Doğru ve Derin Nicel Proteom Analizi için Yetişkin Subependymal Bölgesinin Kriyo-kesit Diseksiyonu

Nörogenez yetişkin beyninde kısıtlandığı için, çeşitli merkezi sinir sistemi onarım stratejileri, yetişkin sinirsel replasmanın temellerinin daha fazla anlaşılmasından büyük ölçüde fayda sağlayacaktır. Kemirgenler, postnatal nörogenezin temel mekanizmalarını anlamamıza yardımcı oldu, ancak yetişkin nörogenezinin büyük ölçüde türlere bağlı olduğu belirtilmelidir. Farelerde, üç yetişkin nöral kök hücre (NSC) niş vardır. Hipotalamus nörojenik potansiyele sahip yetişkin bir NSC ^niştir1,2, sürekli yetişkin nörogenez ise esas olarak hipokampus3 ve lateral ventriküllerin lateral duvarlarının SEZ'si ile ^{sınırlıdır4,5,6}. SEZ, transkriptör progenitör hücreler (tip C hücreleri) yoluyla nöroblastlara (tip A hücreleri) dönüşen NSC'leri (tip B hücreleri) içeren en büyük germinal bölgedir. SEZ, B tipi hücrelerin% 20-35'ini, C tipi hücrelerin% 1-15'ini, A tipi hücrelerin% 1-30'unu ve ependymal hücrelerin% 25-50'sini ^içerir7. SEZ, kök hücre nişinde bulunan ve etkileyen endotel hücreleri, mikroglial hücreler ve ependymal hücreler ile karmaşık bir mikro mimarisine ^{sahiptir8,9,10}. SEZ'de nöronlar az olmasına rağmen, striatum, ventral tegmental alan veya hipotalamus B tipi hücrelere ulaşır ve ^etkiler4 gibi uzak kaynaklardan yayılan aksonlar. Bu kök hücre nişinin benzersiz bir özelliği, çoğalma bölgesi ile farklılaşma bölgesi arasındaki ayrımdır. Çoğalma sonrasında, nöronal progenitörler SEZ'den koku ampulüne birkaç milimetre göç ederler ve burada nöronlara ölümcül bir şekilde farklılaştılar ve önceden var olan sinir devrelerine entegre oldular. Nörogenez ile ilişkili hücre iç programlarına yönelik araştırmalar, deneysel terapötik hücre yeniden programlama ve transplantasyon stratejileri için önemli bilgiler sağlamıştır15,16,17,18,19,20. Bununla birlikte, hücre-dışsal sinyaller de nörogenez düzenler ve doku ortamları kök hücrelerin nörojenik kaderini belirleyebilir11,12,14,21,22,23. Sonuç olarak, nörojenik nişlerin mikroçevriminin araştırılması ve kök hücrelerle etkileşimi çok önemlidir.

Hücre dışı matris (ECM) ve diğer salgılanan proteinler mikroçevrinin büyük bir parçasıdır. Doğru tanımlama ve niceleme için, proteomik bir yaklaşım, ^ECM24,25 için transkriptom ve protein düzeyleri arasındaki düşük korelasyon nedeniyle ECM bileşimini belirlemek için transkriptomik bir yaklaşımdan daha uygundur. Ayrıca, SEZ'deki niş düzenleyicilerin sadece nişlerin kendisini dolduran hücreler tarafından üretilmediğine dair önemli kanıtlar vardır. Koroid pleksus gibi daha uzak yerler, beyin omurilik sıvısı aracılığıyla kök hücrelere iletilen modülasyon sinyallerini ^{salgılar22,23}. Niş proteomu araştırmak, hücre dışı mikroçevretmenin önemli bir kısmının proteinler tarafından bir araya getirildiği göz önüne alındığında, üretim sahalarından bağımsız olarak niş düzenleyicilerin tanımlanmasına yardımcı olabilir.

