Açık Kaynaklı Araç Seti: Sinir Kaydı için Tezgah Üstü Karbon Fiber Mikroelektoğr Dizisi

Nörobilim araştırmalarının çoğu elektrofizyoloji (ePhys) kullanarak sinir sinyallerinin kaydedilmelerine dayanır. Bu sinir sinyalleri, sinir ağlarının işlevlerini ve beyin makinesi ve periferik sinir arayüzleri gibi yeni tıbbi tedavileri anlamak için çok önemlidir1,2,3,4,5,6. Periferik sinirleri çevreleyen araştırmalar, özel yapım veya ticari olarak kullanılabilen nöral kayıt elektrotları gerektirir. Mikron ölçekli boyutlara ve kırılgan malzemelere sahip nöral kayıt elektrotlarına özgü aletler, imal etmek için özel bir beceri ve ekipman seti gerektirir. Belirli son kullanımlar için çeşitli özel problar geliştirilmiştir; ancak bu, deneylerin şu anda mevcut ticari problar etrafında tasarlanması veya bir laboratuvarın uzun bir süreç olan özel bir prob geliştirilmesine yatırım yapması gerektiği anlamına gelir. Periferik sinirdeki çok çeşitli sinir araştırmaları nedeniyle, çok yönlü bir ePhys probuna yüksek talep vardır4,7,8. İdeal bir ePhys probu, küçük bir kayıt sitesi, düşük empedans9 ve bir sistemde uygulama için finansal olarak gerçekçi bir fiyat ^{noktasına sahiptir3}.

Mevcut ticari elektrotlar, sinirin dışında oturan extraneural veya manşet elektrotları (Nöral ^Manşet10, MicroProbes Sinir Manşet ^Elektrodi11) veya sinire nüfuz eden ve ilgi alanı içinde oturan intrafassiküler olma eğilimindedir. Bununla birlikte, manşet elektrotları liflerden daha uzakta oturdukça, yakındaki kaslardan ve hedef olmayabilecek diğer fasiküllerden daha fazla gürültü alırlar. Bu problar aynı zamanda siniri daraltma eğilimindedir, bu da doku iyileşirken glial hücrelerin ve skar dokusunun elektrot arayüzünde biyofouling-birikmesine yol açabilir. İntrafastiküler elektrotlar (^LIFE12, ^TIME13 ve Utah Arrays14 gibi) fasikül seçiciliğinin faydasını ekler ve makine araları için sinyalleri ayırt etmede önemli olan iyi sinyal-gürültü oranlarına sahiptir. Bununla birlikte, bu probların biyouyumlulukla ilgili sorunları vardır ve sinirler zamanla deforme hale gelir3,15,16. Ticari olarak satın alındığında, her iki prob da deneye özgü özelleştirme seçeneği olmayan statik tasarımlara sahiptir ve daha yeni laboratuvarlar için maliyetlidir.

Diğer problar tarafından sunulan yüksek maliyet ve biyouyumluluk sorunlarına yanıt olarak, karbon fiber elektrotlar nörobilim laboratuvarlarının özel ekipmana ihtiyaç duymadan kendi problarını oluşturmaları için bir yol sunabilir. Karbon fiberler, düşük hasar yerleştirilmesine izin veren küçük bir form faktörüne sahip alternatif bir kayıt malzemesidir. Karbon fiberler, yoğun temiz oda işlemesi olmadan ^{silikon17,18,19'dan} daha iyi biyouyumbilite ve önemli ölçüde daha düşük skar tepkisi sağlar5,13,14. Karbon fiberler esnek, dayanıklı, diğer biyomalzemelerle kolayca entegre ^edilebilir19 ve sinirden nüfuz edebilir ve ^{kaydedebilir7,20}. Karbon fiberlerin birçok avantajına rağmen, birçok laboratuvar bu dizilerin manuel imalatını zorlu buluyor. Bazı ^gruplar21 karbon fiberleri toplu olarak daha büyük (~200 μm) bir çapa neden olan demetler halinde birleştirir; ancak, bizim bilgimize göre, bu demetler sinir olarak doğrulanmamıştır. Diğerleri, yöntemleri temiz oda fabrikasyon karbon fiber ^{kılavuzları22,23,24} ve dizilerini doldurmak için ekipman gerektirse de, kendi dizilerini doldurmak için individüated karbon fiber elektrot dizileri üretmiştir17,23,24. Bunu ele almak için, laboratuvar tezgahında gerçekleştirilebilecek ve doğaçlama değişikliklere izin veren bir karbon fiber dizisi imal etme yöntemi öneriyoruz. Elde edilen dizi, özel fiber doldurma araçları olmadan bölünmemiş elektrot uçlarını korur. Ayrıca, araştırma deneyinin ihtiyaçlarına uygun olarak birden fazla geometri sunulmaktadır. Önceki çalışmalardan 8,17,22,25 inşa eden bu makale, gerekli minimum temiz oda eğitim süresi ile çeşitli dizi stillerini manuel olarak oluşturmak ve değiştirmek için ayrıntılı metodolojiler sağlar.

Tüm hayvan prosedürleri Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Karbon fiber dizi seçimi

1. Şekil 1'de gösterilen üç tasarımdan birinden basılı bir devre kartı (PCB) seçin.
   NOT: Bu protokol için Flex Arrays odak noktası olacaktır.
   1. Chestek Lab web sitesindeki (https://chestekresearch.engin.umich.edu) PCB tasarımlarına ücretsiz olarak bakın ve bir PCB baskı evi aracılığıyla baskı için gönderilmeye ve siparişe hazır olun.
   2. Belirli deneysel kurulum için çalışacak bağlayıcıyı seçmenize yardımcı olmak için her pano için bağlayıcıların ve bunların belirtimlerinin bir özeti için Tablo 1'e bakın.

