Yöntem makalesi

Kinetx: Trombosit Aktivasyonunu Gerçek Zamanlı Olarak Kantitatif Olarak Ölçmek ve Kategorize Etmek için Kombine Akış Sitometrisi Testi ve Analiz Yazılımı Çerçevesi.

DOI:

10.3791/62947

⸱

7 Ekim 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1ICMR, School of Biological Sciences, University of Reading, 2Institute of Cardiovascular Sciences, University of Birmingham

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombositler bir dizi uyarana hızla tepki verir. Bu makale, trombosit granül salınımı, fibrinojen bağlanması ve hücre içi kalsiyum akışının kantitatif kinetik ölçümlerini sağlamak için gerçek zamanlı akış sitometrisi tabanlı bir trombosit fonksiyon testini ve yeni geliştirilen ısmarlama bir açık kaynaklı yazılımı (Kinetx) açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombositler vasküler hasara hızla tepki verir ve kan kaybını sınırlamak için bir dizi uyarana yanıt olarak aktivasyona uğrar. Birçok trombosit fonksiyon testi, trombosit aktivasyon oranını değil, belirli bir süre sonra son nokta yanıtlarını ölçer. Bununla birlikte, trombositlerin hücre dışı uyaranları fonksiyonel bir yanıta dönüştürme hızı, yaralanmaya ne kadar verimli yanıt verebileceklerini, oluşan bir trombüse bağlanabileceklerini ve diğer trombositleri işe almak için sinyal verebileceklerini belirlemede önemli bir faktördür. Bu makale, eşzamanlı veri toplama ve numune stimülasyonunu mümkün kılan ve trombosit granül salınımı, fibrinojen bağlanması ve hücre içi kalsiyum akışının kantitatif kinetik ölçümlerini sağlamak için yeni geliştirilen ısmarlama açık kaynaklı yazılımı (Kinetx) kullanan akış sitometrisi tabanlı bir trombosit fonksiyon testini açıklamaktadır. Kinetix, kullanıcıların yumuşatma derecesi, uzaktaki veri noktalarının tanımlanması veya zaman ölçekleri gibi parametreleri değiştirebilmeleri için geliştirilmiştir. R ortamına aşina olmayan kullanıcılara yardımcı olmak için, Kinetix veri analizi tek bir komutla gerçekleştirilebilir. Birlikte bu, hız, hızlanma, zirve hızına ulaşma süresi, pik kalsiyuma kadar geçen süre ve kalitatif şekil değişiklikleri gibi gerçek zamanlı trombosit aktivasyon ölçümlerinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini ve kategorize edilmesini sağlar. Trombosit aktivasyonunun kinetik ölçümleri, aktivasyonun ilk aşamalarında trombositlerin davranışı hakkında benzersiz bir fikir verir ve trombositlerin oluşturan bir trombüse alımını tahmin etmek için bir yöntem sağlayabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombositler hemostazda merkezi bir rol oynar ve vasküler hasara hızlı ve çok yönlü bir yanıt oluşturur 1,2. Mevcut trombosit fonksiyon testleri, in vivo olarak hemostatik etkilerini temsil eden trombosit reaktivitesinin çeşitli yönlerini ölçer. Geleneksel olarak, trombosit fonksiyonu, maksimum aktivasyon 3,4 elde etmek için yeterince uzun süre uyarılan trombositlerde fibrinojen bağlanmasını, granül salınımını veya trombosit agregasyonunu ölçen son nokta testleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Bu testler, trombositlerin hücre dışı uyaranları hücre içi sinyallere ve kalsiyum akışına dönüştürmesi ve ardından degranüle olması ve büyüyen trombüse bağlanması için geçen süreyi hesaba katmaz. Kan, damarlarda 20 din/cm3'e ve büyük arterlerde 80 din/cm3'e kadar bir kayma hızında akar5, bu da trombositlerin hücre dışı uyaranları hızlı bir şekilde algılayarak, işleyerek ve bunlara yanıt vererek bu hızlı akış hızına karşı koyma ihtiyacını vurgular.

Trombosit aktivasyon hızı, maksimum trombosit aktivasyon derecesinden bağımsız olarak değişebilir. İntegrine bağlı kinaz (ILK), trombositlerdeki β1 ve β3 integrinlerinin düzenlenmesinde rol oynayan bir proteindir 6,7. İLK'in inhibisyonu veya spesifik silinmesi in vivo, fonksiyonel ILK8'in yokluğunda trombosit aktivasyonunun maksimum derecesinin değil, oranının etkilendiğini göstermiştir. RAP111 aracılığıyla içten dışa sinyalleşmenin düzenlenmesinde rol oynayan bir sinyal molekülü olan CALDAG GEFI 9,10'da eksik olan farelerde de agregasyon hızı ile maksimum agregasyon seviyesi arasındaki farklar tespit edildi.

Bu bulgular, trombosit hızı ve maksimal aktivasyon seviyelerinin özerk olabileceğini ve maksimal aktivasyon ölçümlerinin bu noktaya kadar trombosit davranışını tanımlayıcı olmayabileceğini göstermektedir. Trombositlerin aktive olması için geçen süredeki bu farklılıklar, trombositlerin büyüyen trombüse ilk bağlanmalarını derinden etkileyerek trombüsün mimarisini ve genel boyutunu etkileyebilir. Trombosit hızı ve maksimal aktivasyon arasındaki bu varyasyonlar, trombosit aktivasyon oranını doğru bir şekilde ölçmek için bir teste olan ihtiyacı vurgulamaktadır ve popülasyon içindeki varyansları tespit etmek için kullanılabilir.