Tarafsız proteomik analiz için murine ventrikül bölgesini toplamak için, bitişik striatumun dokusunu hariç tutarken kök hücre içeren 50 μm ince paraventriküler kurdeleyi yakalayan yüksek hassasiyetli bir yöntem gereklidir. Ayrıca, diseksiyon sırasında doku pertürbasyonu hücre dışı mikroçevrim analiz etmek için minimalize edilmelidir, çünkü büyüme faktörleri veya sitokinler de dahil olmak üzere çözünür proteinler kolayca yıkanabilir. Sabit dokunun kütle spektrumunu analiz etmek mümkün olsa da, paraformaldehit gibi gerekli ajan protein tanımlama derinliğini azaltacak ve posttranslational değişikliklere neden olabilir. Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama analizi için hücrelerin toplanması için ortak bir tam SEZ diseksiyonu, tüm SEZ'yi makasla ^kaldırır26. Bu standart diseksiyon minimal doku pertürbasyonu ile hızlıdır. Bununla birlikte, numunelerin striatal kirlenmesi önlenemez. Buna karşılık, LCM üstün diseksiyon hassasiyetinin olağanüstü avantajına sahiptir. Bununla birlikte, LCM, örneğin arka plan boyama veya lazer kaynaklı protein denatürasyonu nedeniyle doku pertürbasyonlarını tanıtabilir. Wholemount diseksiyonu ve LCM'nin güçlü yönlerini birleştirmek için MS ile uyumlu, kriyo-kesit diseksiyonu (CSD) olarak adlandırılan yeni bir yöntem geliştirilmiştir (Şekil 1A-D). CSD, SEZ'nin çıkarılmasına ve SEZ için ideal, çoğunlukla nörojenik olmayan bir kontrol bölgesi olan lateral ventriküllerin (MEZ) medial duvarlarının SEZ'nin diseksiyonuna izin verir (protokole bakın). CSD ve son teknoloji MS yöntemlerinin kombinasyonu ile elde edilen niş proteom, bu yetişkin NSC ^niş25'te yeni düzenleyicilerin karakterizasyonu ve tanımlanması için yararlı olduğunu kanıtladı. Bu nedenle, bu yöntem SEZ doku protein bileşiminin belirlenmesi için yararlı olacaktır.

Bu çalışmadaki tüm deneysel prosedürler Alman ve Avrupa Birliği yönergelerine uygun olarak gerçeklenmiş ve kurumsal hayvan bakım komitesi ve Yukarı Bavyera hükümeti (Regierung von Oberbayern) tarafından onaylanmıştır. Deneyler için sadece 8-10 haftalık erkek C57Bl6 fareleri kullanıldı.

