Yöntem makalesi

Meme Kanseri Araştırmaları için Potansiyel Fonksiyonel In vitro Model Olarak Meme Epitel ve Endotel Hücre Sferoidleri

DOI:

10.3791/62940

⸱

12 Temmuz 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, 2Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, 3Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meme epitel hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki çapraz konuşma, meme kanserinin ilerlemesine, tümör büyümesine ve metastaz yapmasına önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu çalışmada meme kanseri hücrelerinden vasküler ve/veya lenfatik endotel hücreleri ile birlikte sferoidler yapılmış ve meme kanseri araştırmaları için in vitro sistem olarak uygulanabilirliklerini ortaya koymaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meme kanseri kadınlarda mortalitenin önde gelen nedenidir. Meme kanseri hücrelerinin büyümesi ve sonraki metastazları ilerlemesi için önemli bir faktördür. McF-7 hücreleri gibi meme kanseri hücrelerinin monokültürleri kullanılarak meme kanseri büyümesini teşvik eden mekanizmalar yoğun bir şekilde çalışılmış olsa da tümör büyümesinde yakından yer alan damar ve lenfatik endotel hücreleri gibi diğer hücre tiplerinin katkısı derinlemesine araştırılmamıştır. Hücre-hücre etkileşimi tümör büyümesinde ve ilerlemesinde kilit rol oynar. Neoangiogenez veya damarların gelişimi tümör büyümesi için gereklidir, lenfatik sistem ise kanser hücre göçü ve sonraki metastaz için bir portal görevi görür. Son çalışmalar, vasküler ve lenfatik endotel hücrelerinin kanser hücre büyümesini önemli ölçüde etkileyebileceğine dair kanıtlar sürmektedir. Bu gözlemler, meme kanseri büyüme süreçlerini daha gerçekçi bir şekilde yansıtacak in vitro modeller geliştirmeye ihtiyaç olduğunu ima ediyor vivo. Ayrıca, hayvan araştırmalarındaki kısıtlamalar, ilgili mekanizmaları daha iyi aydınlatmak için ex vivo modellerinin geliştirilmesini gerektirir.