Bu makale, trombosit aktivasyonunu ve kalsiyum akışını gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde ölçen ve trombositlerin aktive olma hızı ve trombositlerin maksimum aktivasyon hızına ve maksimum kalsiyum akışına ulaşması için geçen süre dahil olmak üzere bir dizi metriği hesaplayan bir yöntemi açıklamaktadır. Trombosit aktivasyonunun bu kinetik ölçümleri, trombüs oluşumunun ilk aşamalarında trombositlerin davranışı hakkında daha iyi bir fikir verir ve trombositlerin oluşturan bir trombüse ne kadar hızlı alınabileceğini tahmin etmek için bir yöntem sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, altta yatan sağlık sorunları olmayan ve yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra trombosit fonksiyonuna müdahale ettiği bilinen herhangi bir ilacı almayan sağlıklı donörlerden alınan insan tam kanı ve trombositlerini kullandı ve Reading Üniversitesi Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı.

1. Kanın alınması ve trombositten zengin plazmanın hazırlanması

  1. Periferik kanı% 3.2 sodyum sitrat içeren bir vakutainerde toplayın
  2. İlk 3 mL'yi atın.
  3. Santrifüjlemeden önce kanı 30 °C'de 30 dakika dinlendirin.
  4. Trombositten zengin plazmayı (PRP), santrifüjlemeden 60 dakika sonra tamamlanan test süresi boyunca 37 ° C'de inkübe etmeden önce oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 140 x g'da santrifüjleme ile hazırlayın.

2. Enstrüman hazırlığı

NOT: Akış sitometresi olayları kaydederken trombositler aynı anda uyarıldığından, gerçek zamanlı akış sitometrisi için basınçsız bir akışkan sistemi gereklidir.

  1. Gerçek zamanlı akış sitometrisi yapmak için basınçsız bir akış sitometresi kullanın.
  2. Testi 37 °C'de gerçekleştirmek için, 96 oyuklu plakayı yerleştirmek için sahneye bir fare diseksiyon matı takın. Test süresi boyunca matı 37 °C'ye ısıtın.
  3. 37 ° C'de sürekli inkübasyona izin vermek için ısıtılmış matın üzerine 96 oyuklu bir plaka yerleştirin (Şekil 1)

3. Tahlil hazırlığı

  1. Fibrinojen bağlanması ve P-selektin ekspresyonu
    1. Polipropilen 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı, işlenmemiş bir mikrotitre plakasını %5 sığır serum albümini (BSA) ile Hepes tamponlu salin (HBS; 10 mM Hepes pH 7.4; 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4·7H20) ile gece boyunca 4 ° C'de kaplayın.
    2. 5 mM glikoz (HBS-G) içeren HBS'de antikor karışımını hazırlayın. Floresein izotiyosiyanat (FITC) etiketli anti-fibrinojen antikoru, (FITC-FGN; seyreltme 1: 37.5 (h / v)) ve allofikosiyanin (APC) etiketli anti-P seçicin (APC-CD62P; seyreltme 1: 37.5 (h / h)) HBS-G'ye (son hacim: 225 μL) ekleyin ve 37 ° C'de 96 oyuklu bir plakada inkübe edin.
    3. Olayları toplamadan hemen önce, PRP'yi HBS-G-antikor karışımına 1:600 (h/h) seyreltmede ekleyin.
      NOT: Olay sınırının aşılmamasını sağlamak ve numunedeki trombosit agregasyonunu azaltmak için düşük hacimli bir PRP gereklidir. Trombosit seyreltmesi pilot çalışmalarda incelenmiştir ve aktivasyon oranını etkilememiştir.
    4. FITC-FGN, (seyreltme 1: 37.5 (h/h)) ve APC-CD62P (seyreltme 1: 37.5 (h/h)) ve agonist içeren aktivasyon karışımını 37 ° C'de inkübe edin. Agonistler arasında Gly-Pro-Arg-Pro peptid (GPRP; 1.18 mM), çapraz bağlı kollajen ile ilişkili peptit (CRP-XL; 0.004-10 μg/mL), adenosin difosfat (ADP; 0.04-4 μM), epinefrin (epi; 20-200 μM), 9,11-Dideoksi-11α,9α-epoksimetanoprostaglandin F2α (U46619; 0.02-5 μM) ve trombin reseptör aktivatör peptid 6 (TRAP-6; 0.04-10 μM) bulunur.
  2. Kalsiyum akışı
    NOT: Bu test, ticari bir kalsiyum test kiti (Malzeme Tablosu) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
    1. Polipropilen 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı, işlem görmemiş bir mikrotitre plakasını %5 BSA ile gece boyunca 4 °C'de Hepes tamponlu tuzlu su içinde kaplayın.
    2. Kalsiyum tahlil boyasını hazırlamak için, 2x kalsiyum reaktif yükleme çözeltisi elde etmek için bir şişe kalsiyum reaktifine 100 mL kalsiyum tahlil tamponu ve 2 mL probenesid stok çözeltisi (250 mM) ekleyin.
    3. Fluo-4 / HBS-G'yi hazırlamak için, kalsiyum tahlil boyasını HBS-G ile 1: 1 oranında seyreltin, 0.22 μM'lik bir filtreden süzün. 37 ° C'de 96 oyuklu bir plakanın uygun kuyucuklarına 225 μL Fluo-4 / HBS-G ekleyin.
    4. PRP'yi 37 ° C'de 30 dakika boyunca Fluo-4 / HBS-G ile 1: 1 seyreltmede inkübe edin.
    5. Aktivasyon karışımını Fluo-4 / HBS-G'de hazırlayın ve 37 ° C'de inkübe edin. Agonistler arasında GPRP, CRP-XL (0.5 μg/mL), ADP (1 μM), epinefrin (20 μM), U46619 (1 μM) ve TRAP-6 (1 μM) varlığında trombin (1 U/mL) bulunur.
    6. Olayları toplamadan hemen önce, 1: 600'lük bir son PRP seyreltmesinde (agonist ilavesinden sonra) 225 μL Fluo-4 / HBS-G karışımına PRP / Fluo-4 / HBS-G ekleyin (son hacmin 300 mL'sinde v / v; 0.5 mL).