1. Fare beyninin hazırlanması (~ Fare başına 15 dk)

1. 1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinin (HBSS) 500 mL'sine 5 mL 1 M HEPES (son konsantrasyon 10 mM) ekleyerek diseksiyon ortamını hazırlayın.
   NOT: Diseksiyon ortamının (+4 °C) saklama süresi 2 haftayı geçmemelidir.
2. Fareleri servikal çıkık ile kurban edin ve beyni dikkatlice parçalara ayırmayın.
   NOT: AKM araştırılırken, doku tercihen değiştirilmemelidir. Servikal dislokasyon diseksiyon süresini mümkün olduğunca kısa tutar, böylece post-mortal enzimatik otodizasyonu mümkün olduğunca önler. Kanın çıkarılması araştırma sorusu için kritikse, beyni çıkarmadan önce fareyi fosfat tamponlu salin (PBS) ile transkardiyöz olarak kullanın.
3. Beyni elle diseksiyonla çıkarın ve buz gibi diseksiyon ortamı içeren bir kültür kabına yerleştirin (Şekil 1B - 1).
   NOT: Diseksiyon boyunca beyinleri buz üzerinde diseksiyon ortamında tutun.
4. Koku ampulünü (OB) neşterle (Şekil 1B - 2) OB ile korteksin ön direği arasında düz bir koronal kesimle çıkarın.
5. Koronal düzlemde lateral ventrikülleri görünür hale getirmek için bir koronal kesim kullanarak korteksin ön kutbunun neşterle çıkarılmasının (Şekil 1B - 3).
   NOT: Koronal kesimin optik chiasm'dan ~5 mm rostral olarak yapıldığından emin olun; aksi takdirde, SEZ/MEZ'in rostral kısmı kaybolur.
6. Makas kullanarak, kortikal yüzeyden ventrikül lümenine kadar yay kesitinden başlayarak her iki lateral ventrikülü de üstten açın ve bu kesimi ventrikül bükülmesini takiben c şeklinde uzatın (Şekil 1B - 4).
7. Makasla ek bir koronal kesim ile sol ve sağ sagittal kesiğin kaudal uçlarını bağlayın.
   NOT: Üç kesim şimdi bir yamuk oluşturur ve bir sonraki adımda korteks ve korpus callosumunun çıkarılmasını kolaylaştıracaktır.
8. Lateral ventrikülleri kaplayan korteks ve korpus callosum'u asaps kullanarak çıkarın (Şekil 1B - 5). Daha sonra, medial ventrikül duvarlarını kaplayan korteks ve korpus callosum'u çıkarın. Burada, doku medial ventrikül duvarlarına bağlıysa ek kesikler yapın veya dokuyu yerinden çıkarmak için korteksi ve korpus callosum'u makasla kaldırın.
9. Ventrikül duvarlarını forsepslerle dikkatlice yayın (Şekil 1B - 6). Koroid pleksusups ile çıkarın.
   NOT: Koroid pleksusunun tamamen çıkarılması, aşağıdaki diseksiyon adımlarına müdahaleyi önlemek ve SEZ/MEZ örneklerinin potansiyel kirlenmesini önlemek için önemlidir.
10. Beyni cam bir kaydırağın üzerine koyun ve beyni dondurmak için cam kaydırağı kuru buzun üzerine yerleştirin. Ventrikül duvarlarını açık konfigürasyonda koruyun.
    NOT: SEZ ve MEZ'in hassas ve özel diseksiyonu için ventrikülün lateral ve medial duvarları arasında yeterli mesafeyi sağlayın. Doku kapalı bir konfigürasyona geri dönerse, duvarları donma sırasında istenen konumda sabitlemek için tokmakları kullanın. SEZ/MEZ'de herhangi bir hasar meydana gelmekten kaçının. Özellikle açılan ventriküllerin üst kenarında minimum kuvvet uygulamayı deneyin.

2. Hazırlanan beynin bölümlenerek (~ fare başına 15 dk)

1. Bir kriyostat kullanarak lateral ventrikülün sonuna kadar beynin 50-100 μm kalınlığında koronal bölümlerini kesin ve bölümleri cam slaytlara monte edin. Beynin OCT ortamı ile arka beyindeki kriyostat bağlanma plakasına bağlı olduğundan ve özellikle ventriküllerde hiçbir OCT'nin ön beyinle temas etmemesini sağlayın.
   NOT: OCT ortamı MS ölçümlerini kesintiye uğratacaktır. Bununla birlikte, doku bir antikor testi için kullanılacaksa, OCT ortamını dışlamak gereksizdir. Kaplamalı cam slaytların kullanılması önerilmez. Kaplanmış slaytlar dokuya çok fazla yapışkan kuvvet uygular, böylece doku örneğinin slaytlardan aşağıdaki adımlarda mikrosantrifüj tüpüne translokasyonuna engeldir.