Bu makalede hem meme kanseri hücrelerinden (östrojen reseptörü pozitif MCF-7 hücreleri) hem de vasküler ve/veya lenfatik endotel hücrelerinden oluşan meme kanseri sferoidlerinin gelişimi açıklanmaktadır. Protokol, asılı damla (altın standart ve ucuz) ve 96 kuyulu U-alt plakalar (pahalı) olmak üzere iki farklı yaklaşım kullanarak çift hücreli küreseller oluşturmada ayrıntılı bir adım adım yaklaşımı açıklar. Mikroskobik boyutlandırma ve ölü ve canlı hücre boyama kullanarak canlılığı değerlendirerek büyümeyi izlemek için oluşturulan küresellerin hassas bir şekilde nasıl toplanacağınız için derinlemesine talimatlar sağlanmıştır. Ayrıca, sferoidlerdeki büyüme modellerini ayırt etmek için büyümeye özgü antikorlarla kesitleme ve boyama için küreseloidleri düzeltme prosedürleri deliner. Ek olarak, transfected hücreli sferoidlerin hazırlanmasına yönelik ayrıntılar ve moleküler analiz için RNA çıkarma yöntemleri sağlanmaktadır. Sonuç olarak, bu makale meme kanseri araştırmaları için çok hücreli sferoidler hazırlamak için derinlemesine talimatlar sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanların deneyler için kullanılmasının sınırlamaları vardır. Hayvan çalışmaları insanlarda hastalığın ilerlemesini doğru bir şekilde taklit edemez ve hayvanlar ve insanlar patojenlere aynı yanıtlara sahip değildir. Ayrıca, hayvan acılarına ve etik sorunlara yönelik endişeler nedeniyle hayvan deneylerindeki kısıtlamalar1,2 araştırma programlarını giderek kısıtlar. In vitro hayvanların kullanımını atlatmak için yaygın olarak geliştirilmiştir; ayrıca, insan hücrelerinin kullanımı in vitro patofizyolojik ve terapötik araştırma için daha uygun modeller. Konvansiyonel monolayer (2D) hücre kültürleri, insan dokularını bir dereceye kadar taklit ettikleri için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, 2B monokültürler insan organlarını taklit edemez ve 2B monokültürler orijinal organların karmaşık mikroçevresini simüle edemez ve in vivo durum3,4,5,6. Ek olarak, monolayer hücre kültürlerinde, ilaç tedavileri tüm hücreleri kolayca yok edebilir / zarar verebilir. Daha da önemlisi, bu sınırlamaların bazıları çok katmanlı üç boyutlu (3D) hücre kültürlerine geçerek aşılabilir7,8. Aslında, 3D kültür modellerinin birincil dokulardaki hücrelerin hücresel yapısını, düzenini ve işlevini daha iyi yansıttığı gösterilmiştir. Bu 3D kültürler, işlevsel bir organa benzer şekilde çeşitli hücre çizgileri kullanılarak oluşturulabilir. Gerçekten de, 3D kültürlerin iki modeli vardır. Bir model, kümeler oluşturan ve bunları kürelere (iskelesiz modeller) yeniden düzenlenen agrega hücrelerin küresellerini üretir. İkincisi, daha karmaşık bir yapıya sahip olan ve organların minyatür bir versiyonu olarak kabul edilen birden fazla organa özgü hücrenin kombinasyonlarından oluşan organoidleri verir.9,10. Bu nedenle, 3D kültür sistemleri birçok biyolojik ve klinik uygulama ile yenilikçi bir teknolojiyi temsil eder. Bu nedenle, sferoidler ve organoidler rejeneratif tıp, ilaç taraması ve toksikolojik çalışmalarla ilgili hastalık modelleme ve çalışmaları için çok sayıda uygulamaya sahiptir.6,11,12,13,14,15. 3D teknolojisinden türetilen kanserojen küreseller, ilgili hücre tiplerinin morfolojisini ve fenotipini yeniden oluşturmak, in vivo tümör mikroçevrİmİ ve tümör gelişimi sırasında çalışır durumda olan model hücre iletişimi ve sinyal yolları16,17,18. Ek olarak, kanser biyolojisi anlayışını geliştirmek için tümör sferoidleri/organoidleri, potansiyel bir hastaya özgü kanser önleyici tedaviyi (kişiselleştirilmiş) tanımlamak ve etkinliğini, toksisitesini ve uzun vadeli etkilerini değerlendirmek için de kullanılabilir.19,20,21,22. Küreseller, hücresel ve üç boyutlu doku mimarisini koruma yetenekleri, in vivo durumu ve hücre-hücre etkileşimleri. Bununla birlikte, damar / sistemik bileşen eksikliği, fonksiyonel bağışıklık veya sinir sistemi gibi bu sistemin sınırlamalarının da farkında olmak gerekir ve sistem hayvan modellerine kıyasla indirgemeci bir yaklaşımı temsil eder. Gerçekten de, hayvan modellerinin aksine, 3D yapılar bir insan vücudundaki biyolojinin sadece bir yaklaşıkını sağlar. 3D yönteminin sınırlamalarını anlamak, araştırmacıların bir organı daha büyük ölçekte daha iyi temsil eden küreseller üretmek için daha rafine ve geçerli süreçler tasarlamalarına yardımcı olabilir23,24,25.

Kanser dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanserdir26,27,28. Meme kanserinin karmaşık mikroçevresini taklit etmek için meme kanseri sferoidleri meme tümörlerinde, yani epitel hücrelerinde, endotel hücrelerinde, fibroblastlarda ve/veya bağışıklık hücrelerinde önemli rol oynayan hücreler kullanılarak kültürlenmelidir. Ayrıca, meme kanserini temsil eden bir sferoid için, kadın hormon reseptörlerinin (östrojen/ progesteron reseptörleri), hasta tümör histolojik durumunu koruma yeteneği ve tedaviye yanıtı taklit etme yeteneği de göz önünde bulundurulmalıdır. Çalışmalar, 3D ortak kültür sistemlerinin birincil doku in vivo'nunkinebenzer bir hücresel kuruluşa sahip olduğunu, uyaranlara gerçek zamanlı tepki verme yeteneğine sahip olduğunu ve fonksiyonel androjen reseptörlerine sahip olduğunu göstermiştir29,30,31,32. Bu nedenle, benzer bir yaklaşım bir meme tümörü in vitrotaklit yararlı olabilir. Mevcut protokolün amacı meme kanseri sferoidleri üretmek için yeni bir yöntem oluşturmaktır. Bu yöntem, bir tümör içindeki bu hücreler arasındaki etkileşimleri taklit eden veya yakından yansıtan bir model oluşturmak için östrojen reseptörü pozitif MCF-7 hücrelerini (epitel hücrelerinin ölümsüzleştirilmiş bir insan hücresi hattı) ve vasküler endotel hücrelerini (HUVEC'ler) veya lenfatik endotel hücrelerini (HMVEC-DNeo) kullanır. McF-7 (östrojene duyarlı) ve endotel hücreleri bu çalışmada sferoid geliştirmek için kullanılmış olsa da, meme tümörü kitlesinin ~%80'ini temsil eden fibroblastlar gibi diğer hücreler de gelecekte meme tümörünü daha iyi temsil etmek ve taklit etmek için birleştirilebilir.