4. Tahlil prosedürü ve veri toplama

  1. Akış sitometresini, saniyede ortalama 1000 olay (eps) ve maksimum 3000 eps ile 'yavaş' bir akış hızına ayarlayın. Hücre kalıntılarının kaydedilmesini önlemek için eşiği 20000 olarak ayarlayın.
  2. İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) grafiklerini kullanarak trombosit popülasyonunu kapatın. Veri toplama için, trombosit popülasyonunu doğru bir şekilde geçmek için FSC-A ile SSC-A'yı ve zaman içindeki floresan olaylarını kaydetmek için FL1 veya FL4 ile zamanı çizin.
  3. Akış sitometresinin olayları kaydetmeye başlaması 14 saniye sürer; bundan sonra, spontan karıştırmayı sağlamak için bir jel yükleme ucu kullanarak hızlı bir şekilde 75 μL aktivasyon karışımı eklemeden önce cihazın her bir oyuktaki olayları 5 saniye daha kaydetmesine izin verin (Şekil 1).
  4. Olayları 5 dakika boyunca toplayın ve 488 (FL1; 533/30 filtre - FITC-fibrinojen/FLUO-4) kanalını zamana ve 633 (FL4; 675/25 filtre - APC-P-selectin) kanalına karşı zamanı kaydetmek için grafikleri ayarlayın.
  5. Her birinden 488 ve 633 kanal için çizim verilerini ve CSV dosyalarını kaydedin.

5. Veri analizi

  1. Kinetx12'nin en son sürümünü indirin.
    NOT: İndirme, tahlilden üretilen verileri analiz etmek için gereken tüm kodu içerir ve on bağışçıdan alınan deneysel verilerden ve analizlerinden elde edilen çıktılardan oluşan bir test seti ile birlikte sunulur (bu sonuçlar aşağıdaki prosedürler aracılığıyla yeniden oluşturulabilir ve doğrulanabilir) (Şekil 2).
  2. R ortamını ayarlama
    1. RStudio ortamı aracılığıyla R programlama dilini kullanın. R13, RStudio14 ve şu paketleri yükleyin: ggplot2, dplyr, plotrix, minpack.lm, tidyverse, psych. Tüm önkoşul paketlerinin başarıyla yüklendiğinden emin olun.
    2. Meta Veri Oluştur: Verilerle aynı dizinin içine bir metin dosyası (wellData.txt olarak adlandırılır) yerleştirin. Agonistleri, konsantrasyonlarını, herhangi bir antikoru ve her bir CSV dosyasını oluşturmak için kullanılan tahlili (fonksiyon veya kalsiyum) tanımlar.
    3. Aynı dizine ikinci bir metin dosyası ('IsotypeData.txt') yerleştirin ve izotipleri tanımlayın. İndirme sırasında sağlanan dosyalar ('veri/wellData.txt' ve 'veri/IsotypeData.txt'), alternatif agonistlere, inhibitörlere ve konsantrasyonlara kolayca uyarlanabilen bir şablon görevi görebilir.
    4. Verileri analiz edin: Kinetx, 5.2.5-5.2.7 adımlarında tanımlandığı gibi üç fonksiyondan oluşur.
    5. kinetxProcess.R: Bu işlev, ham fonksiyonel akış sitometrisi verilerini işler. Çalıştırmak için kinetxProcess('veri konumu','çıktılar nereye koyulur','FL1' (FITC-anti-fibrinojen için) veya 'FL4' (APC-CD62P için) yazın.
    6. kinetxProcessCalcium.R: Bu işlev, kalsiyum akışı verilerini analiz eder ve etiketler. Çalıştırmak için kinetxProcessCalcium('veri konumu','çıktıların nereye konulacağı','FL1') yazın
    7. kinetxSummary.R: Bu fonksiyon verileri özetler. Çalıştırmak için kinetxSummary('veri konumu','çıktılar nereye koyulur','FL1') yazın.
    8. Yukarıdaki işlevlerin tümünü (5.2.5-5.2.7) test verilerinde çalıştırmak için komut dosyasını (test. R).
      NOT: İlk iki işlev, her bir donör için ham verileri ve takılan eğrileri gösteren rakamlar üretir. Tüm çıktılar ve verileri özetleyen bir elektronik tablo çıktı konumuna yerleştirilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonksiyonel gerçek zamanlı akış sitometrisinin analizi, agonistler ve donörler arasındaki aktivasyon eğrilerinin şeklindeki farklılıkları ortaya çıkarır
Kinetx kullanılarak fonksiyonel verilerin veri analizi (P-selektin maruziyeti ve fibrinojen bağlanması), makul aralıkların (>200000 veya <1) ve <2.80 s (bu noktaya sıfır zaman ayarlanarak) dışındaki veri noktalarını kaldırır, verileri izotiplerin medyanına normalleştirir ve düzgün bir hareketli ortalama eğrisine uyar (fonksiyon losyonu aracılığıyla). Kinetx ayrıca, takılan düzleştirilmiş çizgi şekline, mutlak değerlere ve değişim oranlarına dayalı olarak metrikler ve kategoriler atar: (1) RoC - ilk 120 saniye boyunca düzleştirilmiş çizgideki ortalama artış; (2) etiket - FL1 için 40 ve 80 ve FL4 için 5 ve 10 kesme değerlerine göre ayarlanan yanıtları hızlı, orta veya yavaş olarak sınıflandırır; (3) EarlyRoC - ilk 20 saniye boyunca düzleştirilmiş çizgideki ortalama artış; (4) şekil - düşük yanıt verenler, artan, doğrusal veya azalan (Şekil 3A) - Düşük yanıt verenler FL1 < 4000 veya FL4 < 1000 olarak belirlenir, artan, doğrusal ve azalan etiketler aşağıdakilere göre belirlenir: shapeMetric - RoC (120 saniye)/EarlyRoC, burada artan shapeMetric >2, doğrusal shapeMetric 0.9-2 arasında ve azalan shapeMetric <0.9; (5) 0 sn, 10 sn, 20 sn, 30 sn, 40 sn, 60 sn, 90 sn, 120 sn, 180 sn, izotip medyanı, maksimum ve minimum değişim ve ivme oranları ile tüm etiket ve kategorilerdeki değişim seviyesini ve oranını sağlayarak verileri özetleyen bir elektronik tablo oluşturur.