3. Beyin dilimlerinin serbest elle diseksiyonu (~ fare başına 30 dk)

1. Beyin bölümlerini içeren cam slaytları bir diseksiyon mikroskobu altında kuru buzun üzerine yerleştirin (Şekil 1C - 1).
2. Mikrosantrifüj tüplerini kuru buz üzerinde hazırlayın ve numune transferden önce tüplerin en az 1 dakika kuru buzda kalmasını sağlayın.
   NOT: Bazı düşük kaliteli tüpler MS ölçümleriyle ilişkili sonraki doku sindirim adımlarında plastik dökebileceğinden, yüksek kalitede mikrosantrifüj tüpleri kullanın.
3. Striatumun kompakt miyelinini yoğun beyaz noktalar olarak gözlemlenebilir hale getirmek için kısa ve eksik bir çözülme elde etmek için dilimleri kuru buzdan 15-30 sn kaldırın.
   NOT: SEZ ile striatum arasındaki sınırı bulmak uygulanabilir hale gelir (Şekil 1C - 2, miyelin hariç tutulması ve tümmount yöntemiyle karşılaştırma için Şekil 2A'ya bakın). Çözülme çok uzun sürerse, eldiven kaplı bir parmağı cam kaydırağın karşı tarafına bastırarak işlem hızlandırılabilir. Ancak, aşırı çözülme kolayca gerçekleştiği için bu manevra yapılmalıdır.
4. SEZ'yi önceden soğmuş bir neşterle bitişik striatumdan ayırın (Şekil 1C,D).
5. Soğutulmuş neşterin künt kenarını kullanarak SEZ'yi ya bütün bir parça olarak aktarın ya da 2-4 parçaya ayırarak bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Doku MS dışında başka bir analiz türü için kullanılacaksa, doku örneğini bunun yerine uygun kaba (örneğin, 96 kuyu plakası) aktarın.
   NOT: Tamamen donmuş dokunun kesilmesi, dokunun hızla kopmasına ve kaydıraktan düşmesine neden olabilir. Tamamen çözülmüş dokuyu kesmek dokunun parçalanmasına yol açar. Dokunun ne tamamen donmuş ne de tamamen çözülmüş olduğundan emin olun.

Yukarıdaki adımları takip ederken, mikrosantrifüj tüplerindeki doku örnekleri MS numunesi hazırlamaya hazır ve uyumludur. Numune hazırlamadan sonra, fare başına SEZ veya MEZ örneği başına ~ 5-7 μg peptit elde ettik. Bununla birlikte, peptitlerin son miktarları MS hazırlama yöntemine bağlı olabilir. Aşağıdaki proteom karşılaştırmalarında, peptit spektrumu her doku bölgesi için oluşturulan peptit spektrumu kütüphaneleri ile hesaplamalı olarak eşleştirilmesiyle protein tanımlama ve nicelik derinliği (örnek başına 500-1.000 protein) arttırılmıştır25,27. Özellikle, peptit spektrum kütüphanelerinin oluşturulması için burada kullanılan kayıpsız nano fraksiyonasyon yöntemi şu anda ticari olarak mevcut değildir. Ham MS verileri MaxQuant yazılımı28 kullanılarak analiz edildi ve milyar aralık başına parçalarda kütle doğruluğu elde edildi29. Max Quant ortamı MS çalıştırmaları arasında eşleştirmeye izin verir. Protein bolluğu etiketsiz bir niceleme algoritması kullanılarak ölçüldü30. İmmünhistokimyasal lekeleme taze donmuş dokularda yapıldı ve daha önce bildirildiği gibi yapıldı25 (bkz. Malzeme Tablosu).

Kriyo-kesit diseksiyonu
Yetişkin farelerin tam SEZ ve MEZ'i (n = 4) CSD kullanılarak elde edilmiştir (bkz. Şekil 1 ve protokol). Somatosensör korteks (Cx) cerrahi makasla parçalanmış. Ek 4 fare aynı şekilde parçalandı; bununla birlikte, parçalanmış doku, bireysel örneklerde protein tanımlama ve nicelemenin artması için proteome kütüphanesini (10.923 tanımlanmış protein) oluşturmak için bölge başına bir örnek halinde birikmiştir25. Dört ayrı örnekte,(ortalama ± SD) SEZ'de 6.673 ± 317.4 protein, MEZ'de ise 6.747 ± 37.7 protein ölçülmektedir. Tüm MS proteomik verileri PRIDE31 ortak deposu aracılığıyla ProteomeXchange Konsorsiyumu'na yatırıldı ve burada bildirilen proteomların katılım numarası ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org).