Sferoid oluşturmak için aşağıdakiler gibi çeşitli yöntemler vardır: 1) yerçekimini kullanan asılı damlacık yöntemi33,34; 2) harici bir mıknatısa maruz kalan manyetik nanopartikülleri kullanan manyetik kaldırma yöntemi35ve 3) düşük ekli plakalarda tohumlama hücreleri tarafından gerçekleştirilen küresel mikro plaka yöntemi36,37. Sadece bir hücre tipi kullanan mevcut yöntemlere dayanarak, mevcut protokol, memekanseri tümörlerinin büyüme koşullarını daha iyi taklit etmek için epitel ve endotel hücreleri kullanılarak optimize edilmiştir38,39,40,41. Bu yöntem laboratuvarda düşük maliyetle ve minimum ekipman gereksinimi ile kolayca elde edilebilir. Laboratuvarın ihtiyacına/hedeflerine göre, sferoid oluşturmak ve bu sferoidlerden ilgili hücresel materyali kazanmak için farklı yaklaşımlar kullanılmıştır. Bu bağlamda, DNA, RNA veya protein analizi için, 3D sferoidler, sarkan damla yöntemi ile endotel ve epitel hücrelerinin birlikte kült ederek üretilir. Bununla birlikte, fonksiyonel çalışmalar için, örneğin, kısa müdahale (siRNA) transfeksiyon ve / veya hormon tedavisinden sonra hücre büyümesini izlemek için, küreseller U-alt plakaları kullanılarak üretilir.

Bu teknik protokolün amacı, 1) meme kanseri çok hücreli tip sferoidlerin oluşturulması, 2) histolojik lekelenme için örneklerin hazırlanması ve 3) RNA, DNA ve proteinlerin çıkarılması için hücrelerin toplanması için ayrıntılı bir adım adım açıklama sağlamaktır. Hem ucuz asma bırakma yöntemi hem de daha pahalı U-alt plakalar sferoid oluşturmak için kullanılır. Burada, hücre çoğalmasını, apoptoz ve epitel ve endotel hücrelerinin bir küresel hücre içinde dağılımını değerlendirmek için sferoidlerin kesit ve sonraki immünostaining için hazırlanması (sabitlenerek) için bir protokol sağlanmaktadır. Ayrıca, bu protokol ImageJ yazılımını kullanarak histolojik verilerin tam bir adım adım analizini gösterir. Biyolojik verilerin yorumlanması, deneyin türüne ve kullanılan antikorlara bağlı olarak değişir. Sabit sferoidlerin bölümlenerek yapılması ve daha sonra bölümlerin boyanma işlemi rutin bir patoloji laboratuvarı tarafından gerçekleştirildi (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre kültürü

NOT: Steril koşullar altında hücre kullanımı gerçekleştirin.

  1. İnsan Göbek Damarı Endotel Hücreleri (HUVEC' ler) alt kültürü
    1. 75 cm2 şişeyi kollajen (5 μg/cm2)(sıçan kuyruğu) ile gece boyunca (AÇIK) oda sıcaklığında (RT) veya 37 °C'de 2-3 saat kaplayın, suyla durulayın ve şişenin kurumasını bekleyin.
    2. Glutamin (1x = 2 mM), antibiyotik-antimikotik çözelti (AA; 100 μg/mL streptomisin) ile desteklenmiş büyüme ortamında (EBM-2, Endotel Bazal Orta-2) HUVEC'leri büyütün, 100 μg/mL penisilin ve 0.025 μg/mL amfoterisin B), LSGS (%2 v/v FCS, 1 μg/mL hidrokortizon, 10 ng/mL insan Epidermal Büyüme Faktörü, 3 ng/mL insan temel Fibroblast Büyüme Faktörü, Standart doku kültürü koşullarında (%37 °C, %5 CO2)10 μg/mL heparin) ve %10 FCS (Fetal Calf Serum). Hücreler% 70-% 80 birleştiğine ulaşana kadar ortamı her 2 günde bir değiştirin.
    3. Alt birleştiği kültürleri 5 mL HBSS ile yıkayın (Ca2+ ve Mg2+olmadan) ve 3 mL tripsin ekleyin (0.25% HBSS'de seyreltilir (Ca2+ ve Mg2+olmadan)).
      NOT: HBSS, PBS ile de değiştirilebilir.
    4. Hücreleri 37 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatırın (hücrelerin ayrılıp yuvarlanmadığını mikroskobik olarak kontrol edin) ve %10 FCS ortamının 6 mL'sini (DMEM-F12 veya EBM-2, %10 FCS) ekleyerek ayırma reaksiyonu durdurun.
    5. Hücre süspansiyonu RT'de 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj edin ve süpernatantı atın.
    6. Büyüme ortamındaki hücreleri askıya alın ve 75 cm2 şişe veya kültür yemeklerinde tohum.
  2. Michigan Kanser Vakfı-7 (MCF-7, insan meme adenokarsinom hücreleri) alt kültürü
    1. Büyüme ortamında insan meme kanseri hücre hatlarını 75 cm2 şişede yetiştirin (ticari glutamin (1x), antibiyotik-antimycotic çözelti (AA) ile desteklenmiş DMEM / F12 ortamı; 100 μg/mL streptomisin, 100 μg/mL penisilin ve 0.025 μg/mL amfoterisin B) ve %10 FCS standart doku kültürü koşullarında (37 °C, %5 CO2). Ortamı her 2-3 günde bir değiştirin.
    2. Alt iletken hücre kültürlerini (%70-%80 izdiham) 5 mL HBSS ile yıkayın (Ca2+ ve Mg2+olmadan) ve 3 mL tripsin ekleyin (3 mL tripsin (%0,5 HBSS'de seyreltilmiş (Ca2+ ve Mg2+olmadan) 5 dakika boyunca 37 °C'de (mikroskobik olarak hücrelerin ayrıldığını doğrulayın).
      NOT: HBSS, PBS ile de değiştirilebilir.
    3. Ayırma reaksiyonunun durdurulması için 8 mL%10 FCS ortamı ekleyin, RT'de 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin ve süpernatantı atın.
    4. Peletin büyüme ortamında ve plakada 75 cm2 şişe veya kültür yemeklerinde askıya alın.