2. Konektörün devre kartına lehimlenerek

1. Bir lehim demirini 315 °C'ye (600 °F) ayarlayın.
2. PCB'deki tüm lehim pedlerine akı uygulayın.
   NOT: Bir tüp içindeki akı pedler boyunca sıkılabilirken, bir tenceredeki akı, akıyı tüm pedlere liberal olarak bulaştırarak pamuk uçlu bir aplikatörnün ahşap ucuyla uygulanabilir.
3. Flex Dizisinin arka pedlerinde küçük lehim höyükleri oluşturur (Şekil 2A).
4. Konnektör pimlerinin alt sırasını lehim pedlerinin arka sırasına lehimle (Şekil 2B).
   NOT: Chestek laboratuvarı tarafından sağlanan tüm kart tasarımları, konektörlerin belirlenen tahtalarla tam olarak eşleşeceği şekilde tasarlanmıştır.
   1. Bunu yapmak için, konektörün her iki tarafındaki pimleri lehim höyüklerine kolay erişimle lehimleyin. Güvenli hale döndükten sonra, arkadaki kalan bağlantıları lehimlemek için lehim demir ucunu ön pimler arasına hafifçe itin.
      NOT: Pimlerin arka satırı güvenli hale yüklendikten sonra, konektörün geri kalanı atanan lehim pedi üzerindeki her pim ile hizalanır.
5. Her pime az miktarda lehim uygulayarak ön pim sırasını tahtaya lehimler. Lehimleme hızlı bir şekilde gerçekleşmezse ek bir akı tabakası uygulayın.
   1. Fazla akıyı% 100 izopropil alkol (IPA) ve kısa bir kıl fırçası ile temizleyin.
6. Lehimli bağlantıları, pimlerin üzerine 23 G iğne ve 1 mL şırınga yerleştirilmiş şırınga kullanarak gecikmeli set epoksi (Şekil 2 C,D) ile kapsülle. Epoksiyi şırınnadan yavaşça geçirin, böylece bağlantılara ve bağlantılar boyunca akar.
   1. Tahtayı gece boyunca bırakın, böylece gecikmiş set epoksi tedavi edebilir.
      NOT: Gecikmeli set epoksisi için ürün kesici ucu 30 dakika içinde iyileştirdiğini belirtirken, bir gecede bırakılması daha kararlı bir bağlantı oluşmasını sağlar.
7. Tahtanın arka tarafına küçük bir gecikmeli set epoksi hattı döşeyerek ve bunu konektörün kenarlarına çekerek kartın arka tarafını konektörün kenarlarına sabitleyin.
   1. Tahtayı bir gecede tedaviye bırakın.
      NOT: Bu noktada, dizileri depolayın veya yapıya devam edin. Yapıda duraklatıyorsanız, dizileri oda sıcaklığında temiz ve kuru bir kutuda saklayın.

3. Lif popülasyonu

1. Ucu dizinin izleri arasına sığacak şekilde çekilmiş bir cam kılcal damar kesin (Şekil 3A).
   1. Cam çekme ve filament kullanarak aşağıdaki ayarları kullanarak kılcal damarlar yapın: Isı = 900, Çekme = 70, Hız = 35, Zaman = 200, Basınç = 900.
      NOT: Sayılar birikmez ve bu cihaza özgüdir ( Bkz. Malzeme Tablosu).
2. Plastik bir tabakta küçük, ~1:1 gümüş epoksi oranını kepçek ve kepçe için kullanılan çubukları kullanarak karıştırmak için iki pamuk uçlu aplikatörün ahşap uçlarını (gümüş epoksinin her bir parçası başına bir tane) kullanın. Karıştırdıktan sonra aplikatörleri atın.
3. Karbon fiber demetinin ucundan jilet kullanarak bir yazıcı kağıdı parçasına 2-4 mm kesin. Demetteki, birbirinden ayrılması zor olan lifleri kolayca ayırmak için, lamine bir kağıt parçasını demetin üstüne hafifçe çekin.
   NOT: Lamine kağıt parçası, statikleri liflere aktarır ve bu da kendiliğinden ayrılır.
4. Cam kılcal damar ile tahtanın bir tarafına diğer tüm iz çiftleri arasına gümüş epoksi uygulayın (Şekil 3B).
   1. Çekilen bir kılcal damarın ucuna küçük bir damla epoksi alın. Tahtanın ucundaki diğer tüm izler arasında yavaşça uygulayın ve boşluğu doldurun.
      NOT: Boşluk, komşu izlere dokunmak için taşmadan iki izlemenin üstüne doldurulmalıdır. Her izleme bir kanala bağlıdır. Bu epoksi popülasyonu yöntemi, her lifin ona bağlı iki kanala sahip olacağı anlamına gelir. Bunun nedeni, iki izlemenin daha iyi fiber hizalamaya izin vermesi ve kanaldaki artıklığın elektrik bağlantısının sağlanmasına yardımcı olmasıdır.
5. Her epoksi izine bir karbon fiber yerleştirmek için Teflon kaplı cımbız kullanın (Şekil 3C).
6. Karbon fiberleri ayarlamak için temiz çekilmiş bir kılcal damar kullanın, böylece Flex Array panosunun sonuna diktirler ve epoksinin altına gömülüdürler (Şekil 3D).
7. Dizileri, bloğun kenarına sarkan fiber uçlu ahşap bir bloğa yerleştirin.
   NOT: Arka ucun ağırlığı diziyi blokta tutacaktır.
8. Gümüş epoksiyi iyileştirmek ve lifleri yerine kilitlemek için ahşap bloğu ve dizileri 140 °C'de 20 dakika pişirin.
9. Panonun diğer tarafı için 3.4-3.8 adımlarını yineleyin.
   NOT: Diziler herhangi bir pişirme adımından sonra saklanabilir; ancak, depolama kutularından gelen statik, kartı doldururken çok az gümüş epoksi uygulanırsa liflerin tahtadan çekilmesine neden olabilir.
   1. Bir kutunun içinde yükseltilmiş bir yapışkan platformu oluşturun, böylece kartın büyük kısmı yapışkana yapışabilir ve fiber kırılmasını önlemek için kartın fiber uçlarının kutunun içinde askıya alınmasına izin verin. Oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Lifler depolama sırasında tahtadan çekilirse, epoksiyi temiz çekilmiş bir cam kılcal damarla izlerden kazıyın ve lifleri değiştirmek için 3.1-3.8 adımlarını tekrarlayın. Bu noktadan sonra, lif kırılmasını önlemek için diziler bu şekilde askıya alınmış liflerle saklanmalıdır.