ADP, TRAP-6, CRP-XL, epinefrin ve U46617 agonistlerinin tek bir konsantrasyonuna yanıt olarak aktivasyonu takiben 5 dakika boyunca trombosit fibrinojen bağlanması ve P-selektin maruziyeti 30 donörde analiz edildi. Farklı agonistlere yanıt olarak fibrinojen bağlanması ve P-selektin maruziyeti ölçümleri, yanıtın şeklinde önemli farklılıklar gösterir (Şekil 3). TRAP-6 ve ADP ile uyarılan trombositler, fibrinojen bağlanmasında daha hızlı bir hızlanma gösterdi, bu da birçok donör için daha sonraki zaman noktalarında yavaşladı (Şekil 3B). CRP-XL, trombin ve epinefrine yanıt olarak fibrinojen bağlanması, artan veya doğrusal bir yanıt oranı gösterme olasılığı daha yüksekti. Birçok donör, fibrinojen bağlanma hızı hızla hızlanmadan önce CRP-XL için nispeten uzun bir gecikme süresi gösterdi. U46619'a verilen yanıt genellikle düşük olarak kategorize edildi. Buna karşılık, P-selektin maruziyetinin, yine düşük yanıt seviyeleri gösteren U46619 dışındaki tüm agonistlere doğrusal veya artan bir yanıt oranı gösterme olasılığı daha yüksekti (Şekil 3C).

Trombosit aktivasyonu sırasında hücre içi kalsiyum akışı, gerçek zamanlı akış sitometrisi kullanılarak doğru bir şekilde ölçülebilir
Kalsiyum akışı analizinin veri analizi, makul aralıkların dışında kalan veri noktalarını kaldırır (< 2,80 sn bu noktaya sıfır zaman ayarlanmıştır) ve ardından düzgün bir hareketli ortalama eğrisi (fonksiyon kaybı yoluyla) uyar. Kinetx metrikleri atar ve kategoriler, takılan düz çizgiler şekline, mutlak değerlere ve değişim oranlarına göre aşağıdaki gibi atanır: (1) kategori - erken yükseliş, maksimum ve maksimumdan son düşüşe dayalı kalsiyum yanıtının şeklini tanımlar, doğrusal, tepe veya sürekli olarak tanımlanır (Şekil 4A); (2) oran - hızlı 30 saniyedeki değişim oranını tanımlar ve değişiklik yok, yavaş, orta veya hızlı (10, 40 ve 80'de kesilerek) olarak tanımlanır. Kinetx ayrıca 0 sn, 10 sn, 20 sn, 30 sn, 40 sn, 60 sn, 90 sn, 120 sn, 180 sn'deki değişim seviyesini ve oranını, maksimum ve minimum değişim ve ivme oranlarını ve tüm etiket ve kategorileri sağlayarak verileri özetleyen bir elektronik tablo oluşturur ve her bağışçı için verilerin bir rakamını üretir. 30 bireyde bu yöntemle ölçülen kalsiyum akışı örnekleri, yine bireyler ve agonistler arasında farklı aktivasyon paternleri göstermiştir (Şekil 4B). CRP-XL ağırlıklı olarak sürekli kalsiyum yanıtı verirken, TRAP-6'ya yanıt en sık pik bir yanıt gösterdi. Diğer tüm agonistler ağırlıklı olarak doğrusal bir yanıt üretti.

Gerçek zamanlı akış sitometrisi, farklı agonistlere ve konsantrasyonlara yanıt olarak maksimum aktivasyon seviyelerindeki farklılıkları tanımlar
Sonuçlar, gerçek zamanlı akış sitometrisi testinin, farklı reseptörler yoluyla stimülasyona yanıt olarak maksimum fibrinojen bağlanma seviyelerindeki (Şekil 5A) ve P-selektin maruziyetindeki (Şekil 5D) farklılıkları tespit etme kapasitesine sahip olduğunu göstermektedir (10 μg/mL CRP-XL'ye karşı 3 U/mL trombin P < 0.001; 10 μg/mL CRP-XL'ye karşı 1 U/mL trombin P < 0.001). Ayrıca, testin, daha büyük agonist konsantrasyonlarına yanıt olarak maksimum fibrinojen bağlama ve P-selektin maruziyeti seviyelerinin arttığı agonist konsantrasyonundaki farklılıklara duyarlı olduğunu göstermektedir (fibrinojen bağlanması - CRP-XL - 0.004 μg / mL'ye karşı 0.4, 5, 10 μg / mL, P < 0.01; trombin - 0.0012 U / mL'ye karşı. 1 ve 3 U / mL, P < 0.01; ADP - 0.04 μg/mL'ye karşı 1 ve 4 μM, P < 0.05).