2. Küresel oluşum

  1. Plaka 5 x 105 hücre/mL (HUVEC ve MCF-7) 3,5 cm yuvarlak bir yemek ve kültür 48 saat boyunca.
  2. Kaplamalı hücreleri 24 saat boyunca veya istenildiği gibi tedavi edin veya transfect edin.
  3. 96 kuyulu U-bottom plakada gerçekleştirilen isteğe bağlı adım: Hücreleri 1 mL HBSS (Ca2+ ve Mg2+ile yıkayın ve mavi bir boya (0,5 μg/ mL) kullanarak HUVEC'leri lekelendirin ve MCF-7 hücreleri, ilgili büyüme ortamında seyreltilmiş yeşil bir boya (0,5 μM) kullanarak 37 °C ve% 5 CO2 inkübatöre 30-40 dk.
  4. Hücreleri 1 mL HBSS ile yıkayın (Ca2+ ve Mg2+olmadan), her yuvarlak yemeğe 1 mL enzimatik dekaraktma reaktifi (HUVEC için% 0.25 trypsin ve MCF-7 için% 0.5 tripsin) ekleyin ve ardından hücreler ayrılana kadar 2-5 dakika kuluçkaya yatırın.
  5. Her hücre tipini 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüpte ayrı ayrı toplayın ve enzymatic reaksiyonu durdurmak için bir P1000 pipet kullanarak% 10 FCS ortamının 1 mL'sini ekleyin. Hücre süspansiyonlarını 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj edin.
  6. Süpernatantı dikkatlice emiş edin ve hücreleri 1 mL steroidsiz ortamda askıya alın (EBM-2, glutamin , antibiyotik-antimycotic, 0.4% FCS sf (kömür-soyulmuş)).
    NOT: Steroidsiz ortam normal büyüme ortamı ile değiştirilebilir.
  7. Toplam hücre sayısını belirlemek ve tedavi ortamının miktarını hesaplamak için 10 mL Seyreltici II ile seyreltilmiş her hücre süspansiyonunun 100 μL'sini kullanın (bkz. Malzeme Tablosu),glutamin, antibiyotik-antimycotic, %0.4 FCS sf, araç/Tedavi) hücre tipi başına 5 x 103 hücre/mL veya 3.4 x 105 hücre/mL hücre süspansiyonu elde etmek için gereklidir.
    1. Hücre sayısı
      1. Makineyi açın ve bir hücre sayacı şişesinde Seyreltici II çözümü ile İşlev ve Başlat düğmelerine (kurulum S3) basarak yıkayın.
      2. S4 kurulumını kullanın ve boşluğu taze Seyreltici II çözümüyle ölçmek için Başlat tuşuna basın.
      3. 10 mL Diluent II çözeltisinde 100 μL hücre süspansiyonu ile scintillation şişesini değiştirin ve örnekleri ölçün: S4'ün kurulumu ve Başlat 'abasın.
      4. Dijital ekranda mL başına hücre sayısına dikkat edin.
        NOT: Hücre sayımı diğer manuel veya otomatik sistemler kullanılarak da yapılabilir: Hemositometre ızgara hatları, ışık saçılım hücre sayma teknolojisi, elektrik empedansı, hücre boyama kullanan görüntüleme tabanlı sistemler, örneğin trypan mavisi.
    2. 96 kuyulu U-alt plakalar
      1. Her hücre süspansiyonunun 5 mL'sini hazırlayın (5 x10 3 hücre/mL) ve 1:1 oranında 10 mL'lik son bir hacim elde etmek için karıştırın.
      2. 96 kuyulu U-bottom plakalarının her kuyusuna 100 μL hücre süspansiyonu pipetlamak için manuel tekrarlayan pipet kullanın.
      3. Plakayı standart doku kültürü koşullarında bir inkübatöre yerleştirin ve 48 saat sonra küresel oluşumu kontrol edin.
      4. İsteğe bağlı adım: Floresan stereo mikroskop kullanarak küresellerin (40x) fotoğraflarını çekin.
        NOT: Bu yöntem 48 saat (alan 1-2 piksel2)sonra 96 küresel (bir küresel /kuyu) üretir ve genellikle büyüme çalışmaları için kullanılır.
    3. Asılı damla
      1. Hücre süspansiyonlarını (3,4 x 105 hücre/mL) 1:1 oranında karıştırarak 2 mL'lik son bir hacim elde edin.
      2. Hücre karışımını 10 cm Petri kabının ters kapağına 15 μL damla şeklinde tohumlamak için bir P20 pipet kullanın.
      3. Damlalarla kapağı ters çevirin ve damlaların buharlaşmasını önlemek için kabın altına 5 mL taban ortamı (EBM-2) ekleyin.
        NOT: Bu yöntem 48 saat sonra bir küresel/damla oluşturur. Damlaların birbirinden yeterince ayrı olduğundan emin olun, böylece kapağı değiştirirken birleşmezler. Gerekirse birden fazla 10 cm Petri kabı kullanın.

