Mobil Tek Moleküllü FRET Problarının Otomatik İki Boyutlu Mekansal Analizi

Summary

Bu makalede, geniş alan floresan mikroskopisi kullanılarak mobil, tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET) tabanlı probların mekansal analizi için bir yöntem sunulmaktadır. Yeni geliştirilen yazılım araç seti, doğru FRET verimliliği ve moleküler konumlar da dahil olmak üzere hareketli probların smFRET zaman izlerinin zamanın işlevleri olarak belirlenmesini sağlar.

Abstract

Tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET), nanometre altından nanometre aralığına olan mesafeleri rapor eden çok yönlü bir tekniktir. Moleküler kuvvetlerin ölçümü, biyomoleküllerin konformasyonel dinamiklerinin karakterizasyonu, proteinlerin hücre içi kolokalizasyonunun gözlemlenmesi ve reseptör-ligand etkileşim sürelerinin belirlenmesi dahil olmak üzere çok çeşitli biyofiziksel ve moleküler biyolojik deneylerde kullanılmıştır. Geniş alan mikroskopi konfigürasyonunda, deneyler genellikle yüzey hareketsiz problar kullanılarak gerçekleştirilir. Burada, tek moleküllü izlemeyi alternatif uyarlama (ALEX) smFRET deneyleriyle birleştiren bir yöntem sunulmuştur ve plazma membranlarında veya cam destekli lipid iki katmanlı yüzeye bağlı, ancak mobil probların smFRET zaman izlerinin elde edilmesine izin verir. Kaydedilen verilerin analizi için, (i) floresan sinyallerin yerelleştirilmesi, (ii) tek parçacıklı izleme, (iii) düzeltme faktörleri de dahil olmak üzere FRET ile ilgili miktarların belirlenmesi, (iv) smFRET izlerinin sıkı bir şekilde doğrulanması ve (v) sonuçların sezgisel sunumuna destek olan otomatik, açık kaynaklı bir yazılım koleksiyonu geliştirilmiştir. Oluşturulan veriler, örneğin probların difüzyon davranışlarının değerlendirilmesi veya FRET geçişlerinin araştırılması gibi özel yazılımlar aracılığıyla daha fazla keşif için girdi olarak kullanılabilir.

Introduction

Förster rezonans enerji transferi (FRET), nanometre altı çözünürlükte süreçlerin araştırılmasına izin verdiği için moleküler biyolojik ve biyofiziksel araştırmalarda önemli bir sürücü olmuştur. Donör ve kabul eden floroforlar arasındaki enerji transferinin verimliliği, nanometre altı ile nanometre aralığındaki boya arası mesafeye güçlü bir şekilde bağlı olduğundan, biyomoleküllerin statik ve dinamik uyumunu keşfetmek için spektroskopik bir cetvel olarak etkin bir şekilde ^{kullanılmıştır1,2,3,4}. Ek olarak, FRET fenomeni, membranla ilişkili ve hücre içi proteinlerin toplu düzeyde kolokalizasyon çalışmaları için yaygın olarak ^{kullanılmaktadır5,6}. Son yirmi yılda, yöntem zamansal ve mekansal çözünürlüğü önemli ölçüde artırmaya yardımcı olan ve heterojen örneklerdeki nadir alt nüfusları bile çözen smFRET olaylarını izlemek için ^uyarlandı7. Bu tekniklerle donatılmış, RNA polimeraz ^II8'in transkript işleme hızı, DNA polimerazlarının replikasyon ^hızı9,10, nükleozom translokasyon ^oranı11, birleştirilmiş spliceosomes12 transkript birleştirme ve duraklama oranı, ribozomal subpopulasyonların ^aktivitesi13 ve kinesin motorlarının yürüme hızı14 gibi moleküler makinelerin dinamiklerine benzersiz içgörüler kazandırıldı14 , birkaç isim vermek için. Reseptör-ligand etkileşim ^süreleri15 ve moleküler ^kuvvetler16 ölçülmüştir.

Yoğunluk bazlı smFRET çalışmaları tipik olarak FRET verimliliğini ölçmek için duyarlı emisyona dayanır: emisyon yolundaki bir ışın ayırıcı, donör uyarılması üzerine donör ve kabul edici floroforlardan kaynaklanan ışığı mekansal olarak ayırır ve bireysel floresan yoğunluklarının ölçülmesine izin verir. Verimlilik daha sonra toplam foton sayısına göre alıcı tarafından yayılan fotonların fraksiyonu olarak ^{hesaplanabilir17}. Buna ek olarak, donör ekscitasyonunu (ALEX) takiben kabul eden heyecan, FRET olaylarının stoichiometry ölçümüne izin vererek, örneğin fotobleached acceptor ^{fluorophore18} içeren problardan kaynaklanan sinyallerden kaynaklanan gerçek düşük FRET sinyalleri arasındaki ayrımcılığa yardımcı olur.