4. Karbon fiberleri yalıtmak için ultra mor (UV) epoksi uygulamak

1. Temiz bir kılcal damar kullanın ve tahtanın bir tarafındaki açıkta kalan izlere küçük bir damlacık (~0,5 mm çapında UV epoksi) uygulayın (Şekil 4A). İzler tamamen kapatılana kadar UV epoksi damlacıkları eklemeye devam edin.
   NOT: UV epoksisinin pcb'nin ucundan geçen karbon fiberlere geçmesine izin vermeyin.
2. UV epoksisini UV kalem ışığı altında 2 dakika boyunca tedavi ettinin (Şekil 4B).
3. Panonun diğer tarafı için 4.1-4.2 adımlarını yineleyin.
4. Stereoskop retikül ve cerrahi makas kullanarak lifleri 1 mm'ye kesin.
   NOT: Diziler, sonraki adımlara devam etmeye hazır olana kadar bu noktada depolanabilir. Karbon fiberleri kutunun kendisinden uzaklaştıracak bir kutuda saklanmalıdırlar. Diziler süresiz olarak oda sıcaklığında saklanabilir.

5. 1 kHz empedans taramaları ile elektrik bağlantılarının kontrol edilmesi (Şekil 5)

1. Karbon liflerini 1 mm'lik fosfat tamponlu saline (PBS) batırın.
2. Devreyi tamamlamak için gümüş-gümüş klorür (Ag| AgCl) referans elektrodu ve paslanmaz çelik çubuk (karşı elektrot).
   1. Beher kelepçesi kullanarak Ag| 1x PBS'deki AgCl elektrot ve kullanılan empedans sisteminin referansı ile bağlayın.
   2. Bir beher kelepçesi kullanarak, paslanmaz çelik çubuğu 1x PBS'de askıya alın ve kullanılan empedans sisteminin karşı elektrot girişine bağlanın.
3. Tek bir sinüs dalga hızında 0,01 _Vrms'de 1 kHz tarama frekansı olarak ayarlanmış bir potentiostat kullanarak her fiber için 1 kHz empedans taraması çalıştırın. Kaydedilen sinyali stabilize etmek için her taramanın başında 5 sn için potentiostat'ı 0 V olarak ayarlayın. Ölçümleri potentiostat ile ilişkili yazılım aracılığıyla kaydedin.
   NOT: Ölçümler yapının herhangi bir noktasında yapılabilir; ancak, sadece yalıtımdan önce ve uç hazırlama sırasında gereklidirler. Tablo 2 , kullanıcının başvurusu için her yapı adımından sonra tipik empedans aralıklarını 1 kHz olarak listeler.
4. Lifleri üç kez küçük bir kabın içine batırarak deiyonize (DI) suda durulayın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
   NOT: Kullanıcı bir sonraki adıma geçinene kadar diziler depoda bırakılabilir.

6. Parylene C İzolasyonu

NOT: Parylene C, oda sıcaklığında diziler üzerinde biriktirilebildiği ve son derece konformel bir kaplama sağladığı için karbon fiberler için yalıtım malzemesi olarak seçilmiştir.

1. Çiftleşme bağlayıcısını kullanarak Flex Array bağlayıcısını maskele.
2. 8-12 diziden oluşan bir toplu işlemi, tek bir çalıştırmada yalıtılabilmeleri için yükseltilmiş yapışkan platformlu bir depolama kutusuna yerleştirin. Dizileri, dizinin bağlayıcı ucunun, liflerin yapıştırıcıya yapışmasını ve çekilmesini önlemek ve lifler üzerinde düzgün bir Parylene kaplaması sağlamak için dizinin fiberli ucu çıkıntılı yapışkan platformda olacak şekilde yerleştirin (Şekil 6).
3. Parylene C biriktirme sistemindeki dizileri, kullanılan bireysel temiz oda tarafından tanımlandığı şekilde uygun kişisel koruma ekipmanı (KKD) giyerek temiz bir odada 800 nm kalınlığa kadar kapla.
   NOT: Burada KKD temiz oda ayakkabıları, takım elbise, baş örtüsü, gözlük, maske ve lateks eldiven olarak tanımlanmıştır. Bunun temiz bir odaya girmek için standart KKD olduğu belirtilmelidir. Bu adım bir Ücret karşılığında bir Parylene kaplama şirketine dış kaynaklı olabilir; ancak, ticari bir hizmet aynı anda daha fazla diziyi kaplayabilir. Her Parylene C biriktirme sistemi farklı güvenlik önlemlerine sahip olabilir. Kullanıcı güvenliğini sağlamak için kullanmadan önce teknisyene başvurun.
4. Maske olarak kullanılan çiftleşme bağlayıcısını Flex Array'den çıkarın.
5. Dizileri kullanıma hazır olana kadar depolama için yeni bir kutuya yerleştirin.

