Method Article

İnsan Tümör Hücrelerinde ve Tümör-ksinografted Farelerde Makropinositoz Aracılı ATP İçselleştirme için Floresan Mikroskopi

DOI:

10.3791/62768

⸱

June 30th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ohio University, 2Molecular and Cellular Biology Program, Ohio University, 3Neuroscience Program, Ohio University, 4Edison Biotechnology Institute, Ohio University, 5Translational Biomedical Sciences Program, Ohio University, 6Honors Tutorial College, Ohio University, 7Department of Biomedical Sciences, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek hücresel çözünürlüğe sahip bir ATP taşıyıcısı olan nonhidrolize floresan adenozin trifosfatın (ATP) içselleştirilmesini görselleştirmek için tekrarlanabilir bir yöntem geliştirdik. Yöntemimizi bağımsız in vitro ve in vivo tahlil-insan tümör hücre hatları ve insan tümör dokusu ile ksinografted immün yetmezlikli fareler kullanarak doğruladık.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı ATP (eATP) de dahil olmak üzere adenozin trifosfatın (ATP) ilaç direnci, epitel-mezenkimal geçiş (EMT) ve metastaz gibi tümöregenezin çeşitli yönlerinde önemli roller oynadığı gösterilmiştir. İntratümoral eATP, konsantrasyonda normal dokulara göre 103 ila10 kat daha yüksektir. eATP, EMT indüksiyonu için pürinerjik sinyali etkinleştirmek için bir haberci olarak işlev görmekle birlikte, çok çeşitli biyolojik işlevleri yerine getirmek için belirli bir endositoz türü olan upregulated makropinositoz yoluyla kanser hücreleri tarafından içselleştirilir. Bu işlevler arasında ATP gerektiren biyokimyasal reaksiyonlara enerji sağlamak, sinyal transdüksiyon sırasında fosfat gruplarını bağışlamak ve transkripsiyonel bir kofaktör olarak gen ekspresyonunu kolaylaştırmak veya hızlandırmak saymaktadır. ATP hazır ve kanser ve diğer alanlardaki çalışmaları şüphesiz artacaktır. Bununla birlikte, eATP çalışması erken bir aşamada kalır ve eATP ve içselleştirilmiş hücre içi ATP tarafından oynanan önemli ve çok yönlü faaliyetler tam olarak çözülmeden çözülmemiş sorular cevapsız kalır.

Bu yazarların laboratuvarlarının bu erken eATP çalışmalarına katkıları arasında, eATP içselleştirme sürecini izlemek ve karakterize etmek için makropinositoz ve endositoz izleyicilerinin yanı sıra çeşitli endositoz inhibitörleri olarak hizmet veren yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı floresan dekstrans ile birlikte hidrolize edilemeyen floresan ATP'nin mikroskobik görüntülemesi yer almaktadır. Bu görüntüleme yöntemi tümör hücre hatlarına ve insan kanseri tümörleri ile ksinografe edilmiş immün yetmez farelere, eATP içselleştirme in vitro ve in vivoincelemek için uygulanmıştır. Bu makalede, makropinositoz-/endositoz aracılı eATP içselleştirme testlerinin farklı sistemlerde başarıyla yapılabilmesi için test koşullarının değiştirilmesi ve ince ayarlanmasına vurgu yaparak bu in vitro ve in vivo protokoller açıklanmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İntratümoral hücre dışı (yani) besinlerin fırsatçı alımı son zamanlarda kanser metabolizması için önemli bir ayırt edici işaret olarak adlandırılmıştır1. Bu önemli besinlerden biri ATP'dir, çünkü ieATP konsantrasyonu normal dokularda bulunandan 103 ve10 4 kat daha yüksektir, birkaç yüz μM ila düşük mM 2,3,4,5aralığındadır. Önemli bir enerji ve sinyal molekülü olarak ATP, kanserli ve sağlıklı hücrelerde hücresel metabolizmada merkezi bir rol oynar6,7,8. Hücre dışı ATP sadece kanser hücresi büyümesinde yer almaz, aynı zamanda ilaç direncini de teşvik eder9. Atp'nin hidrotropik aktivite gibi daha önce tanınmayan işlevleri yakın zamanda tanımlanmıştır, böylece ALZHEIMER10gibi hastalıklara ATP katılımını bu işe bulaşmıştır. Gerçekten de, ATP ve kanser hücrelerindeki, sağlıklı hücrelerdeki ve diğer hastalıklı hücrelerdeki işlevlerini anlamamız tamamlanmaktan uzak görünüyor. Bununla birlikte, ATP'nin kararsızlığı ve hücrelerdeki yüksek ciro oranları nedeniyle, ATP'nin hücre zarı boyunca ve hücre içine hareketini izlemek teknik olarak zordur.