Tek moleküllü FRET deneyleri genellikle iki yoldan biriyle gerçekleştirilir. İlk olarak, numune hacmindeki küçük bir bölge konfokal mikroskop kullanılarak aydınlattır. Çözeltideki tek prob molekülleri odak hacmi içinde yaygınlaşarak gerçekleştiğinde heyecanlanırlar. Bu teknikle, mikrosaniye altı zaman çözünürlüğünü sağlayan hızlı foton sayma dedektörleri kullanılabilir. İkincisi, problar yüzeylerde özellikle hareketsiz hale getirilir ve genellikle arka plan floresansını en aza indirmek için toplam iç yansıma (TIR) konfigürasyonu kullanılarak geniş alan mikroskopisi ile izlenir. Prob hareketsizleştirme, ilk yaklaşımı kullanmaktan çok daha uzun kayıt süreleri sağlar. Buna ek olarak, daha büyük görüş alanı paralel olarak birden çok probun izlenmesine izin verdi. Kamera ihtiyacı, bu yöntemi yukarıda açıklanana kıyasla yavaşlatır. Zaman çözünürlüğü milisaniye ile ikinci aralık arasında sınırlıdır.

Örneğin, dinamik süreçleri milisaniye ile ikinci zaman ölçeğinde incelemek için uzun süreli izlemeler gerekiyorsa, floresan patlamaları genellikle çok kısa olduğu için ilk yöntem uygulanamaz. İkinci yaklaşım, hareketsizleştirme mümkün olmadığı zaman, örneğin hücre zarı içinde yayılan probları içeren canlı hücre deneylerinde başarısız olur. Ayrıca, biyolojik model sistemlerinin temas edilen yüzeyin hareketliliğine bağlı olarak tepkilerini önemli ölçüde değiştirebildiği ^{görülmüştür16}.

Geçtiğimiz ¹⁹ yılında mobil FRET problarını kaydeden kombine smFRET ve tek parçacıklı izleme deneyleri gerçekleştirilirken, verilerin değerlendirilmesi için kamuya açık bir yazılım bulunmamaktadır. Bu, smFRET verimliliği ve stoichiometry, piksel altı doğruluğuna sahip pozisyonlar ve zamanın işlevleri olarak floresan yoğunlukları da dahil olmak üzere mobil floresan probların birden fazla özelliğinin belirlenmesine izin veren yeni bir analiz platformunun geliştirilmesine neden oldu. Sadece doğru sentezlenmiş ve işlevsel tek prob moleküllerini seçmek için adım adım ağartma davranışını, en yakın komşu mesafelerini, emisyon yoğunluklarını ve diğer özellikleri inceleyerek elde edilen izleri filtreleme yöntemleri oluşturulmuştur. Yazılım ayrıca güvenilir, nicel smFRET verileri üretmek için çok ayrıntılı bir çalışmada yakın zamanda kararlaştırılan deneysel ve analitik teknikleri de ^{desteklemektedir17}. Özellikle, uygulama FRET verimliliği ve stoichiometry hesaplaması için doğrulanmış prosedürlere uyar. Donör emisyon kanalı _IDD ve kabul eden emisyon kanalı _IDA'daki donör ekscitasyonu üzerine floresan yoğunlukları, Eq ₍1) kullanılarak görünür FRET verimliliğinin hesaplanmasında kullanılır.

(1)

Kabul edenin _IAA'sı üzerine kabul eden emisyon kanalındaki floresan yoğunluğunun yardımıyla, görünür stoichiometry Eq (2) kullanılarak hesaplanır.

(2)

FRET verimliliği E ve stoichiometry S, dört düzeltme faktörü göz önünde bulundurularak _Eapp ve _Sapp'tan türetilebilir.

α, donör floresanının alıcı emisyon kanalına sızdırılmasını açıklar ve sadece donör floroforları içeren bir örnek kullanılarak veya alıcının ağartıldığı yörüngelerin bölümlerini analiz ederek belirlenebilir. δ, bağışçının donör ekscitasyon ışık kaynağı tarafından doğrudan çıkarılması için düzeltilir ve sadece alıcı floroforlu bir örnek kullanılarak veya donörün ağartıldığı yörüngelerin bölümlerini analiz ederek ölçülebilir.

.

γ, donör ve alıcı emisyon kanallarındaki farklı algılama verimliliklerini ve floroforların farklı kuantum verimliliklerini düzeltmek için _IDD'yi ölçeklendirir. Faktör, yüksek FRET verimliliğine sahip yörüngelerde alıcı ağartma üzerine donör yoğunluğundaki artışı analiz ederek ^{veya birden} fazla ayrıK FRET durumlarını içeren bir örnek çalışılarak hesaplanabilir.

β, _IAA'yı donör ve alıcı uyarımının farklı verimliliklerini düzeltmek için ölçeklendirir. Γ alıcı ağartma analizi ile tespit edilirse, bilinen donör-kabul oranı örneğinden β ^{hesaplanabilir21}. Aksi takdirde, çok durumlu FRET örneği de β verir.

Düzeltmeler birlikte, Düzeltilmiş FRET verimliliğinin Eq (3) kullanılarak hesaplanmasına izin verir.

(3)

ve Eq (4) kullanılarak düzeltilmiş stoichiometry.

(4)

İdeal olarak, 1:1 donör-kabul oranı için düzeltilmiş stoichiometry S = 0.5 verir. Uygulamada, azaltılmış sinyal-gürültü oranı, ölçülen S değerlerinin yayılmasını sağlar ve yalnızca donör sinyallerinden (S = 1) ve yalnızca alıcı sinyallerinden (S = 0) ayrımcılığı engeller. Elde edilen zaman izleri, mekansal kuvvet ^profilleri16, tek moleküllü olayların ^{hareketliliği22} veya farklı durumlar arasındaki geçiş kinetiği gibi bilgileri elde etmek için tek molekül yörüngelerinin daha ayrıntılı bir analizi için giriş olarak ^{kullanılabilir1}.