Gerçek zamanlı akış sitometrisi testi, trombosit aktivasyon oranındaki donörler arasındaki değişkenliği tespit edecek kadar hassastır
Maksimum trombosit aktivasyon hızı, floresan verilerine düzleştirilmiş bir hareketli ortalama (lös) takılarak ve daha sonra bunun maksimum fibrinojen bağlanma oranını ve P-selektin maruziyetini hesaplamak için kullanılmasıyla belirlendi (Şekil 5B, E). Veriler, bireysel donörler arasında önemli bir varyasyon olduğunu göstermektedir ve akış sitometrisi testi bu varyasyonu tespit edecek kadar hassastır. Sonuçlar, artan agonist konsantrasyonunun maksimum fibrinojen bağlanma oranı üzerinde çok az etkisi olduğunu göstermektedir (Şekil 5B). Buna karşılık, maksimum P-selektin maruziyeti oranı, daha fazla trombin ve CRP-XL konsantrasyonu ile artar, ancak artan ADP konsantrasyonları ile artmaz (Şekil 5E).

Trombosit aktivasyonunun gecikme süresindeki değişiklikler, gerçek zamanlı akış sitometrisi kullanılarak tespit edilebilir
Maksimum trombosit aktivasyon hızına kadar geçen süre, maksimum fibrinojen bağlanma hızına ve P-selektin maruziyetine ulaşılan zaman noktalarının hesaplanmasıyla belirlendi (Şekil 5C,F). Maksimum fibrinojen bağlanma oranı ve P selektin maruziyeti, özellikle düşük agonist konsantrasyonlarında donörler arasında değişir. Trombositlerin artan CRP-XL konsantrasyonları ile uyarılması, daha yüksek agonist konsantrasyonlarının donörler arasında daha az değişkenlik ile maksimum fibrinojen bağlanma oranına ulaşmak için daha az zaman aldığını gösterir; bununla birlikte, bu eğilim trombin veya ADP stimülasyonu ile görülmez (Şekil 5C). Test, bazı durumlarda, agonist konsantrasyonunun arttırılmasının, maksimum trombosit aktivasyon oranını değiştirmeden trombosit aktivasyonunun başlaması için geçen süreyi (gecikme süresi) azalttığını ve bu ölçümlerin her ikisinin de bu testle değerlendirilebileceğini göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Islak laboratuvar gerçek zamanlı akış sitometrisi. (A) antikoagüle tam kan, (B) trombositten zengin plazma (PRP) elde etmek için santrifüjlendi. (C) Uygun antikorlar veya kalsiyum indikatör boyaları içeren seyreltilmiş PRP, 96 oyuklu bir plakaya yerleştirildi, basınçsız bir akış sitometresine yüklendi ve bir diseksiyon matı kullanılarak 37 ° C'de tutuldu. Numuneler, alım sırasında antikorlar veya kalsiyum boya ve agonist içeren bir aktivasyon karışımı ile uyarıldı, spontan karışımı sağlamak için bir jel yükleme ucu kullanılarak kuyuya hızla eklendi. (D) Olaylar 5 dakika boyunca toplandı ve her kuyu için verilerin CSV dosyaları kaydedildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Veri analizinin şeması. (A) R ortamı yapılandırıldı ve meta veriler oluşturuldu. (B) Dıştaki veriler kaldırıldı ve düzgün bir hareketli ortalama (lös) eğrisi takıldı. (C) Yanıt türü ve (D) yanıt şekli tanımlandı. (E) Her bağışçı için metrikler hesaplandı, dışa aktarıldı ve rakamlar oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Gerçek zamanlı trombosit fibrinojen bağlanması ve P-selektin ekspresyonunun Kinetx analizinin temsili çıktısı. (A) Çeşitli zaman noktalarında maksimum değişim oranı (RoC) ve RoC gibi metrikler sağlamanın yanı sıra, Kinetx ayrıca tek bir metrikte yakalanması zor olan trombositlerin aktivasyonu hakkında ek bilgi sağlamak için eğrinin şeklini de sınıflandırır. 30 birey için temsili veriler, ADP, TRAP-6, CRL-XL, epinefrin ve U46617 agonistlerine yanıt olarak gerçek zamanlı trombosit (B) fibrinojen bağlanması ve (C) P-selektin ekspresyonunda görülen tipik varyasyonu göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Gerçek zamanlı trombosit Kalsiyum Akısının Kinetx analizinin temsili çıktısı. (A) Kinetx, çeşitli zaman noktalarında maksimum değişim oranı (RoC) ve RoC gibi metrikler sağlamanın yanı sıra, tek bir ölçümde yakalanması zor olan trombositlerin aktivasyonu hakkında ek bilgi sağlamak için kalsiyum akış eğrisinin şeklini de sınıflandırır. 30 birey için temsili veriler, ADP, TRAP-6, CRL-XL, epinefrin ve U46617 agonistlerine yanıt olarak gerçek zamanlı trombosit (B) Kalsiyum Akısı'nda görülen tipik varyasyonu göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Agonist konsantrasyonu maksimum trombosit aktivasyonunu belirler ancak trombosit aktivasyon oranını belirlemez. Maksimum trombosit aktivasyonu - fibrinojen bağlanması (A) veya P-selektin maruziyeti (D) - agonist (CRP-XL, trombin veya ADP) konsantrasyonu ile önemli ölçüde pozitif olarak değiştirildi. Trombosit aktivasyon hızı (B ve E) ve maksimum trombosit aktivasyon hızına kadar geçen süre (C ve F), değişen agonist konsantrasyonu ile ya hiç ilişki göstermedi ya da daha zayıf bir ilişki gösterdi. P değerleri, tüm konsantrasyon aralığındaki anlamlılığı gösterir (Kruskal-Wallis testi) ve yıldız işaretleri, en düşük konsantrasyondan bireysel değerlerin önemli bir farkını (çoklu karşılaştırma testi) gösterir. * P < 0.05, ** P < 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombositlerin aktive edici uyaranları algılama, işleme ve bunlara yanıt verme hızı, trombüs oluşumu için önemli bir belirleyici olabilir. Önceki çalışmalar, trombosit aktivasyonunun nihai derecesini etkilemeyen, ancak hızı etkileyen sinyal elemanlarının inhibisyonunun kararsız trombüsoluşumuna yol açtığını bulmuştur 8. Birçok trombosit fonksiyon testi, farklı koşullara ve tedavilere yanıt olarak trombosit aktivasyonunun ve agregasyonunun derecesini ölçer; Bununla birlikte, bunlar trombositlerin aktive olma hızını ve bu karmaşık sürecin gerçekleşmesi için geçen süreyi dikkate almaz 3,4. Burada geliştirilen yenilikçi akış sitometrisi tabanlı tahliller, zaman içinde trombosit aktivasyonunu tekrarlanabilir bir şekilde izler ve bunu, maksimum trombosit aktivasyon oranını ve trombositlerin bu maksimum hıza ulaşması ve tamamen aktive olması için geçen süreyi hesaplamak için bir dizi ölçüme dönüştürür.