3. Küresel büyüme çalışması

  1. Plaka 100 μL HUVEC ve MCF-7 hücre karışımı (5 x10 2 hücre/kuyu) 96 kuyulu U-alt plakalarda ve inkübatöre yerleştirin.
  2. Kaplamadan 48 saat sonra, ters mikroskop (Parlak alan) ile küresel oluşumu kontrol edin. 96 saat kültürde fotoğraf çekin (tedavi başına en az altı resim, 40x).
  3. Bir görüntü işleme yazılımı kullanarak resimleri açın ve görüntüyü 300 piksel / inç'e işleyin ve görüntüyü bir tiff dosyası olarak kaydedin.
  4. ImageJ yazılımını indirin ve açın. Dosya seçeneğine tıklayın ve Aç'a gidin.
  5. İkili görüntüye (siyah beyaz) sahip olmak için ilgi alanlarını tekdüze bir şekilde doymuş siyah alanlara dönüştürün. Bunun için Görüntü seçeneğini belirleyin, 8 bit | yaz 'ıseçin. Şimdi, görüntü siyah beyaz.
  6. Küresellerin kenarlıklarını çizmek için Serbest Seçim Aracı'nı kullanın.
  7. İlgi alanını hesaplamak ve nesneyi veya ön plan piksellerini arka plan piksellerinden ayırmak için eşik işlevini kullanın: Görüntü seçeneğini belirleyin, Ayarla'yı seçin ve Eşik'i tıklatın.
  8. Şimdi bir Eşik açılır penceresi açılacaktır. Üst çubuk en düşük eşik değerini gösterir: değeri sıfır olarak ayarlayın. Alt çubuk maksimum eşik değerini gösterir: ilgi alanı tamamen kırmızı olana kadar çubuğu hareket ettinin.
    NOT: Renk kırmızı değilse, Eşik penceresinden Kırmızı'yı seçin.
  9. Analiz | Git Ölçümleri ayarlayın ve Alan ve Çevre 'yi seçin.
  10. İlgi alanını ölçmek için Çözümle seçeneğini belirleyin ve Parçacıkları Çözümle aracını kullanın. Parçacıkları Çözümle penceresinde, Boyut'u ölçecek şekilde ayarlayın (küresellerin boyutuna bağlı olarak 0,00003-Sonsuz veya 3-Sonsuz), Sonuçları Özetle ve Görüntüle'yi seçin. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
  11. Sonuçlar bir grafikte görünecektir. Verileri çözümlemek için ölçümleri bir elektronik tabloya kopyalayın.
    NOT: Alan toplam piksel sayısı olarak hesaplanır; hesaplama için Toplam Alanı'nı kullanın.