7. Uç hazırlama yöntemleri

NOT: Bu bölümdeki iki uç hazırlığı lifleri kesmek için lazer kullanır. Kullanılan dalga boylarına dayanıklı gözlükler gibi uygun KKD, lazer kullanılırken her zaman giyilmeli ve lazerin çevresindeki diğer laboratuvar kullanıcıları da KKD'de olmalıdır. Bu adımlarda listelenen fiber uzunlukları önerilen uzunluklar olsa da, kullanıcılar ihtiyaçlarına uygun herhangi bir uzunluğu deneyebilirler. Tek başına makas kesimi ^elektrot25'i yeniden açığa çıkarmak için yeterli olmayacağından, kullanıcı aşağıdaki uç hazırlama yöntemlerinden birini seçmelidir.

1. Neodimyum kubbeli iyttrium alüminyum garnet (Nd:YAG) lazer kesim
   1. Lifleri cerrahi makasla 550 μm'ye kesin.
   2. Parylene C'nin altındaki karbonun yeniden açığa çıkması için liflerin ucundan 50 μm kesmek için 532nm Nd:YAG darbeli lazer (5 mJ / darbe, 5 ns süre, 900 mW) kullanın (genellikle 2-3 darbe alır).
      1. Bu lazer sistemiyle birlikte gelen dahili stereoskopu kullanarak fiber uçları hizalayın.
         NOT: Bu sistem, kullanıcının fiberin ucunu kapsayacak şekilde bir pencereyi hizalamasını sağlar (burada, 50 μm x 20 μm (yükseklik x genişlik)) kullanılmıştır.
      2. Doğru ve hassas bir kesim için stereoskopu 500x büyütmede fiberin ucuna odakla.
         NOT: Parilen C, uçtan hafifçe (<10 μm) alev alacak ve kör, silindirik bir uç bırakacaktır.
2. Blowtorch Bileme25,26,27
   1. Lifleri cerrahi makasla 300 μm'ye kesin.
   2. Diziyi deiyonize su kabına batırın, konektör tarafı aşağı doğru ve az miktarda macunla kabın dibine sabitlenin.
   3. Lifleri su yüzeyiyle hizalamak için bir kalem kamera kullanın, böylece lifler su yüzeyine zar zor dokunur.
   4. Bütane üflemeli bir alevi 3-5 mm'ye ayarlayın ve lifleri keskinleştirmek için ileri geri hareketle liflerin üstünden çalıştırın.
      NOT: Lif uçları, alev üzerlerinden geçtiğinde turuncu renkte parlayacaktır.
   5. Diziyi macundan çıkarın ve stereoskop altında 50x büyütmenin altındaki sivri uçlar için inceleyin.
      NOT: Sivri uçlara uyulursa, daha fazla pürmüze gerek yoktur. İpuçları künt görünüyorsa, 7.2.2-7.2.5 adımlarını yineleyin.
3. UV lazer ^kesim28
   NOT: UV Lazer, Flex Array karbon fiberlerinin perdesinden daha büyük olan UV Lazer'in geniş odak noktası nedeniyle şu anda sadece sıfır ekleme kuvveti (ZIF) ve Geniş Kart tasarımlarında kullanılabilir.
   1. Karbon fiberleri cerrahi makasla 1 mm'ye kesin.
   2. Ortogonal olarak yapılandırılmış üç motorlu aşamaya bir UV lazer yapıştır.
      NOT: UV lazer, 1,5 W çıkış gücüne ve 405 nm dalga boyuna sahip çok modelli bir Indium Galyum Nitrür (InGaN) yarı iletkenidir.
      1. Lazerin hızlı ve etkili hizalama ve kesme için sürekli bir ışına sahip olduğundan emin olun.
   3. Lazerin üzerinden geçmesi için elektrotların düzlemini sabit tutmak için diziyi yerinde sabitleyin. Dizinin lazerden uygun bir mesafede tutulmasını sağlayın, böylece lifler lazerin odak noktasıyla ışık alacaktır. Bunu yapmak için, lazere daha düşük bir güç sağlayın ve mesafeyi ^fiber28'e en iyi şekilde odaklanacak şekilde ayarlayın.
   4. Lifleri istenen uzunluğa kesmek için UV lazer odak noktasını fiber düzlem boyunca 25 μm/s hızında hareket ettirin (burada, tüm lifler 500 μm'ye kesilir).
      NOT: Lifler kesilmeden önce parlak bir ışık yayacaktır. Lifleri işlemden sonra iletken bir polimerle kaplanmaya hazır olana kadar saklayın.