Sunulan veriler, gerçek zamanlı testin agonist tipine ve konsantrasyona verilen farklı tepkiler arasındaki ve bireyler arasındaki farklılıkları belirleme kapasitesini vurgulamaktadır. Önceki birçok rapor, trombosit reaktivitesinin normal bireyler arasında oldukça değişken olduğunu göstermiştir15,16, bu da trombosit aktivasyon oranının popülasyon içinde de önemli ölçüde değişebileceğini göstermektedir. Bu çalışmadan elde edilen veriler, trombositlere degranülasyon ve fibrinojen bağlanma hızının, maksimum trombosit aktivasyon seviyelerinden bile daha değişken göründüğünü göstermektedir. Bu, gerçek zamanlı akış sitometrisinin, popülasyondaki trombosit oranındaki varyansları tanımlamak ve trombosit fonksiyonunu ölçmenin ek bir yolu olarak farklı inhibitör veya pro-aktive edici ajanların trombosit hızı üzerindeki etkilerini tespit etmek için değerli ve güvenilir bir araç olarak da kullanılabileceğini göstermektedir.

Trombosit fonksiyonu son nokta testleri kullanılarak ölçüldüğünde, farklı agonistler arasında fibrinojen bağlanma veya granül salınımının derecesi üzerinde karşılaştırmalar yapılabilir. Trombosit aktivasyonunun ilk 5 dakikası boyunca fibrinojen bağlanmasını karşılaştıran lös eğrileri, gerçek zamanlı testin, tek son nokta testlerinin ölçemediği trombosit aktivasyon kinetiğindeki farklılıklarda daha fazla ayrıntı ortaya çıkarma yeteneğini göstermektedir.

Gerçek zamanlı tahlilden toplanan veriler, fibrinojenin trombositlere bağlanma hızının, aktive edici yola bağlı olarak biraz farklı bir model izlediğini göstermektedir (Şekil 3). Trombosit aktivasyon kinetiğini doğru bir şekilde değerlendirmek için, eş zamanlı veri toplama ve numune stimülasyonunu mümkün kılan basınçsız bir akış sitometresi kullanmak çok önemlidir. Agonist ve trombositlerin neredeyse anında ve tam olarak karışmasını sağlamak için agonistlerin hızlı bir şekilde eklenmesi de önemlidir. Trombin ADP ve epinefrin ile stimülasyon, reseptör duyarlılığına yanıt olarak hızlı bir sinyalleme başlangıcını temsil eden benzer bir eğri üretir ve bu da trombositlere hızlı ve sabit bir oranda fibrinojen bağlanmasına neden olur. Buna karşılık, CRP-XL tarafından uyarılan trombositler, ilk reseptör duyarlılığını takiben fibrinojene bağlanmak için başlangıçta çok yavaştır; Bununla birlikte, fibrinojen bağlanma hızı, bu ilk gecikmeden sonra hızla artar. TXA2'nin bir taklitçisi olan U46619 ile trombosit stimülasyonu, hızlı bir başlangıç fibrinojen bağlanma hızı ile sonuçlanır, bu da hızla çok yavaş bir hıza düşer ve zaman içinde fibrinojen bağlanmasında sadece hafif ve sabit bir artışa yol açar.

Kinetx, maliyet ve esnekliksizlik gibi özel mülk yazılımlarla ilgili sorunları aşmak için açık kaynaklı, tekrarlanabilir ve uygulanması kolay olacak şekilde tasarlanmıştır. Bu nedenle, uygun olmayan bir yazılımla geliştirilmesi gerekiyordu. R, biyologlar tarafından yaygın olarak kullanılması, kurulumu kolay, maliyetsiz ve açık kaynaklı olması nedeniyle seçilmiştir. Bu açık kaynaklı ortam, R konusunda yetkin kullanıcıların yumuşatma derecesi, uzaktaki veri noktalarının tanımlanması veya zaman ölçekleri gibi parametreleri değiştirmesine olanak tanır. Bununla birlikte, R'ye aşina olmayan araştırmacılara yardımcı olmak için Kinetix, analizin tek bir komutla (analiz edilen verilere bağlı olarak kinetxProcess veya kinetxProcessCalcium) gerçekleştirilebilmesi için de geliştirilmiştir. Burada gösterilen Kinetix yazılımı, fibrinojen bağlanmasının veya P-selektin maruziyetinin maksimum seviyeleri, hızı ve ivmesi ve bu maksimumların meydana geldiği zaman noktaları dahil olmak üzere bir dizi ölçümü hesaplayabilir. Farklı stimülatör yollara yanıt olarak trombosit aktivasyonunun kinetiği, bu sayılar kullanılarak daha doğru bir şekilde karşılaştırılabilir.