Wholemount diseksiyonu ile karşılaştırma
Wholemount diseksiyonu standart bir protokole göre gerçekleştirildi26. Wholemount diseksiyonu, CSD25'e kıyasla benzer sayıda protein (SEZ için yaklaşık 6.000 ve Cx için 6.000, n = grup başına 4) ortaya çıkardı. SEZ için CSD kullanmanın amaçlanan iyileştirmelerinden biri, tam bir diseksiyon protokolü yerine, potansiyel striatal kontaminasyonun azaltılmasıdır. Başka bir bölgeden doku ile kontamine olmuş SEZ örneklerinde, tespit edilen aday proteinler, ilgi alanı ve kontaminatörden önemli zenginleşme neden olabileceği için bir bölgeye tahsis edilemez. İmmünohistokimyasal olarak, striatumun miyelin ilişkili glikoprotein (MAG) pozitif miyelin bakımından zengin iç kapsülleri allmount örneklerde ancak nadiren CSD örneklerinde tanımlanmıştır (Şekil 2A). Tümmount numunelerdeki striatal kontaminasyon, SEZ'deki miyelin proteinlerinin somatosensör korteks (Cx) Gri Madde (GM) örneklerine kıyasla zenginleştirilmesi belirlenerek doğrulanabilir (Şekil 2B). Cx GM'nin büyük bölümlerinin, özellikle üst Cx katmanlarının unmyelinated32 olduğunu unutmayın.

Büyük lif demetleri striatumdan geçerken, bu bölge tarafından kirlenme, miyelin proteinlerinin Cx'e kıyasla zenginleşmesine neden oldu. SEZ örneklerinde striatal kontaminasyon için belirteç olarak kullanılan miyelin proteinleri miyelin temel proteini (MBP), miyelin ilişkili glikoprotein (MAG), proteolipid protein 1 (Plp1) ve 2',3'-siklik-nükleotid 3'-fosfoditeraz (Cnp) şeklindeydi. Tüm miyelin-marker proteinleri SEZ'de Cx ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde zenginleştirilmiştir. Striatum33'ün proteomik verileri, tüm diseksiyonun SEZ örneklerindeki miyelin proteinlerinin zenginleştirilmesinin striatal doku ile kontaminasyondan kaynaklandığı hipotezini desteklemektedir. Bu nedenle, CSD, striatal doku (kompakt miyelin bakımından zengin) ile kontaminasyonu, tam bir diseksiyona kıyasla büyük ölçüde önledi.

Ayrışmayan dokunun tarafsız proteom analizi ilginç hücre dışı proteinleri ortaya çıkarmaz. CSD kullanılarak yapılan iyileştirilmiş diseksiyon ile hücre dışı ilişkili proteinler, numunelerde tüm binek örneklere kıyasla önemli ölçüde zenginleştirilmiştir (Şekil 2C, ek açıklama zenginleştirme testi). CSD ve kepekli diseksiyon, gen ontolojisi (GO) terimlerinin "hücre dışı veziküler eksozom" ve "hücre dışı bölge kısmının" karşılaştırılabilir bir zenginleştirilmesini gösterir. Bununla birlikte, GO terimi "Matrisome ilişkili" CSD'de tam diseksiyondan biraz daha zenginleştirilmiştir. Buna göre, ECM çapraz bağlayıcı enzim ve yakın zamanda keşfedilen nörogenez düzenleyici transglutaminaz-2 (Tgm2), CSD25 kullanan Cx'e kıyasla SEZ'de zenginleştirilmiş olarak bulundu. Buna karşılık, wholemount diseksiyonu ile elde edilen SEZ ve Cx örnekleri arasında bir fark bulunmadı (Şekil 2D). Striatum33'ün proteomik verileri, nörogenez düzenleyicisi Tgm2'nin tam diseksiyonla tespitinin striatal doku ile kontaminasyon tarafından engellendiğinin hipotezini desteklemektedir. Bu nedenle, genel olarak, kriyo-kesit diseksiyonu, nişe özgü proteom analizi için standart diseksiyonda başarılı ama aynı zamanda gerekli bir gelişmedir.