Bu sorunu gidermek ve bu araştırma alanının ihtiyacını gidermek için, hem in vitro hem de in vivo11 ,12'de, ATP'nin içselleştirilmesini görselleştirmek ve içselleştirilmiş ATP'nin hücre içi mekansal lokalizasyonunu gözlemlemek için sulandırılamaz floresan ATP'nin (NHF-ATP)(Şekil1)taşıyıcı olarak kullanıldığı bir yöntem geliştirilmiştir. . NHF-ATP'nin, hem kanser hücre hatlarında hem de immün yetmez farelerde ksinografe edilen insan tümör dokusunda hayvan hücre zarları boyunca ATP hareketini araştırmak için endojen ATP'nin yerini11,12'ye koyduğu gösterilmiştir. Ayrıca, hücrelere makropinositoz inhibitörlerinin uygulanması eATP içselleştirmesini engelledi, eATP'nin hücre içi alımının makropinositotik bir mekanizma içerdiğini düşündürdü9,11,12. Bu protokol, hücreye özgü proteinlere karşı immünobaslı kolabelingine ve böylece hangi hücre tipinin NHF-ATP'yi içselleştirdiğine izin veriyor. In vivo tümör ksinograftları ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak, NHF-ATP doku örneğinde ve hatta tek bir hücre içinde mekansal olarak görselleştirilebilir. Bu yöntemler ayrıca hücresel alım yüzdesi, makropinositotik vezikül sayısı ve içselleştirme kinetiği gibi nicel analize izin sağlar. Bu makalede, NHF-ATP'nin, tek başına veya endositoz-izleyici floresan dekstrans13 , 14,15,16ile birlikte çalışarak, hücrelerdeki içselleştirmeyi takiben ATP'nin içselleştirmesini ve hücre içi lokalizasyonunu incelemek için farklı deneysel ortamlarda nasıl kullanılabileceği ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

figure-introduction-1
Şekil 1: Yüksek moleküler ağırlık floresan dektran etiketli nonhidrolize floresan ATP ve tetrametrinrodamin yapıları. (A) NHF-ATP yapısı. (B) HMWFD'nin şematik gösterimi. Kısaltmalar: ATP = adenozin trifosfat; NHF-ATP = sulanamayan floresan ATP; TMR = tetrametilrhodamin; HMWFD = yüksek moleküler ağırlıklı floresan dektran. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada bildirilen tüm prosedürler Ohio Üniversitesi'nin IACUC ve NIH'ye uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Sulandırılamaz floresan ATP (NHF-ATP) ve dekstrans seçimi

  1. Florofor konjuge NHF-ATP (Şekil 1A) ve endositoz izleyiciler seçin, yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı floresan dekstrans (TMR-HMWFD ve TMR-LMWFD) (Şekil 1B), tercih edilen emisyon dalga boylarına (örneğin, uygun filtrelerle donatılmış görüntüleme sistemi) ve çalışılacak spesifik endositoz sürecine dayanmaktadır.