8. Poli (3,4-etilenedoksithiophene):p-toluenesulfonat (PEDOT:pTS) düşük empedans için iletken kaplama

1. 50 mL DI suda 0,01 M 3,4-etilendioksithiophene ve 0,1 M sodyum p-toluenesulfonat çözeltilerini karıştırın ve bir karıştırma plakasında (~450 rpm) veya çözeltide partikül gözlenene kadar gece karıştırın.
   NOT: Çözeltiyi ışığa dayanıklı bir kapta saklayın. Çözeltiyi 30 güne kadar kullanılabilen tutmak için karıştırdıktan sonra çözeltiyi soğutun.
2. 1x PBS'de öncekiyle aynı parametreleri (5.2-5.3 adımları) kullanarak 1 kHz empedans taraması çalıştırın. Hangi liflerin iyi bir bağlantıya sahip olduğunu unutmayın (<1 MΩ, tipik olarak 16 lifin 14-16'sı).
3. Elektrotların empedansını azaltmak için PEDOT:pTS ile elektroplate.
   1. Fiber uçlarını PEDOT:pTS çözümüne batırın.
   2. PEDOT:pTS için 1x PBS çözümünü geçirerek ve karta olan tüm bağlantıları uygulanan geçerli kanala kısa devre yaptırarak 5.2 adımındaki adımları izleyin.
   3. Bir potentiostat kullanarak 600 s için iyi lif başına 600 pA uygulayın.
   4. Hücreyi kapatın ve çalıştırmanın sonunda 5 s dinlenmesine izin verin.
4. Lifleri çözeltiden çıkarın ve DI suyunda durulayın.
5. Liflerin başarıyla kaplandığını kontrol etmek için 1 kHz empedansları yeniden çekin (5.2-5.3 adımlarında listelenen parametreleri kullanın).
   NOT: İyi lifler, 110 kΩ'dan daha az empedansa sahip herhangi bir lif olarak belirlenir.

9. Bağlantı zemini ve referans telleri

1. Parylene C'yi yerden hafifçe kazıyın ve cımbız kullanarak tahtadaki referansları referans alın. Bu tahta tasarımında zemin ve referans via'ları çiftler halinde kısan.
   NOT: Zemin ve referans via'ları Flex dizisindeki konektörün yakınında bulunabilir ve konektörlerin yakınındaki dört küçük altın dairedir. Kullanıcıların ölçümler için parylene C'yi karbon fiberlere en yakın vialardan çıkarmaları yeterlidir.
2. Jiletle iki adet 5 cm uzunluğunda yalıtımlı gümüş tel kesin. Ameliyat sırasında daha kolay topraklama ve referans sağlamak için tellerin uçlarını Flex Dizisine tutturulacak bir uçtan 2-3 mm ve karşı uçlardan ~10 mm yalıtın.
3. Lehim demirini 600 °F'ye ısıtın. Via'lara az miktarda akı uygulayın.
4. Kart üzerindeki ePhys bağlantılarının her birine bir tel (2-3 mm açık uç) yerleştirin. Lehimleri viaların üstüne uygulayın (Şekil 7A). Probun soğumasına izin verin, ardından via'nın arka tarafına az miktarda lehim uygulamak için ters çevirin (Şekil 7A).
5. Cerrahi makas kullanarak, kayıtta görülen gürültüyü azaltmaya yardımcı olduğu için arka lehim höyüğünden yapışan açıkta kalan telleri kesin (Şekil 7B).
6. Dizileri, kabloları fiberden geri ve uzağa bükerek depolama kutusuna geri yerleştirin. Olası fiber tel etkileşimlerini önlemek için yapışkan bant üzerindeki telleri sabitleyin (Şekil 7C).

10. Cerrahi prosedür

NOT: Sıçan korteksi, daha önce ^7,20 olarak açıklandığı gibi UV Lazer tarafından hazırlanan liflerin etkinliğini test etmek için kullanılmıştır. Bu problar, benzer geometrileri ve empedans seviyeleri nedeniyle sinirde çalışacaktır. Bu ameliyat, UV lazerin elektrotların tepkisini değiştirmediğini doğrulamak için bol miktarda dikkatle gerçekleştirildi.

1. Yetişkin bir erkek Long Evans sıçanını ketamin (90 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) kombinasyonu kullanarak uyuşturun. Anesteziyi bir parmak sıkışma testi ile onaylayın. Ameliyat sırasında sıçanın gözlerinin kurumasını önlemek için gözlere merhem uygulayın.
2. Sağ yarımkürenin motor korteksinin üzerinde 2 mm x 2 mm kraniyotomi oluşturun. Kraniyotomi'nin sol alt köşesini 1 mm bregma ön ve 1 mm orta çizgi yan çizgisi ölçerek tanımlayın.
3. Diziyi stereotaksik bir enstrümana monte edin ve dura yüzeyine dokunana kadar lifleri hafifçe indirerek duradaki stereotaksik aleti sıfırlayın. Diziyi cerrahi bölgeden uzaklaştırın ve yerleştirmeye hazır olana kadar yana doğru hareket ettinin.
4. Dura'yı, ucu dikenli bir iğneyi doku yüzeyine hafifçe çekerek resect yapın. Dura'nın bir kısmı beyne açıldıktan sonra, dura'nın çekilmesine daha fazla yardımcı olmak için bir çift ince tokmak kullanın.
5. Lifleri kraniyotomiye ve 1,2 mm stereotaksik bir alet kullanarak beyne yerleştirin ve elle yavaşça 2007'de alçaltın.
6. ePhys'e özgü bir başlık ve önamplifier ile ePhys verilerini 10 dakika boyunca kaydedin.
   1. Sinyali 2,2 Hz, antialias'ı 7,5 kHz ve numuneyi 25 kHz'de işlemek için önbaklamlı yüksek geçiş filtresini ayarlayın.
      NOT: Bu ölçümlerde sadece spontan aktivite kaydedilir. Uyarıcı uygulanmaz.
7. Ötanazi
   1. Sıçanı izofluran altında 1 L / dk oksijenin altında% 5'te yaşam belirtileri sona erene kadar (20-30 dk) yerleştirin. Ötanaziyi kafa kesme ile onaylayın.