Lazer yakalama-mikroskopisi ile karşılaştırıldığında
SEZ'nin ön yarısı ve 3 yetişkin farenin MEZ'i LCM için elde edildi (Şekil 3A). Genel olarak, LCM yöntemi, özellikle doku pertürbasyonu ve verimliliği ile ilgili bazı dezavantajlar sergiler. Diseksiyon mikroskobu altında ilgi çekici bölgeyi görselleştirmek için, büyüme faktörleri, sitokinler veya enzimler gibi ECM düzenleyicileri gibi küçük veya çözünür proteinleri yıkamak için arka plan boyama gereklidir. Ayrıca, slaytlar lazerle çıkarma sırasında oda sıcaklığında çeşitli zamanlar harcar. Ayrıca, lazerin kendisi ilgi çekici proteinleri denatüre edebilir.

CSD, diseksiyonu gerçekleştirmek için gereken zaman ve çaba konusunda LCM'ye göre önemli bir avantaja sahiptir: protokolün 1. bu adım olmadan, ventrikül duvarları yapışma olmaya devam eder ve MEZ ve SEZ örneklerinin ayrılmasını zorlaştırır. CSD bölümlerinin (100 μm) LCM bölümlerinin maksimum kalınlığından (15 μm), adım 2 (beynin bölümlenimi) ve 3. adımdan (MEZ ve SEZ'yi her koronal bölümden çıkarmak) LCM için en az 6-7 kat daha uzun süre alacağı göz önüne alındığında. Gerekli arka plan boyama ve lazer mikroskobun kurulması ek zaman alacaktır. Burada, 3 hayvanın SEZ ve MEZ'inin% 50'sini LCM ile hasat etmek üç kat daha uzun sürdü, CSD tarafından 4 hayvanın SEZ ve MEZ'inin% 100'üne kıyasla, CSD'nin sekiz kat hız avantajını sağladı. Özetle, LCM sadece önemli miktarda ek çaba gerektirmekle kalmaz, aynı zamanda doku, sonraki analizlerle oluşturulan verilerin dinamiklerini ve güvenilirliğini tehlikeye atabilecek önemli ölçüde daha uzun bir manipülasyon ve sıcaklık değişikliklerine maruz kalır.

CSD'nin MS sonuçları lazer yakalama mikroseksiyonundan (LCM) elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldı. Her iki veri kümesi de CSD örnekleri havuza alarak oluşturulan proteomik kitaplıkla eşleştirildi. Ortalama olarak LCM, SEZ ve medial ventrikül bölgesinde sırasıyla 238,7 bireysel protein ± 270,0 ± 3,441 ve 3,613 protein verdi (Şekil 3B). Protein tanımlamadaki dikkat çekici fark göz önüne alındığında, ana bileşen analizi (PCA) diseksiyon yöntemine göre ayrı ayrışma göstermiştir (bileşen 1: %62,7, gösterilmemiştir). Bileşen 2, LCM örnekleri arasında SEZ ve MEZ için en büyük ayrımı gösterdi (%8,5, Şekil 3C). Bileşen 3 ayrıca LCM ve CSD'yi ayırıyor gibi görünüyor; ancak bu fark, tanımlanan proteinlerin sayısından (%6,4) ziyade yönteme dayalı farklılıklardan neden olabilir. Bununla birlikte, genel bölgesel ayrım kriyo-diseksiyon verileri için çarpıcı bir şekilde farklı kaldı ve LCM'den çok daha iyi. Veri dinamiklerindeki bu tutarsızlık, lazer diseksiyonu sırasında numunelerin oda sıcaklığında harcadığı farklı zamanlardan veya küçük doku miktarlarının sonraki proteomik protokollerde ve kütle spektrometresi ölçümlerinde değişkenliğe daha yüksek duyarlılığından neden olabilir.

