL mineral yağ ile tamamlayın. Tüpün geri kalanını iletim sıvısı ile doldurun.
4. Zirkonya tüpünün üzerine tek kullanımlık bir O-halka koyun ve tüpü tabana kaydırın (Şekil 1A, B). Daha sonra tüpü yüksek basınçlı bağlama hattına bağlayın ve tabanı önce elle hücreye sıkın. Daha sonra, daha düşük basınçta sızıntıları önlemek için 14,7 Nm tork uygulayın (Şekil 1C,D).
5. Basınç hücresi tertibatının bütünlüğünü kontrol etmek için, hücre desteği ve muhafaza kabını kullanarak tüpü spektrometrenin dışında 300 bar'a kadar basınçlandırın. 15 dakika bekleyin, basıncı 1 bara sıfırlayın ve temiz tüy bırakmayan bir mendille sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
6. Basınçsız tüpü, bağlama hattını dikkatlice yönlendirerek spektrometreye yerleştirin. Numune oturma konumuna ulaşana kadar tüpü spektrometreye kaydırın(Şekil 1E).
7. 1 H ve ^{15 N} kanallarını her zamanki gibi kilitleyin, dolgu yapın, eşleştirin ve ayarlayın.
   NOT: Yüksek basınç dereceli zirkonya tüpleri için dolgular standart NMR tüplerinden çok farklıdır. Optimize edilmiş dolguların ileride kullanılmak üzere kaydedilmeleri önerilir.
8. ¹H-¹⁵N-HSQC veya TROSY-HSQC kurun ve atmosferik koşullarda (1bar) bir referans deneyi kaydedin.

2. Yüksek basınçlı NMR deneylerinin kaydedilme

1. Proteinin genel stabilitesini test etmek için basıncı kademeli olarak 500 bar artışla 1 bar'dan 2,5 kbar'a yükseltin. Basınç pompasının hızını varsayılan olarak ~18 bar/s olarak ayarlayın. Kesin katlama/açılma oranları bilinmiyorsa, numunenin her 500 barlık artıştan sonra 15-20 dakika arasında dengelenmesine izin verin. 2,5 kbar'da bir spektrum kaydedin.
2. Basınç pertürbasyonunun geri döndürülebilirliğini test etmek için 500 bar adımlarla basıncı kademeli olarak 1 bar'a düşürin. Atmosferik koşullarda başka bir spektrum kaydedin ve kimyasal kaymaları ve tepe yoğunluklarını daha önce aynı koşullarda kaydedilen referans spektrumununkiyle karşılaştırın.
   NOT: Basınç çalışmasından sonra yerel çapraz geçişler daha yoğunsa, atmosferik basınçta çözeltide bulunan küçük agregaların ayrışmış ve düzgün bir şekilde yeniden katlanmış olabileceğini gösterebilir. Öte yandan, yoğunluktaki bir kayıp veya önemli kimyasal kayma değişiklikleri, proteinin yüksek basınç koşullarında geri döndürülemez bir yanlış katlama yaşayabileceğini göstermektedir.
3. Her 500 barda 1 bar'dan 2,5 kbar'a kadar bir dizi 2D deneme kaydedin. Uyumun hassasiyetini artırmak için katlama/açma geçişinin çekim noktasının yakınında ek deneylerin kaydedilmeleri önerilir.

3. Tepe yoğunluğu değişikliklerini analiz etme

1. Tüm spektrumu işleyin ve omurga atamasını 1 çubukta referans spektrumundan 500 bar'da kaydedilen spektruma aktarın ve ardından atamayı 500 bar'dan 1 kbar'a vb. aktarın.
   NOT: Basınç 1 H ve ^{15 N}kimyasal kaymaların düzgün olmayan bir kaymasına neden olduğundan, omurga atamasını bir spektrumdan diğerine kopyalamayın. El ile ayarlayın.
2. Sparky menüsünde, Tepe > Tepe Listesi 'ne (lt)tıklayın. Tepe Listesi penceresinde, Seçenekler'i tıklatın ve hem Frekansları (ppm) hem de Veri Yüksekliğinigörüntüleme seçeneğini belirleyin. Her spektrum için elde edilen listeyi kaydedin.
3. Eğri sığdırma yazılımında, X ekseni değişkeni olarak basınç değerlerine (çubukta) ve Y ekseni değişkeni olarak yoğunluğa sahip olmak için çapraz geçiş kimliğini ve tepe yoğunluğu değerlerini kopyalayın.
4. Tam veya neredeyse tam (%>80) açılma gözlenirse, basit bir iki durumlu model kullanarak, açıldıktan sonra serbest enerji ve hacim değişimini çıkarmak için bireysel tepe yoğunluğu profillerine uyun:
   Eş. 1
   Burada, "I" belirli bir basınç p'de bir çaprazlamanın gözlemlenen yoğunluğudur ve I_F, aynı çapraz el çarpının tamamen katlanmış bir durumda yoğunluğudur. R gaz sabitidir, T mutlak sıcaklıktır, ΔG_U⁰ atmosferik basınçta p_{0 (1} bar) açılmış ve katlanmış durumlar arasındaki standart Gibbs serbest enerji farkı ve ΔV_u açılmadan sonra hacim değişimi. Çubukta p basıncı ve kelvin, R = 1.987 cal/K sıcaklıkta, ΔG_U⁰ cal/mol'da ve ΔV_U cal/mol/bar'dadır. Fit'ten elde edilen ΔV_U değerlerini mL/mol'a dönüştürmek için 41,84 ile çarpın. Burada, tüm parametreler açılma reaksiyonu ile ilgili olarak ifade edilir, ancak kolayca katlanır reaksiyon parametrelerine dönüştürülebilir (ΔG_U0 =^-ΔG _F⁰ ve ΔV_U = -ΔV_F).