11. Ani sıralama

1. Daha önce bildirilen yöntemleri kullanarak verileri sıralamak ve analiz etmek için başak sıralama yazılımını ^kullanın8.
2. Tüm kanallarda (250 Hz köşe, 4^. sıra Butterworth) yüksek geçiş filtresi kullanın ve dalga biçimi algılama düzeyini RMS eşiği × -3,5 olarak ayarlayın.
   1. Benzer özelliklere sahip küme ve sivri uçlar için gauss modeli kullanın. Daha fazla analize dahil etmek için en az 10 dalga formu kümelerini birleştirin ve ortalama.
   2. Veri kümesinden ani olmayan tüm dalga biçimlerini ortadan kaldırın veya silin.
3. Tüm kanallar sıralandıktan sonra verileri dışa aktarın ve dalga formlarını çizmek ve daha fazla analiz etmek için analiz yazılımı kullanın.

12. Taramalı elektron mikroskobik (SEM) görüntüleme

NOT: Bu adım dizileri kullanılamaz hale getirir ve dizilerin düzgün işlendiğini denetlemek için yalnızca uç işlem sonuçlarını incelemek için kullanılmalıdır. Başarılı bir dizi oluşturmak için bu adımın yapılması gerekmez. Aşağıda özetlenen SEM sürecinin genel bir taslağıdır; ancak, daha önce SEM kullanmamış olan kullanıcılar eğitimli bir kullanıcıdan yardım almalıdır.

1. PCB'nin fiber uçunu kırpın ve karbon bant maskeli bir SEM saplağı üzerine monte edin. Karbon fiberlerin SEM saplağına yapışmasını önlemek için dizileri küçük bir yığılmış karbon bant platformuna (4-5 katman) yerleştirin.
2. Sputter- altın sputter kaplayıcı üreticisi tarafından belirtilen prosedürleri izleyerek altın (100-300 Å) ile dizileri kaplayın.
3. Uç işleme efektlerini incelemek için dizileri SEM'de 15 mm ve 20 kV ışın mukavemetli bir çalışma mesafesinde görüntüleyin.
   NOT: Diziler, UV lazer kesimli lifler için Şekil 8D'de gösterildiği gibi, düşük bir vakum altında sputter kaplama olmadan görüntülenebilir. Bu kurulum için 11-12 mm çalışma mesafesine ve 4 kV ışın mukavemetine sahip olmak önerilir.

İpucu doğrulaması: SEM görüntüleri
Önceki çalışma20 , makas kesiminin Parylene C kayıt sitesi boyunca katlandığında güvenilmez empedanslara neden olduğunu gösterdi. Makas kesimi burada sadece ek bir finiş kesme yöntemi ile işlemeden önce lifleri istenilen uzunluğa kesmek için kullanılır. Açıkta kalan karbon uzunluğu ve uç geometrisini belirlemek için uçların SEM görüntüleri kullanılmıştır (Şekil 8).

Makas ve Nd:YAG lazer kesim lifleri daha önce 17,20 olarak incelenmiştir. Makas kesim lifleri (Şekil 8A) tutarsız uç geometrilerine sahiptir ve Parylene C kesildiğinde ucu katlanır20. Nd:YAG lazer kesimli lifler kayıt alanı, şekli ve empedans alanında tutarlı kalır (Şekil 8B). Üflemeli lifler20, en büyük elektrot boyutuna ve şekil değişkenliğine ve keskinleştirilmiş bir uluğa yol açarak sert dokuya yerleştirilmesini sağlar. Karbon ve Parylene C yalıtımı arasında yumuşak bir geçiş alanı ile ortalama 140 μm karbon yeniden açığa çıktı (Şekil 8C). UV lazer kesim lifleri, uçtan maruz kalan 120 μm karbon gösteren üflemeli liflere benzerdi (Şekil 8D). Empedanslar, UV lazer veya üflemeli uç kesme yöntemlerinin ePhys için uygun olduğunu ve Nd:YAG lazere erişimi olmayan laboratuvarlar için uygulanabilir çözümler olduğunu belirtti.

İpucu doğrulaması: elektrik kaydı
Şekil 9, Flex Arrays kullanarak her hazırlık yönteminden elde edilen empedansları gösterir. Elde eden değerler ePhys kaydı için uygun bir aralıktadır. Nd:YAG lazer kesimli lifler, PEDOT:pTS kaplaması (çıplak karbon: 4138 ± 110 kΩ; PEDOT:pTS ile birlikte: 27 ± 1,15 kΩ; n = 262) ile bile en küçük yüzey alanına ancak en yüksek empedanslara neden oldu. Bunu pürmüzlü ters ilişki takip eder (çıplak karbon: 308 ± 7 kΩ; PEDOT:pTS ile: 16 ± 0.81 kΩ; n = 262) ve UV lazer kesimli (çıplak karbon: 468 ± 85.7 kΩ; PEDOT:pTS ile: 27 ± 2.83 kΩ; n = 7) geniş yüzey alanına ve düşük empedanslara sahip lifler. Bununla birlikte, her durumda, PEDOT:pTS kaplı elyaflar, iyi, düşük empedanslı bir elektrodu belirtmek için daha önce ayarlanan 110 kΩ eşiğinin altına düşer.