Aşağıdaki protokolde, smFRET izleme deneyleri için deneysel parametreler ve prosedürlerin yanı sıra yeni geliştirilen yazılım paketini kullanarak veri analizinin arkasındaki çalışma ilkesi açıklanmaktadır. Deneysel verilerin eldei için, aşağıdaki gereksinimleri karşılayan bir mikroskopi kurulumu kullanılması önerilir: i) tek boya moleküllerinin emisyonunu tespit etme yeteneği; ii) geniş alan aydınlatması: özellikle canlı hücre deneyleri için toplam iç yansıma (TIR23,24,25) konfigürasyonu önerilir; iii) emisyon ışığının dalga boylarına göre uzamsal olarak ayrılması, donör ve alıcı floresan aynı kamera çipinin farklı bölgelerine ^{yansıtılır25} veya farklı kameralar; iv) donör ve alıcı uyarılması için ışık kaynaklarının milisaniye hassasiyetle modülasyonu, örneğin doğrudan modüle edilebilir lazerler veya acousto-optik modülatörler aracılığıyla modülasyon. Bu, floroforların fotobleachingini en aza indirmek için stroboscopic aydınlatmaya ve stoichiometries belirlemek için alternatif uyarmaya izin eder; v) PIMS Python ^paketi26 tarafından okunabilecek bir biçimde kaydedilen görüntü sırası başına bir dosyanın çıktısı. Özellikle, çok sayfalı TIFF dosyaları desteklenir.

Protocol

1. Yazılım önkoşulları

1. Miniconda Python dağıtımını ^yükleyin27 (minimum gerekli Python sürümü: 3.7).
2. Windows Başlat menüsünde bir Anaconda istemi açın veya linux veya macOS kullanıyorsanız bir terminal açın ve conda activate yürütün.
3. Aşağıdaki komutları yürüterek topluluk tarafından tutulan conda-forge paketi ^deposu28'i etkinleştirin:
   conda yapılandırması --kanal ekle conda-forge
   conda yapılandırması --set channel_priority katı
   conda güncelleştirmesi --tümü
4. Aşağıdakileri yürüterek gerekli Python paketlerini yükleyin:
   conda install opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab
5. Analiz yazılımının kullanıcı arayüzü olan JupyterLab'ı tanımaya devam edin (yazılım belgelerine ^bakın29).
6. Analiz yazılımını indirmek ve güncellemek için daha sonra kullanılacak git sürüm kontrol sistemini yükleyin. Linux kullanıyorsanız, indirmek ve güncellemek için dağıtımın paket yönetimi yazılımını kullanın. Aksi takdirde, yürütün:
   conda yükleme git
7. İsteğe bağlı olarak, analiz sırasındaki adımları filtre ettikten sonra veri kümelerini görüntülemek için sepet Python paketini yükleyin:
   conda sepet kurmak

2. Numunelerin ölçümü

Şekil 1: Görüntü Alma. (A) Heyecan sırası. 405 nm lazer kullanarak boya yüklü bir hücrenin isteğe bağlı görüntüsünü kaydettikten sonra, donör ve alıcı sırasıyla 532 nm ve 640 nm lazerler kullanarak aydınlatma süresi eşiği için dönüşümlü ve tekrar tekrar heyecanlanır. Donör ve alıcı çıkarma arasındaki süre, kamera tarafından görüntü okunmasına izin vermek için yeterince uzun olmalıdır. Gecikme süresi _tdelay, alım kare hızını ve bu nedenle fotobleaching öncesi gözlem süresini ayarlamak için kullanılabilir. Bu panel ^16'dan değiştirildi. (B) İki emisyon kanalı arasındaki koordinat dönüşümlerinin hesaplanmasında fidüsyal belirteçler kullanılır. Eşleşen fiducials renk ile gösterilir. Tüm görüş alanının kapsanmasını sağlamak için birkaç kaydırılmış görüntü kaydedilmelidir. (C) Düz alan düzeltmesi için lazer profilleri yoğun etiketli bir örnek kullanılarak kaydedilir. Kabul eden profili kaydedilir ve fotobleached, ardından donör profili elde edilir. Farklı örnek bölgelerde birden fazla görüntü alınmalı, ortalama alınmalı ve örnek kusurlarının etkisini azaltmak için düzeltilmelidir (örneğin, görüntünün orta üstündeki parlak nokta). (D) C'de açıklandığı gibi kaydedilen 20 lazer profilinden hesaplanan düz alan düzeltme haritası p(x,y). Kısaltmalar: FRET = Förster rezonans enerji transferi; ImDD = donör ekscitasyonu üzerine donör emisyon görüntüsü; ImDA = donör ekscitasyonu üzerine alıcı emisyon görüntüsü; ImAA = donör ekscitasyonu üzerine alıcı emisyon görüntüsü. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Elektron çarpan yük bağlantılı bir cihaz (EMCCD) kamera kullanırken, EM kazancının tek moleküllü sinyalleri yüksek sinyal-gürültü oranlarında gözlemlemesini sağlayın (üreticinin talimatlarına bakın).
2. Heyecanlanma sırası (daha fazla ayrıntı için Şekil 1A'ya bakın).
   1. İsteğe bağlı olarak, veri çözümlemini görünüm alanındaki belirli bölgelerle sınırlamak için segmentasyon için bir görüntü kaydedin. Örneğin, 405 nm lazer kullanarak Fura-2 yüklü hücreleri heyecanlandırın ve sadece hücreler ve desteklenen lipid bilayerleri (SLB' ler) arasındaki arayüzlerde bulunan probları değerlendirmek için emisyonlarını 510 nm civarında yakalayın. Sonuç olarak, kamera okumasına izin vermek için _tr süresini bekleyin.
      NOT: EMCCD kameralarda tr, seçilen ilgi alanı (YATıRıM GETIRISi) bölgesindeki satır sayısına bağlıdır. Bu nedenle, çerçeveler ve kaydedilen verilerin boyutu arasındaki gecikmeyi azalttığı için küçük bir yatırım getirisi seçmek avantajlı olabilir. Ayrıca, kare aktarım modunun etkinleştirilmesi _tr'nin daha da azaltılmasını sağlar.
   2. Alternatif olarak donör ve kabul eden floroforları tekrar tekrar heyecanlandırır.
      1. Bir aydınlatma süresi _eşiği için donörü heyecanlandırın (5-10 ms genellikle hareket bulanıklığını önleyecek kadar kısadır) ve aynı zamanda kamerayı tetikler.
      2. Kamera okumasına izin vermek için _tr süresini bekleyin.
      3. Kamerayı tetiklerken kabul edeni heyecanlandır.
      4. Bir zaman _tdelay bekleyin.
         NOT: Bu, kamera tarafından okumayı etkinleştirmek için _tr'den daha uzun olmalıdır, ancak aksi takdirde keyfi olarak seçilebilir. Zaman çözünürlüğü ve izleme uzunluğu gereksinimlerini dengeler.
      5. 2.2.2.1-2.2.2.4 adımlarını yineleyin. Agregalardan tek moleküllü sinyallerin ayrımcılığı için adım adım fotobleaching analizine izin veren görüş alanında prob başına en az bir floroforun fotobleachingini sağlayacak kadar büyük olacak tekrar sayısını seçin.
         NOT: Uygun _eşik ve heyecan lazer yoğunluklarının seçilmesi genellikle bazı deneyler gerektirir: Aydınlatma süreleri ne kadar uzun olursa ve lazer yoğunlukları ne kadar yüksek olursa, ortaya çıkan görüntülerdeki sinyal-gürültü oranı o kadar iyidir, ancak elde eden zaman izleri o kadar kısadır.
3. Her örnek için yeterli sayıda film kaydedin.