ECM'nin proteom profilindeki farklılıkları aramak için SEZ ve MEZ için CSD ve LCM arasında 2D ek açıklama zenginleştirme testi yapıldı (Şekil 3D). LCM ve CSD örnekleri arasındaki GO terimlerinin göreli zenginleştirilmesinin hesaplanması, eşit olmayan doku miktarına ve diseksiyon protokolündeki farklılıklara rağmen ECM protein kümelerinin göreli proteome dinamiklerinin iki yöntem arasında karşılaştırılmasına olanak tanır. Arsalar LCM ve CSD arasında iyi bir korelasyon ortaya koymaktadır. "Hücre dışı bölge kısmı" ve "hücre dışı membran bağlı organel" ek açıklamaları hem yöntemlerde hem de bölgelerde benzer şekilde zenginleştirilmiştir. Bu nedenle, LCM'nin artan zaman talebi, ECM ile ilişkili proteinler için nispeten daha yüksek bir duyarlılıkla telafi edilmiş görünmemektedir. Bunun yerine CSD, nörogenez ve SEZ ile ilişkili ECM proteinleri Tgm2, Thrombospondin-4 (Thbs4), S100a6 ve Tenacin-C (Tnc) için örnek verileri karşılaştırırken daha sağlam tanımlama/niceleme sağlar (Şekil 3E). TnC durumunda, tüm örneklerde ölçülse de, MEZ'e kıyasla SEZ için yalnızca CSD zenginleştirme görüntüledi. Yine de, SEZ ile ilişkili bazal membran proteinleri Nidogen-1 (Nid1), Laminin alt birimi beta-2 (Lamb2) ve bodrum membran spesifik heparan sülfat 1proteoglikan çekirdek proteini (Hspg2)35, LCM örneklerinde SEZ'de (MEZ'e kıyasla) CSD örneklerine göre daha da sağlam bir zenginleştirme gösterdi (gösterilmedi). Bu nedenle, CSD, SEZ karakterizasyonu için doğru ve derin nicel proteom sağlayan doku örneklerini, tehlikeye atılmış doku bütünlüğü veya protein kaybı konusunda endişelenmeden makul bir zaman diliminde sağlayabilir.

İstatistik
Perseus ortamında istatistiksel test, 2D ek açıklama zenginleştirme testleri ve PCA yapıldı. Her yöntem için en az bir örnekte geçerli bir değer tespit edilmişse proteinler analize dahil edildi. Protein bolluğu ve sayı karşılaştırmaları veri analiz yazılımı kullanılarak görselleştirilmiştir ( bkz. Malzeme Tablosu). Protein karşılaştırmaları için yanlış keşif oranının (FDR) permütasyona dayalı kontrolü (FDR 0,05 olarak ayarlanmıştır, 250 randomizasyon) kullanıldı. 2D ek açıklama zenginleştirme testleri36 için, görüntülenen GO terimleri önemli ölçüde zenginleştirilmiştir (FDR, Benjamini-Hochberg FDR kontrol yöntemi kullanılarak 0,02 olarak ayarlanmıştır).