4. Küresel immünohistokimya çalışması

  1. Numune hazırlama
    1. HUVEC ve MCF-7 (5 x 103 hücre/kuyu) hücre karışımını HUVEC büyüme ortamında 96 kuyulu U-alt plakalarda 96 saat boyunca plakalayın.
    2. P200 μL pipet kesik ucu ile 1,5 mL'lik bir tüpe yaklaşık 50 küresel toplayın; yerçekimi ile tüpün dibine yerleşmelerine izin verin ve ardından süpernatant atın.
    3. Küreselleri 1 saat, RT için %4 PFA'nın 500 μL'si ile sabitle.
    4. Agarose tozunun tamamen çözünmesi ve yaklaşık 60 °C'ye kadar soğuması için 3-5 dakika boyunca manyetik karıştırıcılı bir sıcak plaka kullanarak PBS'de% 2 Nobel Agar çözeltisini kaynatın.
    5. PFA'yı bir P1000 pipetle çıkarın, küreselleri 500 μL PBS ile yıkayın ve tortulanmalarına izin verin. Üstnatant atın.
    6. Sferoidli 1,5 mL'lik tüpe dikkatlice pipet 600 μL agarose çözeltisi yerleştirin ve tüpü hemen 2 dakika boyunca 177 x g'da yatay rotorlu bir santrifüje yerleştirin.
    7. Fişi tüpten kolayca çıkarmak için agarose çözeltisinin ortasına kısa bir dize ekleyin.
    8. Agarose fişini buzda veya 4 °C'de katılaştırın. Peletten kurumasını önlemek için 1,5 mL'lik tüpe 500 μL PBS ekleyin.
      NOT: Numuneler sonraki dehidrasyon, parafin gömme, bölümleme, mikroskop slaytlarına transfer ve IHC boyama (Sophistolab tarafından gerçekleştirilir) için hazırdır.
  2. Görüntü alma ve işleme
    1. Stereomikroskop kullanarak küresel bölümlerin görüntülerini alın.
    2. Her örnek için .jpg dosyaları olarak üç resim kaydedin.
    3. ImageJ yazılımını açın. JPEG görüntüsünü açın, Dosya'ya tıklayın ve sonra Aç 'a tıklayın.
    4. Görüntü seçeneğinde Renk ve Renk Dekonvolüs'u seçin.
    5. Renk Deconvolution 1.7 penceresinde H DAB vektörlerini seçin ve üç görüntü görünür.
      NOT: Üç resim şunlardır: Renk 1 yalnızca Hematoksilin boyamayı (mavi/mor) ve Renk 2 yalnızca DAB boyamayı (kahverengi) temsil eder. İki boyama ile görüntü analizi için Renk 3 gerekli değildir.
    6. Renk 1 penceresini seçin ve Eşiği ayarlayın: Resim | Eşik 'i ayarlayın ve tıklatın. Eşik penceresi görüntülenir.
    7. Minimum eşik değerini sıfırda bırakın ve gerçek sinyali etkilemeden arka plan sinyalini kaldırmak için maksimum eşik değerini ayarlayın. Uygula 'yıtıklatın.
      1. Alan ölçümü
        1. Analiz Et 'itıklatın, Ölçü Ayarla 'yıseçin. Alan, Ortalama gri değerve Min ve Max gri değerini seçin ve onaylamak için Tamam'ı tıklatın.
        2. Çözümle seçeneğini kullanarak çekirdeğin boyutunu ölçün ve Ölç 'ü seçin.
          NOT: Sonuçlar penceresi görüntünün adını (Etiket), görüntünün boyutunu (Alan), IHC görüntüsünün ortalama piksel yoğunluğunu (Ortalama) ve minimum ve maksimum gri değerleri (Min, Max) verir. Hesaplama için Ortalama değerini kullanın.
        3. Renk 2 (ve çift boyama varsa Renk 3) penceresi için 4.2.6-4.7.1.2 adımlarını yineleyin.
      2. Hücre nicelemesi
        1. İşlem'e tıklayın, İkili seçeneğini belirleyin ve hücreleri ayırmak için Su Havzası'nı seçin.
        2. Analiz Et'e gidin ve Parçacıkları Analiz Et'e tıklayın. Parçacıkları Çözümle açılır penceresinde, hücrelerin boyutunu belirtilmeyen parçacıkları dışlayacak şekilde ayarlayın. Ardından, Göster seçeneğinde, açılan kutuya tıklayın ve Anahatlar 'ıseçin. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
        3. Renk 2 (ve çift boyama varsa Renk 3) penceresi için 4.2.6-4.2.7 ve hücre niceleme adımlarını (bölüm 4.2.7.2) yineleyin.
          NOT: Şimdi üç pencere görünecektir: 1) Özet sonuçlar (sayılan hücre sayısı, toplam alan, ortalama boyut, alan ve ortalama yüzdesi), 2) Sonuçlar (sayılan hücrelere dahil) ve 3) Çizim penceresi (sayılan hücrelerin resimli görüntüsü).