2. ATP lokalizasyon çalışmaları, in vitro (Şekil 2)

figure-protocol-1
Şekil 2: ATP içselleştirmesini incelemek için in vitro prosedür. Floresan mikroskopi kullanılarak kültürlü kanser hücrelerinde hücre dışı ATP'nin içselleştirilmesini görselleştirmek için protokolün şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Hücre kültürü ve hücrelerin hazırlanması
    NOT: Doku kültürü başlığında steril koşullar altında hücre kültürünü gerçekleştirin.
    1. (v/v) fetal sığır serumu (FBS) ve %1 (v/v) penisilin/streptomisin (bundan böyle D olarak anılacaktır) içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) hazırını hazırlayınMEM/FBS), steril fosfat tamponlu salin (PBS) ve %0,25 tripsin/etileniaminetetraasetik asit (EDTA), 37 °C su banyosunda.
    2. DMEM/FBS'deki insan kanser hücrelerini 100 mm'lik doku kültürü çanasında kültür edin. %5 CO2 atmosferi ile hücreleri 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatörde sakla.
    3. Hücreler birleştiğinde, önce kültür ortamını çıkararak hücreleri geçiştirin. Ardından, yemeği 5 mL steril PBS ile durulayın, PBS'yi çıkarın ve% 0.25 tripsin 3 mL ekleyin. 5 dakika boyunca% 5 CO2 atmosferde 37 ° C'de kuluçkaya yaslanın.
    4. Çanağı alın, ardından trypnization durdurmak için 6 mL DMEM / FBS ekleyin. Süspansiyondaki hücreleri 15 mL konik bir tüpe ve hücreleri peletmek için 5 dakika boyunca 800 × g'da santrifüje aktarın.
    5. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı epire edin ve hücre peletini pipetleme ile yeniden kullanmak için 10 mL DMEM /FBS kullanın.
    6. Hemositometre kullanarak hücre yoğunluğunu ve canlılığını sayın. Hücre süspansiyonu ~7,5 × 104 hücre/mL yoğunluğa seyreltmek için DMEM/FBS kullanın.
  2. Kapak örtülerinin ve tohumlama hücrelerinin hazırlanması
    1. 12 mm kapakları% 70 etanol ile yıkayın ve hassas görev mendilleriyle dikkatlice silin. Kapakları ve bir çift asayı otomatik kaplayarak sterilize edin.
    2. Bir doku kültürü başlığında, 24 kuyulu bir doku kültürü plakasının her kuyusuna bir kapak parçası yerleştirmek için tokmaklar kullanın.
      NOT: Daha sonra, hücreli kapak, görüntüleme için doğrudan bir mikroskop slaydına monte edilecektir.
    3. Hücre süspansiyonunun 300 μL'lik kısmını (DMEM/FBS'deki hücreler), kuyu başına ~2,5 × 104 hücrelik bir tohumlama yoğunluğunda sterilize edilmiş kapakları içeren 24 kuyu plakasına dağıtın. %5 CO2 akışı ile 37 °C'de steril koşullarda kuluçkaya yaslanın.
  3. Hücrelerin açlığı
    1. Tohumlamadan yirmi dört saat sonra, DMEM /FBS'yi her kuyudan çıkarın. Hücre dışı besin maddelerinin alınmasına neden olmak için hücreleri 15-18 saat serum açlığı yapmak için her kuyuya hemen 300 μL önceden ısıtılan serumsuz DMEM ekleyin.
      NOT: 15-18 saat açlık süresi kritik bir parametredir.
  4. NHF-ATP ve HMWFD/LMWFD çözümlerinin hazırlanması
    1. Yüksek moleküler ağırlıklı (70 kDa) floresan TMR-dekstran (TMR-HMWFD, 1 mg/mL), makropinozomları görselleştirmek için bir izleyici veya 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde serumsuz DMEM'de NHF-ATP (10 μmol/L) tartmak için analitik bir terazi kullanın. Işıktan korunan tüpleri 15 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
    2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj. Berrak süpernatantı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice aktarın, çözünmeyen kristalleri çıkarmak için herhangi bir pelet veya döküntüğü bozulmadan bırakın.
    3. 2.4.1 adımındaki çözümleri her kuyudaki hücrelere ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: HMWFD ve NHF-ATP çözümleri hücrelerle birlikte inkübasyon için karıştırılacaksa, her iki çözeltiyi de son konsantrasyonların 2 katı kadar hazırlayın. Çözümler daha sonra 1:1 oranında karıştırılarak son doğru çalışma konsantrasyonlarına ulaşılacaktır. Reaktifler ışığa duyarlı olduğundan ışıktan kaçının.
  5. Hücrelerin tedavisi ve fiksasyon
    1. 24 kuyulu taze bir tabakta, beş kuyunun her birine 500 μL önceden ısıtilmiş PBS dağıtın.
    2. Hücre inkübasyonundan sonra, her kapak kapağının toparlamalarını dikkatlice alın. Her kapak kapağını 500 μL önceden ısıtılmış PBS'ye batırarak durulayın. PBS dolu beş kuyuyu kullanarak beş kez tekrarlayın.