Şekil 1: Kriyo-Kesit-Diseksiyon yöntemi. (A) İlgi alanına genel bakış: nörojenik SEZ ve nörojenik olmayan MEZ ile lateral ventrikül. Nöroblastlar Dcx ile immünositlendi. (B) Ob, ön kutup, korteks ve korpus callosumun ventriküllerin ve koroid pleksus üzerindeki adım adım çıkarılması: 1. diseksiyon ortamına yerleştirme, 2. OB'nin çıkarılması, 3. korteksin ön direğinin çıkarılması, 4. ventrikül üst kısmının sagittal kesileri, 5. ventrikül üst kısmının çıkarılması, 6. ventrikül duvarlarının yayılması. (C) Taze donmuş fare beyninin 100 μm koronal dilimi, (1.) öncesi ve (2.) ventrikül duvarlarının buz gibi bir neşterle çıkarılmasından sonra. Ölçek çubukları = 4 mm (D) Lateral ventrikül koronal bir bölümün boyanma (GFAP: yeşil; DAPI: mavi), CSD ile parçalanmış SEZ ve MEZ'i gösterir. Ölçek çubukları = 300 μm (A), 200 μm (D). Kısaltmalar: CSD = kriyo kesit diseksiyonu; SEZ = subependymal bölge; MEZ = medial ependymal bölge; Dcx = Çiftcortin; OB = koku ampulü; GFAP = glial fibril asidik protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bütün diseksiyona kıyasla kriyo-kesit diseksiyonu ile üstün diseksiyon-hassasiyet. (A) Wholemount diseksiyonu ile elde edilen bir SEZ örneğinin immünohistokimyasal görüntüsü (solda). Miyelin bakımından zengin striatal dokunun dahil edilmesi MAG (yeşil) karşısında lekelenerek görselleştirilir. CSD ile parçalanmış bir SEZ'nin boyanma (sağda). CSD'de, hemen hemen tüm striatal miyelin (MAG'a karşı boyama, yeşil) örnek şeritten çıkarılır. Çekirdekler DAPI (mavi) kullanılarak görselleştirildi. (B) SEZ ve Cx'teki miyelin işaretleyici zenginleştirmesinin wholemount'tan karşılaştırılması (MBP: p = 0.0074; MAG: p = 0.0016; Plp1: p = 0.0011; CNP: p = 0.0029) ve CSD (MBP: p = 0.0667; MAG: p = 0.0236; Plp1: p = 0.3420; CNP: p = 0.1842). (C) Wholemount-SEZ ile CSD-SEZ örneklerini karşılaştıran 2D ek açıklama zenginleştirme testi. HÜCRE DIŞI alan ve Matrisome ile ilişkili GO terimleri, CSD verilerinde tüm biniş verilerinden daha zenginleştirilmiştir. (D) NSC regülatörü Tgm225'in protein bolluğu, tam diseksiyon ve CSD için çizilmiştir. Tgm2, CSD'deki Cx ile karşılaştırıldığında SEZ'de önemli ölçüde zenginleştirilmiştir (CSD: p = 0.0029; Kepenk: p = 0.1775). B ve D için: Referans olarak, Sharma ve ark.33'ten gelen proteom verileri, tümmount ve CSD örneklerinde görüntülenen karşılık gelen proteinler için çizilmiş striatum ve korteks ölçümleri ile. Ölçek çubukları = 200 μm (A). Kısaltmalar: CSD = kriyo kesit diseksiyonu; SEZ = subependymal bölge; MAG = miyelin ilişkili glikoprotein; Cx = somatosensör korteks; MBP = miyelin temel proteini; Plp1 = proteolipid-protein 1; CNP = 2',3'-siklik-nükleotid 3'-fosfodiesteraz; GO = gen ontolojisi; NSC = nöral kök hücre; Tgm2 = tranglutaminaz 2; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; LFQ = etiketsiz miktar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: LCM'ye kıyasla kriyo kesit diseksiyonu ile hücre dışı protein nicelemesi geliştirilmiştir. (A) SEZ ve MEZ'in lazerle yakalanmasından önce ve sonra bir lateral ventrikülün cresyl mor boyanması (solda). Karşılaştırma için, SEZ ve MEZ'in CSD kesiği (sağda). Ölçek çubukları = 150 μm. (B) CSD ve LCM'den alınan SEZ ve MEZ örneklerinde tespit edilen protein sayısının karşılaştırılması. Veriler, CSD ve LCM'yi karşılaştıran SEZ ve MEZ örneklerinin ortalama ± SD. (C) Ana bileşen analizi olarak sunulur (bileşen 2: farkın% 8,5'i; bileşen 3: % 6,4). (D) Kriyo-kesit ve lazerle parçalanmış MEZ (Üst) ve SEZ'nin (Alt) 2D ek açıklama zenginleştirilmesi. GO terimleri hücre dışı organel ve hücre dışı bölge kısmı önemli ölçüde zenginleştirilmiştir (kırmızı noktalar). (E) LCM için SEZ ve MEZ'de hücre dışı SEZ ilişkili marker proteinlerinin bolluğu (Tnc: p = 0.3789) ve CSD örnekleri (Tgm2: p = 0.2940); S100a6: p = 0,0218; THBS4: p = 0.3941; Tnc: p = 0.0004). Kısaltmalar: CSD = kriyo kesit diseksiyonu; LCM = lazer yakalama-mikro disseksiyon; SEZ = subependymal bölge; MEZ = medial ependymal bölge; GO = gen ontolojisi; Tnc = Tenacin-C; Tgm2 = transglutaminaz 2; S100a6 = S100 kalsiyum bağlayıcı protein A6; THBS4 = trombospondin-4; LFQ = etiketsiz miktar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.