5. Küresellerde canlı / ölü boyama

  1. DMSO'da Calcein AM'nin 4 mM stok çözeltilerini (canlı hücreleri yeşil lekeler) ve DMSO'da 2 mM Ethidium homodimer (ölü hücreleri kırmızıya boyar) 1,5 mL tüplerde hazırlayın.
  2. EBM-2'de 1:50 seyreltilmiş Calcein ve Ethidium homodimer karışımının 10 μL / kuyu eklemek için gerekli çözelti miktarını hesaplayın.
  3. Boyama karışımını küresellere ekleyin ve plakayı 30-60 dk boyunca standart doku kültürü koşullarında inkübatöre yerleştirin.
  4. Floresan stereo mikroskobu kullanarak resimler (40x) alıp alın.

6. Küresel protein ve RNA izolasyonu

  1. Hücre süspansiyonlarını hücre tipi başına 3,4 x10 5 hücre/mL'de hazırlayın, 1:1 oranında karıştırın ve hücre karışımını 10 cm Petri kabının kapağına 15 μL damla şeklinde bir P20 pipet kullanarak tohumlayın. Kapağı ters çevirin ve 96 saat boyunca standart doku kültürü koşullarında inkübatöre yerleştirin.
  2. 5 mL steril polistiren pipetler kullanarak 15 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüpte küreselleri toplamak için 5-6 mL PBS kullanın.
    NOT: 15 mL konik tüp kullanmak da mümkündür.
  3. Sferoid süspansiyonu 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj edin ve ardından süpernatantı dikkatlice aspire edin.
  4. 500 μL tripsin (%100) ekleyin ve sferoidleri dağıtmak için 30 s için bir P1000 pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipet ekleyin ve bir hücre süspansiyonu elde edin.
  5. Trypsin'i % 10 FCS ortamıyla nötralize edin, tüpleri 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.
  6. Üreticinin protokolüne göre (DNA içermeyen RNA izolasyonu için özel kit), hücre peletini irdelemek için 300 μL RNA liziz tamponu kullanın.
    NOT: Lizis tamponu, RNA çıkarmak için doğrudan bozulmamış sferoidlere (trypsin adımı gerekmez) eklenebilir. Peletlenmiş küresellere 300 μL lizis tamponu ekleyin, tüpleri buza yerleştirin ve bir P200 pipet kullanarak 10 kez üçe katlayın. Daha sonra, RNA'yı yukarıdaki gibi izole edin. Matris paraziti nedeniyle RNA iyileşmesi düşükse küresel ayrışmaya ihtiyaç duyulabilir.
  7. Alternatif olarak, protein izolasyonu için 70 μL Lizis tamponu kullanın. Sonication ile 2-4 s için homojenize ve bir BCA Assay Kit kullanarak üreticinin protokolüne göre protein konsantrasyonunu belirlemek.
    NOT: Protein izolasyonu için, peletlenmiş sferoidler doğrudan lizis tamponunda ve ardından sonikasyonda lizize edilebilir. Batı lekesini gerçekleştirmek için 25 μg toplam protein kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitel ve endotel ko-kültürlerini kullanan küresel modeller, in vitro deneyler için meme tümörlerinin in vivo durumlarını yakından taklit etmek için gereklidir. Şekil 1'deki şema, meme kanseri epitel hücreleri ve vasküler veya lenfatik endotel hücreleri ile küreseller oluşturma protokolünü tasvir eder (Şekil 1). Her hücre tipi ayrı ayrı 3,5 cm yuvarlak bir tabakta tohumlanır ve büyüme uyarıcıları / inhibitörleri ile muamele edilir veya Lipofect...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2D hücre kültürleri ile karşılaştırıldığında, devrimci 3D küresel kültür teknolojisi, bir organın mikroçevresini, hücre-hücre etkileşimlerini ve ilaç yanıtlarını in vitroolarak yeniden oluşturmak için daha iyi ve daha güçlü bir araçtır. Bu, meme kanseri araştırmaları için çok hücreli (epitel ve endotel) hücre çizgilerinden sferoid oluşumunu tanımlayan ilk protokoldür. Bu protokol, sferoidlerin 5 güne kadar küresel 3D büyümesini sağlar ve parafin gömme, bölümleme ve histolojik lekelenmeden sonra küreseloidler inc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma Kanser Araştırma Vakfı / İsviçre Kanser Ligi hibesi KFS-4125-02-2017 RKD ve Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından EKJ'ye DK079307 hibesi ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 mm ve kez; 20 mm doku kültürü ile muamele edilmiş kültür kaplarıCorningCLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Doku Kültürü KabıFalcon353001
5 mL Serolojik Pipet, Polistiren, Ayrı Ayrı Paketlenmiş, SterilFalcon357543
Adobe PhotoshopSürüm: 13.0.1 (64- bit)
Antibiyotik Antimikotik Çözelti (100 kez;)Sigma-AldrichA5955
Calcein-Sigma-Aldrich17783
CD31 (farklılaşma kümesi 31)Cell Marque131M-95monoklonal fare ab klonu JC70
CellTracker Yeşil CMFDA (5-klorometilfloresein diaasetat)InvitrogenC7025
CK8/18 (sitokeratinler 8 ve 18)DBSMob189-05monoklonal fare ab, klon 5D3
CKX41 Ters MikroskopOlympus Life ScienceOlympus DP27 dijital kamera
Bölünmüş Kaspaz 3Hücre Sinyalizasyonu9661Lpoliklonal tavşan ab
Kollajen (sıçan kuyruğu)Roche11 179 179 001
Coulter ISOTON II SeyrelticiBeckman Coulter844 80 11Seyreltici II
Coulter Z1, Hücre SayacıCoulter Elektronik, Luton, Birleşik Krallık