Maksimum fibrinojen bağlanma seviyelerindeki farklı agonist stimülasyonları ile fibrinojenin trombositlere bağlanma oranları arasındaki karşılaştırmalar, trombosit aktivasyon hızının maksimum bağlanmadan bağımsız olarak değişebileceği iyi örneklerdir. 0.04 μM ADP (3.85 LogFU) ve 0.04 μg/mL CRP-XL (3.70 LogFU) ile 5 dakikalık stimülasyondan sonra maksimum fibrinojen bağlanması karşılaştırıldığında, her iki agonist de benzer miktarda bağlı fibrinojen ile sonuçlanmıştır (Şekil 5A). Maksimum fibrinojen bağlanma oranları daha da küçük bir fark gösterir (0.04 μM ADP - 0.0050 LogFU / dakika; 0.04 μg / mL CRP-XL - 0.0054 LogFU / dak), bu iki stimülasyon arasında genel fibrinojen bağlanma oranının benzer olduğunu gösterir (Şekil 5B). Bununla birlikte, trombosit aktivasyonunun gecikme süresi karşılaştırıldığında, CRP-XL'nin (117 sn ila maksimum hız) ADP'den (47 s ila maksimum hız) çok daha yavaş bir hızda hızlandığını gösteren açık bir fark vardır (Şekil 5C). Bu nedenle, ADP stimülasyonunun CRP-XL ile karşılaştırıldığında çok daha hızlı bir başlangıç yanıtı (P < 0.001) ile sonuçlandığı anlaşılmaktadır. Birlikte incelendiğinde, iki farklı agoniste yanıt olarak trombosit kinetiğinin bu ölçümleri, yavaş yavaş hızlanan ve sabit bir oranda kalan ADP stimülasyonuna hızlı bir başlangıç yanıtını tanımlar. Buna karşılık, CRP-XL stimülasyonu, çok daha sonraki bir zamanda hızla hızlanan yavaş bir başlangıç aktivasyon hızı ile sonuçlanır ve sonunda ADP ile benzer bir genel oran ve fibrinojen bağlanma seviyelerine yol açar. Fibrinojen bağlanmasının maksimum seviyeleri, hızı ve hızlanması arasındaki bu farklılıklar, trombositlerin ne kadar hızlı aktive olduğunun ölçülmesinde bir dizi parametrenin yer aldığını göstermektedir. Gerçek zamanlı tahlil ve Kinetx analizi, bu parametreleri ölçebilir ve karşılaştırabilir, reseptör duyarlılığından trombosit tepkisine kadar geçen süreyi tanımlayabilir ve bunu farklı sinyal yolları arasında karşılaştırabilir.

Artan agonist konsantrasyonu, trombositlere fibrinojen bağlanma oranı üzerinde önemli bir etkiye sahip değildir. Bununla birlikte, maksimum fibrinojen bağlanma oranına ulaşmak için geçen süre, agonist konsantrasyonu arttıkça azalır, bu da trombositlerin fibrinojeni sabit bir oranda bağladığını ve reseptör doygunluğunun trombositlerin fibrinojene ne kadar hızlı bağlandığı konusunda daha belirgin bir rol oynadığını düşündürür.

Açıklanan kalsiyum akışı testi ve analizi, gerçek zamanlı teste ekstra numuneler olarak dahil edilebilen, aynı numune akışında kalsiyum ve trombosit, fibrinojen bağlanması ve P-selektinin analizine izin veren, hızlı ve gerçekleştirilmesi kolay bir kalsiyum testidir. Ismarlama analiz paketi, yanıtın şekli, maksimum yanıt ve maksimum yanıt süresi dahil olmak üzere kalsiyum akışı kinetiğinin derinlemesine bir değerlendirmesini sağlar. Bu parametreler daha sonra donörler arasındaki varyasyon ve çeşitli farmasötik ajanlara yanıt olarak karşılaştırılabilir. Trombositteki kalsiyum akışı daha önce trombositlerde çeşitli akış sitometrisi bazlı testler kullanılarak incelenmiştir 17,18,19. Aliotta ve ark.14, çoklu hücre içi iyonların kinetiğini analiz edebilen zarif bir tahlili tanımlar. Burada sunulan kalsiyum tahlili, daha fazla esnekliğe, kısa bir zaman diliminde birden fazla donör için yüksek verimli analizin yararı ile verilerin daha derinlemesine araştırılmasına izin veren analiz paketini dahil ederek daha önce yayınlanmış bu tahliller üzerine inşa edilmiştir.