      NOT: Kapaklardaki hücrelerin nazik bir şekilde yıkanması bu deneyin başarısı için kritik öneme sahiptir.
    3. Son PBS yıkama işleminden sonra, ekstra PBS'yi emmek için hassas bir görev mendiline kapak kapağına dokunun ve kapak sıvısını hemen 24 kuyulu bir plakaya önceden yüklenmiş% 3,7 formaldehit soğuğa (4 °C) aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika sabitlayın.
    4. Hücreler sabitlenirken, mikroskop ön temizliği % 70 etanol ile kayar. Kapakları kuyulardan çıkarın ve kapak her kapak için 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) içeren 5 μL sulu montaj ortamını kullanarak slaytlara monte edin. Fazla PBS'i bir kağıt havlu veya hassas bir görev mendili ile hafifçe lekeleyin.
  6. Floresan mikroskopi ve görüntü alımı
    1. Yukarıdaki adımlardan iki ila 24 saat sonra, bir epifluoresans görüntüleme sistemi ve veri toplama yazılımı kullanarak hücrelerin görüntülerini yakalayın ve HMWFD ve / veya NHF-ATP'yi içselleştirdi.
      NOT: Bu alt bölümde, epifluoresans görüntüleme özelliği ve Nikon NIS Elements yazılımı ile donatılmış bir Nikon NiU mikroskobu kullanarak görüntü edinme adımları açıklanmaktadır. Bununla birlikte, diğer karşılaştırılabilir görüntüleme sistemleri ve alım yazılımları kullanılabilir. Üreticinin kullanım yönergelerini izleyin.
      1. Slaytı dürbün modunda dik bir epifluoresans mikroskobu sahnesine yerleştirin. Görüntüleme programına erişin.
      2. 10x hedefini seçin, odağı tanımlamak için sahneyi ayarlayın ve ilgi alanlarını tanımlamak için slaydı soldan sağa serpantin bir şekilde tarayın.
        NOT: İlgi alanlarının belirlenmesi hücre tipleri arasında değişecektir, bazı hücre hatları /kanser tipleri çeşitli ve farklı derecelerde TMR-HMWFD ve/veya NHF-ATP alımı sergiler.
      3. 40x hedefini seçin ve mikroskop üzerindeki düğmeyi kullanarak dürbün modundan görüntü yakalama moduna geçin.
      4. Görüntüleri görüntülemek ve daha sonra elde etmek için görüntüleme programındaki Canlı Kalite simgesine tıklayın.
      5. Ek Açıklamalar ve Ölçümler araç çubuğundaki OC Paneli'ni kullanarak, her filtre küpü veya floresan kanalı için pozlama parametrelerini tanımlayın.
        NOT: Sinyal yoğunlukları farklı olduğundan, her kanal için uygun pozlama süresini seçin. Örneğin, DAPI için 200 ms, HMWFD için 2 s ve NHF-ATP için 4 s pozlama süresi seçin. Pozlama süresi kanal başına belirlendikten sonra, farklı tedavi veya koşullara sahip tüm görüntüler için kanal başına bu ayarı kullanın.
      6. Pozlama ayarları her kanal için ayarlandıktan sonra, tanımlanan pozlama ayarlarına sahip 3 kanallı bir görüntü elde etmek için çok kanallı alma araç çubuğunu kullanın.
        NOT: Çok kanallı ND alma modu aracılığıyla görüntü alma, aynı görüş alanının her kanalı için otomatik görüntü yakalamayı sağlar. Deklanşör taret değişiklikleri arasında otomatik olarak kapatılsın.
      7. Alternatif olarak, filtre küpleri arasında geçiş yaparak, pozlama süresini ayarlayarak, her kanal için görüntü alımı arasında deklanşörü kapatarak/açarak ve tek tek kanallar için çekilen her görüntüyü üst üste koyarak çok kanallı görüntüleri manuel olarak elde edin.
        NOT: ND alma modu bu işlemi otomatikleştirir ve birleştirilmiş görüntüler sağlar.
      8. Görüntüyü .nd2 dosyası olarak kaydedin (Nikon Elements biçimi meta verileri kaydeder). Birleştirilmiş kanal görüntüsü ve tek tek kanal görüntüleri de dahil olmak üzere TIF dosyalarını kaydedin.
        NOT: TIF dosyaları yazılım uygulamalarının daha geniş bir seçim ile kullanılabilir.
      9. Kaydedilmiş bir .nd2 görüntü dosyasındaki NHF-ATP,TMR-HMWFD ve/veya TMR-LMWFD pozitif hücrelerin sayısını saymak için Çözümleme araç çubuğundaki Nesne Sayısı özelliğini kullanın.
      10. Verileri analiz programı aracılığıyla bir elektronik tabloya verin.
  7. Veri nicelemesi ve analizi
    1. Test edilen her durum için, görüntü niceleme için 50 ila 100 hücre. Veri analiz yazılımını (epifluoresans görüntüleme sistemine veya diğer yazılımlara dahil edilen yazılım) kullanarak, hücre başına ortalama floresan vesikül sayısını sayın ve hesaplayın.
    2. Nicel sonuçları analiz etmek için uygun istatistiksel yöntemleri kullanın.