Susuz Kültür Ortamı: Noble AgarBD DifcoBD 214220
Dermal Mikrovasküler Endotelyal Yenidoğan, Havuzlanmış Donörler (HMVEC-DNeo)LonzaCC-2516
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta/Besin Karışımı F-12 JambonSigma-AldrichD6434
EBM-2 Endotel Hücre Büyümesi Bazal Ortam-2Lonza190860
Etidyum homodimerSigma-Aldrich46043
Fetal Buzağı Serumu (FCS)Thermo Fisher ScientificSH30070
Fetal Buzağı Serumu Kömürü Soyulmuş (FCS sf)Thermo Fisher ScientificSH3006803
Floresan stereo mikroskoplar Leica M205 FALeica Microsystems
GlutaMAX Takviyesi (100x)Gibco35050038
HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısıyok Gibco14175053
Hoechst 33342Yaşam TeknolojileriH3570
HUVEC – İnsan Göbek Veni Endotel HücreleriLonzaCC-2517
ImageJUlusal Sağlık Enstitüsü, ABDWayne Rasband
Sürüm: 1.52a (64 bit)
Ki67Cell Marque275R-16monoklonal tavşan ab, klon SP6
Leica tam motorlu floresan stereo mikroskopLeica MicrosystemsM205 FA
Leica Histocore Multicut Döner Mikrotom149MULTI0C1
Düşük Serum Büyüme Takviyesi Kiti (LSGS Kiti)GibcoS003K
MCF-7 hücreleri ve insan meme adenokarsinomu hücre hattıJinekoloji Kliniği, ZürihDr Andrè'den alınmıştır; ATCC
Nunclon Sphera 96U-kuyu plakasındanFedier, Thermo Fisher Scientific174925
Paraformaldehit (PFA)Sigma-AldrichP6148
Fosfat tamponlu salin (PBS) 1xGibco10010015
Pierce BCA Protein Test KitiThermo Scientific23225
Protein Lizis Tampon HücreSinyali, Danvers, ABD9803
Quick-RNA Miniprep KitiZymo ResearchR1055
RNA Lizis TamponuZymo ResearchR1060-1-100Quick-RNA Miniprep Kitinde İçindekiler
Rotina 46R SantrifüjHettich
Yuvarlak Tabanlı Polistiren Tüpler, 5 mLFalcon352003
SonicatorBandelin elektroniği, Berlin, DE
Tecan Infinite serisi M200 mikroplaka okuyucuTecan, Salzburg, AU
Doku Kültürü Şişeleri 75TPP90076
Tripsin-EDTA çözeltisiSigma-AldrichT3924
Üniversite Hastanesi elde edilen

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
  3. Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
  4. Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
  5. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  6. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  7. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  8. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285(2017).
  9. Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
  10. Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97(2020).
  11. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
  12. Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
  13. Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), Cambridge, England. 935-937 (2017).
  14. Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  17. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  18. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  19. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  20. Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
  21. Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
  23. Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460(2020).
  24. Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
  25. Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
  26. Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
  27. DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
  28. Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
  29. Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
  30. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116(2018).
  31. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
  32. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720(2011).
  34. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  35. Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
  36. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  37. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29(2012).
  38. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), Dayton, Ohio. 1329-1340 (2018).
  39. Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
  40. Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
  41. Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
  42. Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955(2017).
  43. Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
  44. Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
  45. Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
  46. Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
  47. Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
  48. Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Meme Kanseri SferoidleriMeme Epitel H creleriAsk da Damla K lt rU Tabanl PlakaH cre Canl l BoyamasSferoid KesitlemeH cre Proliferasyon Mark rT m r Mikro evresi

İlgili makaleler