Önceki çalışmalar, belirli sinyal moleküllerinin inhibisyonunun veya yokluğunun, doğrudan trombüs oluşumunadönüşen değişmiş bir trombosit aktivasyon oranı ile sonuçlandığını göstermiştir 8,9. Geçmişte, trombosit aktivasyon kinetiği, daha sonra örneğin farklı agonistlere yanıt olarak GPIIbIIIa dışsallaştırma oranını hesaplamak ve karşılaştırmak için kullanılabilen bir dizi sabit zaman noktası üzerinde akış sitometrisi ile ölçülebilirdi20. Bu yazıda açıklanan gerçek zamanlı test ve Kinetx analizi, dinlenme trombositlerinden trombosit aktivasyonunun hem hızını hem de son noktasını ölçmek için basit, ücretsiz olarak kullanılabilen ve doğru bir yöntem sağlar. Bu, yalnızca son nokta okumaları ölçüldüğünde gözden kaçabilecek trombosit fonksiyonundaki fizyolojik olarak ilgili varyasyonların belirlenmesinde muhtemelen önemlidir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje İngiliz Kalp Vakfı (PG/16/36/31967, RG/20/7/34866 ve RG/15/2/31224) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
9,11-Dideoksi-11&alfa;,9&alfa;-epoksimetanoprostaglandin F2&alfa; - U46619Sigma-Aldrich, Poole, Birleşik KrallıkD8174-1MG
Accuri C6 akış sitometresiBeckton Dickinson, Birleşik Krallık660517 + 660519
Adenozin difosfatSigma-Aldrich, Poole, Birleşik KrallıkA2754-1G
APC etiketli anti-P-selektin (CD62p)BD Biosciences, Birleşik Krallık
Corning polipropilen 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı, işlenmemiş mikrotitre plakasıSigma-Aldrich, Poole, Birleşik KrallıkCLS3879-50EA
Çapraz bağlı kollajenle ilişkili peptit (CRP-XL)CambCol, İngiltere
EpinefrinSigma-Aldrich, Poole, Birleşik KrallıkE4375-1G
FITC etiketli anti-fibrinojen antikoruDako, Agilent Technologies, Birleşik KrallıkF011102-2
Fluo-4 Doğrudan boyaThermo-Fisher ScientificF10472
Jel yükleme uçlarıStarlab, İngiltereI1022-0600
Gly-Pro-Arg-Pro peptitSigma-Aldrich, Poole, İngiltereG1895-5MG
TrombinSigma-Aldrich, Poole, İngiltereSRE0003-10KU
Trombin reseptör aktivatör peptid 6 (TRAP-6)Bachem, St Helens, Birleşik KrallıkH-2936.0005
Vacuette 9NC pıhtılaşma %3,2 trisodyum sitrat (0,109 mol/L)Greiner Bio-one LTD, Stonehouse, Birleşik Krallık454327
BD Csampler ile 550888

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bye, A. P., Unsworth, A. J., Gibbins, J. M. Platelet signaling: a complex interplay between inhibitory and activatory networks. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 14 (5), 918-930 (2016).
  2. Jones, C. I., Barrett, N. E., Moraes, L. A., Gibbins, J. M., Jackson, D. E. Endogenous inhibitory mechanisms and the regulation of platelet function. Methods in Molecular Biology. 788, 341-366 (2012).
  3. Paniccia, R., Priora, R., Liotta, A. A., Abbate, R. Platelet function tests: a comparative review. Vascular Health and Risk Management. 11, 133-148 (2015).
  4. Saboor, M., Moinuddin, M., Ilyas, S. New horizons in platelets flow cytometry. The Malaysian Journal of Medical Sciences : MJMS. 20 (2), 62-66 (2013).
  5. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, 1525-1541 (1996).
  6. Pasquet, J. M., Noury, M., Nurden, A. T. Evidence that the platelet integrin alphaIIb beta3 is regulated by the integrin-linked kinase, ILK, in a PI3-kinase dependent pathway. Thrombosis and Haemostasis. 88 (1), 115-122 (2002).
  7. Stevens, J. M., Jordan, P. A., Sage, T., Gibbins, J. M. The regulation of integrin-linked kinase in human platelets: evidence for involvement in the regulation of integrin alpha 2 beta 1. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 2 (8), 1443-1452 (2004).
  8. Jones, C. I., et al. Integrin-linked kinase regulates the rate of platelet activation and is essential for the formation of stable thrombi. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 12 (8), 1342-1352 (2014).
  9. Cifuni, S. M., Wagner, D. D., Bergmeier, W. CalDAG-GEFI and protein kinase C represent alternative pathways leading to activation of integrin alphaIIbbeta3 in platelets. Blood. 112 (5), 1696-1703 (2008).
  10. Stolla, M., et al. The kinetics of alphaIIbbeta3 activation determines the size and stability of thrombi in mice: implications for antiplatelet therapy. Blood. 117 (3), 1005-1013 (2011).
  11. Kawasaki, H., et al. A Rap guanine nucleotide exchange factor enriched highly in the basal ganglia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13278-13283 (1998).
  12. Kinetx. , Available from: http://github.com/cardiomaths/Kinetx (2021).
  13. R. , Available from: https://www.r-project.org/ (2021).
  14. R Studio. , Available from: https://rstudio.com/products/rstudio/download/ (2021).
  15. Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
  16. Panzer, S., Hocker, L., Koren, D. Agonists-induced platelet activation varies considerably in healthy male individuals: studies by flow cytometry. Annals of Hematology. 85 (2), 121-125 (2006).
  17. Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Alberio, L. Flow cytometric monitoring of dynamic cytosolic calcium, sodium, and potassium fluxes following platelet activation. Cytometry. Part A : The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 97 (9), 933-944 (2020).
  18. do Ceu Monteiro, M., Sansonetty, F., Goncalves, M. J., O'Connor, J. E. Flow cytometric kinetic assay of calcium mobilization in whole blood platelets using Fluo-3 and CD41. Cytometry. 35 (4), 302-310 (1999).
  19. Vines, A., McBean, G. J., Blanco-Fernandez, A. A flow-cytometric method for continuous measurement of intracellular Ca(2+) concentration. Cytometry. Part A : The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1091-1097 (2010).
  20. Weber, A. A., Schror, K. Differential inhibition of adenosine diphosphate- versus thrombin receptor-activating peptide-stimulated platelet fibrinogen binding by abciximab due to different glycoprotein IIb/IIIa activation kinetics. Blood. 98 (5), 1619-1621 (2001).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Platelet Function AssayKinetic MeasurementsFibrinogen BindingGranule ReleaseCalcium FluxReal Time AnalysisOpen Source SoftwareThrombus Formation
Video yakında

İlgili makaleler