3. Tümörlerde ATP içselleştirme, ex vivo (Şekil 3)

figure-protocol-2
Şekil 3: ATP içselleştirmesini incelemek için in vivo prosedür. Kriyoseksiyon ve floresan mikroskopi kullanılarak tümör ksinograftlarında hücre dışı ATP'nin içselleştirilmesini görselleştirmek için protokolün şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Hücre kültürlerinin implantasyona hazırlanması
    1. FBS ile desteklenmiş DMEM kullanarak 225 cm 2 şişede 37 °C'de kanser hücrelerini






Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüp bebek çalışması
NHF-ATP'nin hücre içi içselleştirilmesi, NHF-ATP'nin HMWFD veya LMWFD ile birlikte lokalizasyonu ile gösterilmiştir (Şekil 4). Bu prosedürün başarısı öncelikle uygun NHF-ATP ve dekstrans konsantrasyonlarının kullanılmasına ve uygun dekstrans tiplerinin (poli-lizin ve nötr) belirlenmesine dayanır. Örneğin, makropinositozu araştırmak için, HMWFD yalnızca makropinozomlar13 , 14 , 15,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sulandırılamaz ATP'nin hücresel içselleştirilmesinin mekansal, zamansal ve nicel analizi için bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem, teknik talimat ve temsili veriler sağladığımız çeşitli tümörojenik modeller de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sistemlerde kullanım için yaygın olarak uygulanabilir. In vivo ATP içselleştirme çalışmaları sırasında yorumlanabilir veriler elde etmek için (protokolün bölüm 4), intratümoral dektran enjeksiyonundan kriyo gömmeye kadar geçen deneysel süreyi sınırlamak önemlidir. Dok...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyoteksiyon Ohio Üniversitesi Histopatoloji Çekirdeği'nde yerinde gerçekleştirildi. Bu çalışma kısmen C Nielsen'e başlangıç fonları (Ohio Üniversitesi Sanat ve Bilim Koleji) tarafından desteklendi; NIH, X Chen'e R15 CA242177-01 ve RSAC ödülü verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A549 hücreleri, insan akciğer epiteli, karsinomUlusal Kanser EnstitüsüyokDaha ucuz kaynak
AsetonFisher ScientificS25904
Alüminyum folyo, ReynoldsGrainger6CHG6
Sulu Montaj Ortamı, ProLong Gold Solma Önleyici ReaktifThermoFisherP36930
ATP analoguJena BiosciencesNK-101
Otoklav, sterilizatörGrainger33ZZ40
Bıçaklar, kriyostat, yüksek profilliCL Sturkey, Inc.
Kaliperler, sürmeliGrainger4KU77
Hücre ortamı, Jambon Besin Karışımı F12, serumsuzMillipore Sigma51651C-1000ML
Santrifüj, sallanan kova rotoru ile soğutulmuşEppendorf5810R
KloroformAcros Organics423555000
Konik tüp, 15 mLVWR21008-216
Konik tüp, 50 mLVWR21008-242
Lamel, cam, 12 mmCorning2975-245
Kriyostat, Leica CM1950Leica BiosystemsCM1950
Hassas görev mendili, Kim MendilKimberly-Clark34155
Dekstran, Lizin sabitlenebilir, Yüksek Moleküler Ağırlık (HMW)InvitrogenD1818MW = 70.000, Tetrametilrodamin
Dekstran, Nötr, Yüksek Moleküler Ağırlıklı (HMW)İnvitrojenD1819
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), serumsuzFisher Scientific11885076
Kuru buzYerel teslimatÖzel sipariş
Epifloresan görüntüleme sistemi, Nikon NiU ve Nikon NIS Elements edinme yazılımıNikonÖzel sipariş
EtanolFisher ScientificBP2818-4
Fetal sığır serumu (FBS)ThermoFisher16000044
Forseps, Dumont # 7, kavisliGüzel Bilim Araçları11274-20
Forseps, Dumont # 5, düzGüzel Bilim Araçları11254-20
Eldivenler (küçük, orta, büyük)MicroflexN191, N192, N193
Eldivenler, MAPA Temp-Ice 700 Termal (kuru buzla çalışmak için)Fisher Scientific19-046-563
HemositometreDaiggerEF16034F EA
İnkübatör, hücre kültürüEppendorfGalaxy 170 S
Etiketleme bandıFisher Scientific159015R
İşaretleme kalemi, Sharpie (ultra ince)Zımba
Fareler, immün yetmezlik (Nu/J)Jackson Laboratory2019