4. Kimyasal kayma değişikliklerinin analizi

1. Yazılımdaki sütunları, basınç noktalarını değişken ve Sparky listelerinden Y ekseni olarak çıkarılan ¹H kimyasal kaydırmaları olacak şekilde düzenleyin.
2. ¹H kimyasal kaymalarının basınç bağımlılığını basit bir ikinci dereceden denkleme sığdırın:
   δ(p) = δ₀(p₀) + B₁(p-p₀) + B₂ (p-p₀)² Ayr.
   Burada, δ (p) belirli bir basınç p ve δ ⁰(p₀₎bir çaprazın ölçülen₁H kimyasal ^{kayması, 1}barda kaydedilen referans spektrumunda aynı çaprazın 1 H kimyasal kaymasıdır. B₁ ve B_2, sırasıyla ppm/bar ve ppm/bar²ile ifade edilen birinci ve ikinci derece parametreleri temsil eder.

Burada açıklanan protokol, 2,5 kbar aralığında (%>90) neredeyse tamamen açılan hnRNPA1'in (kalıntılar 95-106) ikinci RNA tanıma motifi olan RRM2'nin basınç bağımlılığını araştırmak için kullanılmıştır. 1 H-15N spektrumları 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1.5 kbar, 2 kbar ve 2.5 kbar 'da toplanarak toplandırıldı (Şekil 2). Yerel çapraz uçların hiçbiri 2,5 kbar'daki gürültü seviyesinin üzerinde görünmediği için, karşılık gelen tüm kalıntılara bu basınçta 0 yoğunluk değeri atfedildi (Şekil 3A). Açılan reaksiyonla ilişkili standart Gibbs serbest enerji (ΔG U0)ve hacimde (ΔVU)karşılık gelen değişiklikleri elde etmek içinDenklem 1'e (Eş. 1) göre toplam 45 bireysel basınç yoğunluğu profili yerleştirilmiştir (Şekil 3A). Hesaplanan ΔVU değerleri -41 ila -88 mL/mol ve ΔGU0 arasında 1.8-3.3 kcal/mol arasında değişmektedir. Etki alanı yapısında (pdb 1U1R) eşlendiğinde, en büyük hacim değişikliği büyüklüğüne sahip kalıntıların etki alanı yapısal çekirdeğinde (kırmızı, Şekil 3B'de)bulunduğu görülürken, hacim değişiminin en küçük büyüklüğüne sahip olanlar esas olarak β iplikçiklerini 2 ve 3'e bağlayan döngüde ve β-strand 4'ü C terminali sarmalına (yeşil olarak) bağlayan döngüde bulunur. Şekil 3B). Katlanmış durum topluluğunun sıkıştırılabilirlik ve konformasyonsal heterojenlik derecesini araştırmak için yerel omurga 1H kimyasal kaymalarının basınç bağımlılığı da analiz edildi. 1 H kimyasal kaymaların ayrı profilleri, meydana özgü doğrusal (B1)ve doğrusal olmayan (B2)katsayıları çıkarmak için Eq. 2 kullanılarak monte edilmiştir (Şekil 3C). En büyük doğrusal olmayan katsayılara sahip kalıntılar çoğunlukla etki alanının yapısal çekirdeğinde bulundu (sarı, Şekil 3D), en küçük doğrusal olmayan katsayılara sahip kalıntılar ise çoğunlukla farklı yapısal motifleri birbirine bağlayan döngüler içinde bulundu (mavi, Şekil 3D).

Şekil 1: Spektrometreye yüksek basınçlı hücre montajı ve montajı. (A-D) Tam yüksek basınçlı hücre montajı bir zirkonya tüpü, tek kullanımlık bir O-halkası, hücre tabanı (A,B) gerektirir. Tüp, tabanı hücreye(C,D)sıkarak bağlama hattına bağlanır. Daha düşük basınçta sızıntıları önlemek için 14,7 Nm tork gereklidir. (E) Xtreme-60 Şırıning pompasına bağlama hattı üzerinden bağlanan zirkonya tüpü, normal numune oturma pozisyonuna ulaşana kadar spektrometreye sokulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: HnRNPA1 RRM2 etki alanının basınç altında açılma. 1H-15N HSQC spektrumu (A) 1 bar, (B) 1.000 bar, (C) 1.500 bar, (D) ve 2.500 bar baskı altında RRM2 alanının tamamen açıldığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: RRM2 pik yoğunluğunun analizi ve 1H kimyasal basınç bağımlılığını kaydırır. (A) RRM2 için 1 ila 2.000 bar arasında kaydedilen temsili tepe yoğunluğu profilleri. Katı çizgiler, açılma reaksiyonla ilişkili ilgili standart serbest enerji ve hacim değişikliklerini hesaplamak için Eq. 1 kullanılarak elde edilen uyumu temsil eder. (B) En büyük ölçülen ΔVU büyüklüğüne sahip kalıntıların ilk %'i RRM2 referans yapısı (pdb 1U1R) üzerindeki kırmızı kürelerle vurgulanır. En küçük ΔVU büyüklüğüne sahip kalıntılar yeşil renkte gösterilir. (C) RRM2 için 1bar ile 2.000 bar arasında ölçülen 1 H kimyasal kaymanın temsili değişiklikleri. Düz çizgiler, doğrusal (B1)ve doğrusal olmayan (B2)basınç katsayılarını hesaplamak için Eq. 2'ye uygunluğu temsil eder. (D) En büyük B 2 katsayısına sahip kalıntıların ilk%'i sarı, en küçük B2 katsayısı olanlar ise mavi renkte gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tüm yazarlar makaleyi okudu ve onayladı. Çıkar çatışması ilan değiller.