3. Düzeltme faktörlerinin belirlenmesi için ek ölçümler

1. Görüntü kaydı için her iki emisyon kanalında da görülebilen bir dizi rastgele yerleştirilmiş fidücial işaretleyici kaydedin (yani, donör emisyon kanalının koordinatlarını alıcı emisyon kanalına eşleyen dönüşümü bulmak ve bunun tersi). Bkz. Şekil 1B.
   NOT: Görüntü kaydı yazılım tarafından gerçekleştirilir; bkz. adım 6.1.4.
2. Düz alan düzeltmesi için hem donör hem de alıcı çıkarma ışık kaynakları için yoğunluk profilini ölçün (yani, görüş alanında inhomogeneous excitation için düzeltme). Bu amaçla, yüksek yoğunlukta FRET probları içeren bir örnek hazırlayın ve önce alıcının çıkarılması üzerine bir görüntü elde edin, ardından alıcının fotobleaching'i ve daha sonra donör çıkarılması üzerine bir görüntünün kaydedilmesi. Daha fazla stabilite için, farklı örnek bölgelerde birkaç kez tekrarlayın. Bkz. Şekil 1C,D. Alternatif olarak, sadece donör molekülle süslenmiş bir numuneyi ve sadece kabul eden floroforlarla süslenmiş ikinci bir numune kaydedin.
   NOT: Düz alan düzeltmesi analiz yazılımı tarafından gerçekleştirilir; bkz. adım 8.1.2.
3. Alıcı kanalına sızan donör emisyonu belirlemek için alıcı floroforu olmayan bir probun tek moleküllü örneğini (bölüm 2'de olduğu gibi) kaydedin.
   NOT: Donör sızıntısı, alıcı ağartma işleminden sonra gerçek probların zaman izlerinden de hesaplanabilir. Bu tür olayların yeterli sayıda kaydedilirse, ek ölçüm gerekmez. Her iki seçenek de analiz yazılımı tarafından desteklenir; Ek Bilgiler bölümüne bakın, bölüm 3.15.
4. Donör flüforu olmayan bir probun kayıtlarını, donör ekscitasyon ışık kaynağı tarafından doğrudan kabul edenin çıkarılması için alın.
   NOT: Doğrudan alıcı çıkarma, donör ağartma işleminden sonra gerçek probların zaman izlerinden de türetilebilir. Bu tür olayların yeterli sayıda kaydedilirse, ek ölçüm gerekmez. Her iki seçenek de analiz yazılımı tarafından desteklenir; Ek Bilgiler bölümüne bakın, bölüm 3.15.
5. Donör ve alıcı emisyon kanallarının farklı algılama verimliliklerini ve boyaların farklı kuantum verimlerini düzeltmek için iki farklı FRET verimliliği içeren tek moleküllü bir örnek kaydedin.
   NOT: Bu tür örnekler, örneğin, iki konformasyon arasında dalgalanan Holliday ^{kavşakları1} veya farklı, iyi tanımlanmış mesafelerde FRET çiftleri eklenmiş DNA çubukları olabilir. Problar yüksek ve yeterince sabit FRET verimliliklerine sahipse, düzeltme, probların zaman izlerinin kabul edici ağartma olaylarından da hesaplanabilir, bu durumda ek ölçümlere gerek yoktur. Her iki seçenek de analiz yazılımı tarafından desteklenir; Ek Bilgiler bölümüne bakın, bölüm 3.15.