Akut ePhys kayıtları, bu yöntemin uygulanabilirliğini göstermek için UV lazer kesimli ve PEDOT:pTS ile tedavi edilmiş liflerle bir ZIF dizisi ile akut olarak yerleştirilen bir Long Evans sıçanından alınmıştır. ePhys daha önce makas kesim20 ve Nd:YAG-17 ve üflemeli işlem görmüş lifler7,8 ile test edilmiş ve kanıtlanmıştır ve bu nedenle bu metinde yeniden doğrulanmamıştır. Sıçan motor korteksinde (n = 1) aynı anda yerleştirilen dört UV lazer tedavi lifinden (2 mm uzunluğunda) akut kayıtlar Şekil 10'da sunulmuştur. Tüm liflerde üç ünite bulundu, bu da liflerin ucuz UV lazer ile tedavisinin, SEM'ler ve empedanslar tarafından beklendiği gibi karbon fiberin sinir birimlerini kaydetmesini sağlayan diğer kesme yöntemlerine benzediğini düşündürdü. Karbon fiber diziler kullanıcının ihtiyaçlarına göre kolayca oluşturulup değiştirilirken, bazı yapılar için ek doğrulamanın gerekli olduğu unutulmamalıdır (Tablo 3), diğerleri ise belirli son görevler için daha az uygundur.

Ticari Parilen C
Ticari olarak kaplanmış dizilerin, hedef yalıtım aralığında, satıcı tarafından 710 nm Parylene C kalınlığına sahip olduğu belirlendi. Diziler, üflemeli uç hazırlığı kullanılarak ePhys kayıtları için hazırlandı. İpuçları, ipuçlarının hazırlanmasından sonra ve mevcut verilerle karşılaştırıldı. Pürmüzlü ve PEDOT:pTS kaplı prob, 16 fiberde ortalama 14,5 ± 1,3 kΩ empedansa sahipti. Parylene C ifadesini karşılaştırmak için ucun ve sapın SEM görüntüleri çekilmişti (sırasıyla Şekil 11 A,B). Bu sonuçlar, ticari bir satıcının kullanımının beklenen empedans değerlerini değiştirmediğini göstererek, bunun üniversite temiz odasında ifade vermek için eşit derecede uygun bir ikame olacağını göstermektedir.

Cihaz maliyet analizi
Tüm araçlar ve dökme malzemeler (örneğin, epoksiler, lehim) araştırmacı tarafından erişilebilir, bir Parylene C kullanıcı ücreti $ 41 ve 8 prob bir parti, toplam malzeme maliyeti $ 1168 (prob başına $ 146). Personel çabası (Tablo 4) toplu iş için ~25 saattir. Ikame edilmiş bir imalat adımı kullanıyorsanız, probların maliyeti ticari Parylene C kaplama maliyetine (500-800 $ teklif edildi) bağlı olarak değişecektir. Yapı adımlarının zamanı (Tablo 4), basitlik için yinelenen bir görevin tüm örnekleri için gruplandırılmıştır. Manuel olarak yoğun adımların (örneğin karbon fiber yerleştirme) tamamlanması daha kolay ve hızlı olduğundan, daha büyük bir perdeye (Geniş Kart ve ZIF) sahip tasarımlar için yapım süreleri önemli ölçüde azalır.