Mikrosantrifüj, accuSpin Micro17Fisher Scientific13-100-675
Mikrosantrifüj tüpleri, Eppendorf tüpleri (1.5 mL)AxygenMCT-150-C
Mikroskop slayt kutusuFisher Scientific50-751-4983
İğne, 27 gaugeBecton-Dickinson752 0071
Boya FırçasıGrainger39AL12
Kağıt havluZımba33550
ParaformaldehitAcros Organics416785000
Penisilin / StreptomisinGibco15140122
Delikli kaşık, 15 mm çap, 135 mm uzunlukRoboz Surgical Instrument Co.RS-6162
Fosfat tamponlu salin (PBS)Fisher ScientificBP3991
Pipet uçları (10 μ L)Fisher Scientific02-707-438
Pipet uçları (200 μ L)Fisher Scientific02-707-411
Pipet uçları (1000 μ L)Fisher Scientific02-707-403
Pipetler, serolojik (10 mL)VWR89130-910
Pippetor, Gilson P2DaiggerEF9930A
Pipetleyici Başlangıç Kiti, Gilson (2-10 & mu; L, 20-200 μ L, 200-1000 μ L)DaiggerEF9931A
Platform çalkalayıcı - orbital, tezgah üstüCole-ParmerEW-51710-23
Pozitif yüklü mikroskop slaytları, SuperfrostFisher Scientific12-550-15
Neşter, boyut 10, Surgical Design, Inc.Fisher Scientific22-079-707
Makas, cerrahi - keskin, kavisliGüzel Bilim Araçları14005-12
Görüntü analizi için yazılım, Nikon ElementsNikonÖzel sipariş
Görüntü analizi yazılımı, ImageJ (FIJI)National Institutes of Healthn/aÇevrimiçi indirin (ücretsiz)
Numune diski 30 mm (ayna tutucu), kriyostat aksesuarıLeica Biosystems14047740044
Boyama tepsisi, 245 mm BioAssay KabıCorning431111
Şırıngası, 1 ccBecton-Dickinson309623
Bandı, laboratuvar, 19 mm genişlikFisher Scientific15-901-5R
ZamanlayıcıFisher Scientific14-649-17
Doku kültürü kabı, 100 x 15 mm çapFisher Scientific08-757-100D
Doku kültürü şişesi, 225 cm2ThermoFisher159933
Doku kültürü plakası, 24 oyukluBecton-Dickinson353226
Doku gömme kalıbı, paslanmaz çelikDoku Tek4161
Doku Dondurma Ortamı, Optimum Kesme Sıcaklığı (OCT)Fisher Scientific4585
Tripsin-EDTA (etilendiamintetraasetik asit), %0,25Gibco25200072
Su banyosu, Precision GP 2SThermoFisherTSGP2S
DT554550642736

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
  2. Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008(2008).
  3. Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101(2013).
  4. Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
  5. Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
  6. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  7. Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).
  8. Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
  9. Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
  10. Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
  11. Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
  12. Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
  13. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  14. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  15. Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
  16. Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
  17. Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
  18. Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
  19. Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
  20. Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
  21. Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
  22. Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
  23. Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
  24. Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154(2007).
  25. Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyATP InternalizationMacropinocytosisHuman Tumor CellsTumor Xenograft MiceExtracellular ATPEndocytosis TracersFluorescent DextranEpifluorescence ImagingCryosectioning Procedure

Related Articles