4. Tek moleküllü lokalizasyon algoritmaları

NOT: Çeşitli analiz adımları tek moleküllü lokalizasyon gerektirir. Sinyal yoğunluğuna, arka plana ve sinyal-gürültü oranına bağlı olarak Gauss bağlantı ^{algoritması30} ve kütle merkezi ^hesaplama31 arasında seçim yapın.

1. Gauss montajını gerçekleştirmek için, ilgili kullanıcı arayüzleri aracılığıyla 3D-DAOSTORM30 algoritmasını seçin.
   NOT: 3D-DAOSTORM , çakışan nokta yayılma işlevleriyle sinyalleri bile ayırt etmek için tasarlanmıştır. Bu genellikle bir avantaj olsa da, bir uyarı ile birlikte gelir: tek, parlak sinyaller bazen izleme algoritmasını karıştırabilen ve tek bir uzun yörünge yerine iki kısa yörüngenin algılanmasını sağlayan iki bitişik sinyal olarak tanımlanır.
   Aşağıdaki parametreleri ayarlayın (ayrıntılar için algoritmanın uygulanmasını sağlayan sdt-python ^library32 belgelerine bakın).
   1. radius: Gauss uyum işlevinin başlangıç σ değerini, etkili piksel boyutuna bağlı olarak piksel cinsinden ayarlayın.
   2. eşik: Yerel yoğunluğun sığacağı en yüksek değer için minimum genlik (örneğin, tahmini yerel arka plan için düzeltilmiş en parlak piksel değeri) ayarlayın.
      NOT: Eşik tartışmasız en önemli parametredir. Çok düşük ayarlanırsa, gürültü floresan sinyali olarak kabul edilebilir ve parlak sinyaller iki Gaussian ile donatılabilir. Çok yüksek ayarlanırsa, loş sinyaller uygun değildir.
   3. model: Dairesel Gaussian'lara uyacak şekilde 2d olarak ayarlayın.
      NOT: Diğer modeller smFRET verileri için geçerli değildir.
   4. filtre bulma: Gürültüyü azaltmak için yerel maxima bulmadan önce bir filtre uygulayın, bu da düşük sinyal-gürültü oranı durumlarında yardımcı olur. Bu i) kimlik olabilir: filtre yok; ii) Crocker-Grier: Crocker-Grier algoritmasından bandpass ^{filtresi31,33}; veya iii) Gauss: sigma parametresi tarafından ayarlanan σ gauss bulanıklığı.
      NOT: Crocker-Grier için feat. boyut parametresi piksel cinsinden bir noktaya yayılma işlevinin yarıçapı olmalıdır.
      NOT: Sığdırma filtresiz ham veriler kullanılarak gerçekleştirilir.
   5. min. mesafe: Tek bir Gaussian ile min. mesafe piksellerinden daha az ile ayrılmış iki olası sinyali sığdır.
      NOT: Bu, parlak bir sinyalin yanlış bir şekilde iki bitişik sinyal olarak algılandığı yukarıda belirtilen senaryoda yardımcı olabilir.
   6. boyut aralığı: Gürültü nedeniyle algılamaları sahte sinyallerden kaldırmak için sığdırmaların minimum ve maksimum σ seçin.
2. Kütle merkezi hesaplaması (Crocker'ın ve Grier'in ^{fikrine dayalı} rafine bir ^algoritma313) gerçekleştirmek için ilgili kullanıcı arayüzleri aracılığıyla Crocker-Grier algoritmasını seçin.
   NOT: Bu algoritma, düşük sinyalden gürültüye senaryolarda ve bir dizi yoğunluk içeren sinyallerle başa çıkmada bile çok sağlamdır, ancak çakışan nokta yayılma işlevlerine sahip molekülleri tam olarak sığdıramaz.
   1. radius: Diskin yarıçapını (piksel cinsinden) tüm nokta yayılma işlevini içerecek kadar büyük olarak ayarlayın.
   2. signal thresh.: Yerel bir yoğunluğun analiz edilmesi için minimum genliği (tahmini arka planın üzerindeki en parlak piksel) ayarlayın.
      NOT: Çok düşük ayarlanırsa, gürültü floresan sinyali olarak kabul edilebilir. Çok yüksek ayarlanırsa, loş sinyaller uygun değildir.
   3. kütle harmanı:: Analiz edilecek bir sinyalin minimum toplam yoğunluğunu (arka planda düzeltilmiş piksel değerlerinin toplamı) ayarlayın.
      NOT: Yukarıdaki hususlar geçerlidir.