Şekil 1: Konnektörler ve ilişkili baskılı devre kartları. (A) İç kısımda gerekli on altı konektörden birine sahip Geniş Kart (giriş ölçeği çubuğu = 5 mm). (B) ZIF ve iki konnektörden biri ve bir kefen. (C) 36 pinli konektörlü Flex Array; ölçek çubuğu = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Flex Dizisi için lehimleme ve yalıtım adımları. (A) Alt konnektör pimleri için lehim döşenir. (B) Arka pimler lehimleme için hazır ön pimlerle yerinde sabitlenir. (C) Gecikmeli set epoksi yalıtımlı Flex Dizisi; gecikmeli ayarlanan epoksinin her iki taraftaki referansı ve zemin via'larını kapsamadığını unutmayın. (D) Flex Array'in arka tarafı, ped vias boyunca (zemin ve referans via'lar değil) gecikmiş set epoksi bandı ile ve konektörün kenarına doğru kartın kenarına sarılır. Ölçek çubuğu = 0,5 cm (B) ve 1 cm (A, C, D). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Gümüş epoksi uygulamak ve karbon fiberleri Flex Dizisinin izleri arasında hizalamak. Kılcal damarlar beyaz bir kaplama ile vurgulanmıştır. (A) Kılcal damarların ucu, iz çiftlerinin dışında dökülmeden (B) temiz gümüş epoksi (kılcal damarın ucunda ve izlerin içindeki oklarla gösterilir) biriktirmek için izler arasına sığar. (C) Karbon lifleri epoksi içine yerleştirilir ve daha sonra (D) temiz bir kılcal damar ile düzleştirilir. Ölçek çubukları = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: UV Epoksi Uygulaması (A) UV epoksi ile yalıtım, temiz bir kılcal damar ve iki damla UV epoksi (beyaz kaplamalarla işaretlenmiş) kullanılarak uygulanır. UV epoksisi, 0,25-0,75 mm çapındaki damlacıklarda, UV epoksi izlerin üstünde pürüzsüz bir kabarcık oluşturana kadar uygulanır. (B) UV epoksi UV ışığı altında kürlendi. Flex Dizisi, UV ışığının altında hareket kolaylığı ve hizalama için ahşap bir blok üzerine macun içine yerleştirilir. UV ışığı, Flex Array'in sonundan ~1 cm yukarıda bir tutucu ile tutulur. Giriş (B), düzgün bir UV epoksi yalıtımlı Flex Dizisinin yan profilini gösterir. Tahtanın her iki tarafındaki UV epoksi kabarcığı kabaca 50 μm yüksekliğindedir. Ölçek çubukları = 500 μm (A ve B içe). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Empedans ölçümleri için kurulum. Tüm parçalar etiketlenir ve sistem bağlayıcıları ve bağdaştırıcıları sisteme bağımlıdır. PBS, çözümün daha sonra yapıda PEDOT:pTS ile değiştirilirken başrolde yer alıyor; ancak, kurulum aksi takdirde aynıdır. Kısaltmalar: PBS = fosfat tamponlu salin; PEDOT:pTS = poli(3,4-etilendioksitofen):p-toluenesulfonat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Parylene C kaplama için flex dizisi hazırlanmıştır. Flex Array, kaplama işlemi sırasında yapışkan tarafı yukarı bantlı yükseltilmiş bir köpük platforma sabitlenir. Ölçek çubuğu =10 mm. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Son halini alan Flex Dizisine bağlı zemin ve referans telleri. Lehim, güvenli bir bağ oluşturmak için kartın (A) her iki tarafındaki eki her iki tarafına da uygulandı. ePhys vias, kartta GND ve Ref olarak etiketlenir ve tahtanın karşı taraflarında bir birinden eşleştirilir. GND ve Ref2 etiketli iki ek via vardır. Her iki GND vias birlikte kısa. Ref2 elektrokimyasal deneylerde kullanılmak üzere yaratılmıştır. (A)daki fazla tel kırmızı bir kutu ile gösterilir ve gürültü azaltma ve probun işlenmesine yardımcı olmak için probun arka tarafından (B) çıkarılır (kırmızı kutu, telin eskiden nerede olduğunu gösterir). (C) Nihai Flex Dizisi ileride kullanılmak üzere saklanır. Bu panodaki eşleştirilmiş GND ve Ref via'larının ePhys kayıtları için belirlendiğini unutmayın. Ölçek çubukları = 200 μm (A, B). Kısaltmalar: eFis = elektrofizyoloji; GND = zemin; Ref = başvuru. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Farklı uç kesme tekniklerine sahip liflerin SEM görüntüleri. (A) Çok az maruz kalan karbon ile makas kesim lifi. (B) Nd:YAG lazer kesim. (C) Ucundan ~140 mm karbon maruz kalan üflemeli elyaf. (D) ucundan ~120 mm karbon maruz kalan UV lazer kesimli lifler. Kırmızı oklar Parylene C ve çıplak karbon fiber arasındaki geçiş alanını gösterir. Ölçek çubukları = 5 μm (A), 10 μm (B), 50 μm (C, D). Kısaltmalar: SEM = tarama elektron mikroskobik; Nd:YAG = Neodimyum kubbeli yttrium alüminyum garnet. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Empedans sadece tedavinin uygulanması (çıplak karbon maruziyeti) ve PEDOT:pTS ilavesi arasında farklar vardır. Her durumda, PEDOT:pTS ilavesi empedansı bir büyüklük sırasına göre azaltır. Örnek boyutu: Nd:YAG = 262, Blowtorch = 262, UV = 7. UV numune boyutu farkı, hazırlama yönteminin yeniliğinden kaynaklanmaktadır; ancak, beklendiği gibi blowtorch'a benzer bir aralık gösterir. Empedans verileri standart hata ± ortalama olarak ifade edilir. Kısaltmalar: PEDOT:pTS = poly(3,4-etilendioxythiophene):p-toluenesulfonat; Neodimyum kubbeli ittrium alüminyum garnet. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Dört UV lazer kesimli elektrottan akut elektrofizyolojik sıçrama verileri. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11: Ticari Parilen C kaplı diziler. (A) Keskinleştirilmiş dizi, ticari kaplamanın hiçbir dezavantajı olmadığını gösteren tüm liflerde düzgün keskinleştirme gösterir. (B) Pürmüzlemeden sonra, çıplak karbon fiber ve Parylene C arasındaki geçiş (kırmızı kutu), temiz bir oda tesisinde kaplanmış diziler arasında ayırt edilebilir bir fark yoktur. Ölçek çubukları = 200 μm (A) ve 10 μm (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Her PCB'nin onunla ilişkili farklı bir konektörü ve perdesi vardır. Kısaltma: PCB = baskılı devre kartı.

Tablo 2: Her yapı aşamasından sonra tipik empedans aralığı (n = 272). *n = 16. PEDOT:pTS ile işlenmiş 110 kΩ üzerindeki problar hala sinyal kaydedebilir; ancak, tüm işlenmiş elektrotlar tipik olarak bu değerin altına düşer. Kısaltmalar: PEDOT:pTS = poly(3,4-etilendioxythiophene):p-toluenesulfonat; Neodimyum kubbeli ittrium alüminyum garnet.

Tablo 3: Açıklanan kesme yöntemleri ile her kartın doğrulanmış kullanımları. Tüm kesme yöntemleri PEDOT:pTS'nin elektrodepozisyonını içeriyordu. 'Uygun Değil', tasarımın bir form faktörünün bu uç tedavisinin şu anda test edilmesine engel olduğunu gösterir (yani fiber perde). Kısaltmalar: Neodimyum kubbeli yttrium alüminyum garnet; SEM = taramalı elektron mikroskopisi; eFis = elektrofizyoloji; ZIF = sıfır ekleme kuvveti.

Tablo 4: Bir fabrikasyon sürecinin her adımı için gereken süre. Konnektörün lehimleme ve zemin ve referans telleri, etkinlik listesini basitleştirmek için burada birleştirilmiştir. Kısaltmalar: PEDOT:pTS = poly(3,4-etilendioxythiophene):p-toluenesulfonat; Neodimyum kubbeli ittrium alüminyum garnet.

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.