5. Yazılım başlatma

1. Analiz komut dosyalarını indirin. Anaconda isteminde , çözümlemeyi kaydetmek ( CD komutunu kullanarak) ve
   git klonlama https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git hedef klasör
   1. Hedef klasörü 2021-06-14_Force-FRET-experiment gibi açıklayıcı bir adla değiştirin.
      NOT: Analiz yazılımı bu klasörde sona erecek; bu klasörün önceden varolmamasını sağlayın. Her deneme için analiz komut dosyalarının bir kopyasının indirilmesi önerilir. Bu şekilde, analizi daha sonra yeniden gözden geçirmek, kullanılan parametreleri geri çağırmak ve değişiklikler yapmak mümkündür.
2. Jupyter not defterlerini kopyalayın (01. İzleme.ipynb, 02. Analiz.ipynb, 03. Plots.ipynb) yeni oluşturulan klasöre (bundan böyle kök klasör olarak adlandırılır). Yazılımı ilk kez kullanıyorsanız, bunları kök klasörün not defterleri alt klasöründen alın.
   NOT: Benzer veri kümeleri zaten analiz edilmişse, parametreler yalnızca biraz değişmiş olabileceğinden, not defterlerini önceki bir denemeden kopyalamak uygun bir seçenek olabilir.
3. JupyterLab'ı görüntüleyen bir web tarayıcısı penceresi açmak için Anaconda isteminde aşağıdaki komutu yürüterek JupyterLab sunucusunu başlatın.
   jupyter laboratuvarı
   NOT: Anaconda isteminde çalışan işlem gerçek işi yaparken tarayıcı yalnızca arabirimdir. Sonuç olarak, tarayıcı penceresini kapatmanın yalnızca en az etkisi vardır; oturum http://localhost:8888 erişerek geri yüklenebilir . Ancak, JupyterLab işlemini istem içinde kesmek veya istemi kapatmak analizi sonlandırır ve kaydedilmemiş çalışma kaybına neden olur.
4. JupyterLab tarayıcı penceresinde, kök klasöre gitmek için sol bölmeyi kullanın. İlk dizüstü bilgisayarı başlatmak için 01. Tracking.ipynb'ye çift tıklayın. Başlattıktan sonra, Python kodunun hücreleri olarak adlandırılan kutuları görüntüleyen yeni bir sekmenin görünmesini arayın.
   NOT: Tüm Jupyter not defterlerinde her kod hücresinin işlevselliğini açıklayan açıklamalar bulunur. Ayrıca, her yöntem çağrısı için belgeler, metin imleci açılıştan hemen önce yerleştirilerek görüntülenebilir ( ve Shift+Sekme tuşlarına basın).
5. Veri çözümleme sürecine genel bakış için Şekil 2'ye bakın.

Şekil 2: Tipik bir analiz ardışık düzenine genel bakış. Filtreleme adımlarının deneysel tasarıma göre adaptasyona tabi olduğunu unutmayın. Bu rakam ^16'dan değiştirilir. Kısaltma: FRET = Förster rezonans enerji transferi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: Yazılımı denemek için örnek veriler https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files

6. Tek moleküllerin lokalizasyonu, takibi ve floresan yoğunluğu analizi (01. İzleme.ipynb).

1. 01. İzleme.ipynb Jupyter dizüstü bilgisayar, özellikle FRET ölçümlerinde sıklıkla meydana gelen soluk sinyallerin (örneğin, yüksek FRET olaylarındaki düşük donör sinyalleri nedeniyle ve tam tersi) hassas nicelik için özel olarak tasarlanmış tek moleküllü sinyallerin floresan yoğunluk değerlerinin güvenilir analizi için.
   NOT: Bu amaçla, ham verilerdeki piksel yoğunluklarının yerel arka plan için düzeltme ile doğrudan entegrasyonu uygulanır. Her analiz adımının ekran görüntüleri ve işlev çağrısı parametrelerinin açıklaması için, Ek Bilgiler.
   1. Donör ve alıcı çıkarma çerçevelerinin yanı sıra kaydedilen görüntü dizilerinden görüntü segmentasyonu için çerçevelerin seçilmesine izin vermek için aydınlatma sırasını belirtin.
      NOT: Yazılım, rasgele aydınlatma protokolleriyle kaydedilen verilerin işlenmesine izin verdiğinden, ne tür bir floroforun heyecan vericiyken bir görüntü dizisindeki hangi karenin elde edildiğini belirtmek gerekir; Bkz. Ek Bilgiler, bölüm 1.2, adım 3. Özgün görüntü dizisinin kare numaraları korunur.
   2. Veri kümelerini açıklayın ve yükleyin. Aynı aydınlatma ayarları kullanılarak kaydedilmiş olmaları koşuluyla aynı anda birden fazla veri kümesini analiz edin. Her veri kümesine ilgili görüntü sırası dosya adlarıyla eşleşen bir tanımlayıcı ve desen atayın. Ayrıca, görüntü kaydı için fiducial işaretleyicilerin kayıtları, düz alan düzeltmesi için heyecan ışığı profilleri ve düzeltme faktörlerini belirlemek için isteğe bağlı olarak yalnızca donör ve alıcı örnekleri gibi özel amaçlar için belirli veri kümeleri tanımlayın.
   3. Her iki kanal da tek bir kamera kullanılarak kaydedilmişse ham görüntülerde emisyon kanallarını seçin. Bunun için, donör ve kabul eden emisyon için uygun bölgeleri seçmek üzere uygun grafik widget'ını kullanın.
   4. Her iki emisyon kanalında da fiducial işaretleyicileri yerelleştirin ve görüntü kaydı gerçekleştirin. Hem donör hem de alıcı emisyon kanalları için yerelleştirme algoritması için uygun parametreleri bulmak için sağlanan kullanıcı arabirimini kullanın. Desteklenen yerelleştirme algoritmaları hakkında bilgi için bölüm 4'e bakın.
      NOT: Rastgele dağıtılmış fidüsyal belirteçler, emisyon kanallarında en yakın komşularının mekansal dağılımı ile tanımlanabilir (Şekil 1B). Sdt-python kütüphanesindeki seçici düzlem aydınlatma mikroskopisi34 için önerilen algoritmanın özel bir uygulaması, donör emisyon kanalındaki her bir işaretçinin konumunu alıcı emisyon kanalındaki konumla otomatik olarak eşleştirer. Donör emisyon kanalının koordinatlarını alıcı emisyon kanalının koordinatlarıyla eşleştiren bir dönüşüm T, afin dönüşümünün işaretleyicilerin konumlarına en az kareler sığdırılan doğrusal bir şekilde ^bulunur35. RANSAC, önceki adımdaki yanlış eşleşen pozisyonlar gibi aykırı değerleri hesaba katmak için kullanılır.
   5. FRET problarını tüm çerçevelerde donör ve alıcı çıkarma üzerine bağımsız olarak yerelleştirin ve sonuçları orijinal çerçeve numarasını, 2 boyutlu koordinatları ve kaynak görüntü dosyasına başvuran bir tanımlayıcıyı içeren tek bir tabloda birleştirin.
      NOT: Bu amaçla, yazılım yerelleştirme algoritması için uygun seçenekleri bulmak için kullanıcı arabirimleri sağlar.
      1. Donör emisyonu ImDD ve kabul eden emisyon ImDA'dan elde edilen görüntülerin toplamında donör ekscitasyonu üzerine FRET problarını lokalize edin, bu da FRET verimliliğine pek bağlı değildir. Yerelleştirme algoritması seçenekleri hakkında bilgi için bölüm 4'e bakın.
         NOT: Her toplam görüntü, daha önce görüntü kaydından elde edilen ve ImDA'ya piksel yönünde eklenen dönüşüm T kullanılarak ImDD dönüştürülerek hesaplanır.
      2. Kabul eden emisyon kanalı _ImAA'da kabul edenin çıkarılması üzerine probları yerelleştirin (yerelleştirme algoritmaları hakkında ayrıntılı bilgi için bölüm 4'e bakın).
   6. İzleme ve floresan yoğunluğu ölçümü gerçekleştirin.

Şekil 3: Tek moleküllü yoğunluk ölçümü. (A) Turuncu pikselde bulunan bir florofor için, düzeltilmemiş yoğunluğu _Iuncorr, sinyalden etkilenen tüm pikselleri kapsayacak kadar büyük bir diskteki (sarı ve turuncu pikseller) tüm piksellerin yoğunluklarını özetleyerek belirlenir: . Yerel arka plan, diskin etrafındaki bir halkadaki (mavi pikseller) piksellerin ortalaması olarak hesaplanır: burada _nring halkadaki piksel sayısıdır. Floresan yoğunluğu I, arka planı düzeltilmemiş yoğunluktan çıkarmanın sonucudur, I = _Iuncorr - b × _ndisk, burada _ndisk diskteki piksel sayısıdır. Daire yarıçapı, izleme yönteminin feat_radius parametresi aracılığıyla belirtilir. Halkanın genişliği bg_frame parametresi tarafından verilir. Bir sinyalin nokta yayma işlevi diğerinin (alt panelin) arka plan halkasıyla çakınırsa, etkilenen pikseller (kırmızı) yerel arka plan analizinin dışında tutulur. İki nokta yayılma fonksiyonu çakışıyorsa, floresan yoğunlukları güvenilir bir şekilde hesaplanamaz ve bu nedenle atılır. (B, C) Simülasyonlar, standart sapması 1 piksel olan gauss bulanıklığının uygulanmasının, düşük floresan yoğunluklarında (B) 2'ye yakın bir faktöre kadar sinyal-gürültü oranını artırdığını ve neredeyse hiç hata (%1'den az hafife alma, (C))^16'yı ortaya çıkardığını göstermektedir. Ayrıca, göreceli hata (yani, (_Imeas - _Itruth)/_{Itruth, Itruth'un} temel gerçek olduğu ve _Imeas'ın analizin sonucu olduğu) tüm yoğunluk aralığında sabittir ve bu nedenle FRET verimlilikleri ve stoichiometries gibi oransal miktarlar için iptal eder. Tüm çizimler daha önce yayımlanır ¹⁶ çalışmaya dayanmaktadır. Kısaltmalar: SNR = sinyal-gürültü oranı; FRET = Förster rezonans enerji transferi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. FRET prob yerelleştirmelerini yörüngelere bağlamak için kullanılan trackpy36algorithm için uygun seçenekleri belirleyin. Özellikle, bir kareden diğerine en fazla arama mesafesini ve ağartma veya kaçırılan yerelleştirmeler nedeniyle bir sinyalin algılanamayan ardışık kare sayısını ayarlayın.
   NOT: Bu boşluklar, önceki ve sonraki pozisyonlar arasındaki enterpolasyon yoluyla doldurulur. Bu enterpolasyonlu konumlar işaretlenir ve yalnızca daha sonra yoğunluk değerlerini okumak için kullanılır, ancak difüzyon analizi için kullanılmaz. İzler, kabul eden emisyon kanalının koordinat sisteminde analiz edilir. Floresan yoğunluk analizi için (adım 6.1.6.2), izler ayrıca görüntü kaydı yoluyla elde edilen ters dönüşüm ^T-1 kullanılarak donör emisyon kanalının koordinat sistemine dönüştürülür (bkz. adım 6.1.4).
2. Floresan yoğunluğu hesaplama algoritması için seçenekleri belirleyin (ayrıntılar için Şekil 3A'ya bakın). i) Bir sinyalin konumuna ortalandığında, bu sinyalden etkilenen tüm pikselleri içeren bir diskin yarıçapını ve ii) yerel arka planı belirlemek için kullanılan her diskin etrafındaki bir halkanın genişliğini belirtin.
   NOT: Elde edilen yoğunluk ölçümlerindeki gürültüyü azaltmak için görüntülere standart sapması 1 piksel olan gauss bulanıklığı uygulanır (Şekil 3B,C).

7. Görüntü dizilerinden yardımcı görüntü verilerini işlemek için analiz yazılımı işlevini kullanın.
   1. Segmentasyonu kolaylaştırmak için kaydedilen ek görüntüleri ayıklayın (bkz. adım 2.2.1, s ile işaretlenmiş ek bilgi, bölüm 1.2, adım 3).
   2. Yoğun etiketli bir örnekte kaydedilen görüntülerden görüş alanındaki donör ve alıcı çıkarma ışığı profillerini belirleyin (bkz. adım 3.2).
      NOT: Işık profillerini hesaplamak için görüntülerden piksel piksel ortalama hesaplanır. Kamera taban çizgisi çıkarılır. Görüntüler, örnek safsızlıklar nedeniyle etkileri azaltmak için Gauss filtresi kullanılarak bulanıklaştırilir. Son olarak, elde edilen görüntüler, profil p(x,y) eşleme koordinatlarını [0,1] aralığına almak için maksimum değerlerine piksel yönünde bölünür.

7. FRET yörüngelerinin görselleştirilmesi (isteğe bağlı)

1. Ham görüntü verilerinde tek moleküllü izleri ve buna karşılık gelen floresan yoğunluklarını ve belirgin FRET verimliliklerini ve stoichiometries'i görüntülemek için müfettiş uygulamasını kullanın.
   NOT: Bu, seçilen parametrelerin geçerliliğini değerlendirmek ve tek tek zaman izlemelerini manuel olarak kabul etmek veya reddetmek için değerli bir araçtır. Ekran görüntüsü ve ayrıntılı kullanım bilgileri için Ek Bilgiler'e bakın.

8. Tek moleküllü verilerin analizi ve filtrelenmesi (02. Analysis.ipynb)

1. 02. Analiz.ipynb Jupyter aracılığıyla elde edilen tek moleküllü verilerin analizi ve filtreleri için dizüstü bilgisayar 01. İzleme.ipynb defter. Tipik bir analiz ardışık düzeni için aşağıdaki adımlara bakın.
   NOT: Farklı bilimsel sorular ve deneysel tasarımlar ayarların ayarını gerektirebilir. Jupyter dizüstü bilgisayarların kullanımı, analiz adımlarını atlayarak, yeniden düzenleyerek ve değiştirerek kolay uyarlamaya izin sağlar. Her analiz adımının ekran görüntüleri ve işlev çağrısı parametrelerinin açıklaması için, Ek Bilgiler.
   1. İlk filtreleme adımlarını gerçekleştirin.
      1. Floresan yoğunluklarını güvenilir bir şekilde belirlemek zor olduğundan, çakışan nokta yayılma işlevlerine sahip sinyalleri atın.
      2. Evsel aydınlatma durumunda, iyi bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için yalnızca görüş alanındaki iyi aydınlatılmış bölgelerde bulunan sinyalleri kabul edin.
      3. Intramoleküler FRET'i inceliyorsanız, tüm ağartma adımlarının kaydedildiğini ve daha sonra adım adım fotobleaching analizi sırasında uygun şekilde değerlendirilebildiğinden emin olmak için analizi görüntü dizisinin başından itibaren mevcut olan yörüngelerle kısıtlayın.
         NOT: Donör ve kabul eden floroforların önceden biçimlendirilmiş bir kompleksin parçası olmadığı intermoleküler FRET probları ile deneyler yapılırken, analizin başlangıçta yörüngeleri sunacak şekilde kısıtlanması mümkün olmayabilir.
   2. 6.1.7.2 adımında elde edilen heyecan verici ışık kaynağı profillerini kullanarak, inhomogeneous aydınlatmanın neden olduğu konuma bağlı floresan yoğunluğu değişimlerini tersine çevirmek için düz alan düzeltmesini yürütün.
      NOT: Konumdaki bir probun floresan yoğunluğu I(x,y) ile düzeltilir ; bkz.
   3. Görünür FRET verimliliğini hesapla Eapp (yani, donör floroforundan kabul eden florofora iletilen enerjinin fraksiyonu) ve görünür stoichiometry Sapp (yani, donör floroforlarının sayısı, kırınım sınırlı bir nokta içindeki toplam florofor sayısına bölün).
      NOT: Her veri noktası için E ve S çizerek, stoichiometry18'deki değişiklikler nedeniyle donör-alıcı uzaklığındaki değişikliklerden kaynaklanan değişiklikler nedeniyle ölçülen FRET verimliliklerindeki değişiklikleri ayırt etmek ^{mümkündür18}. Bu, etkin bir alıcının olmaması nedeniyle E = 0'dan boya ayrımı nedeniyle E = 0 arasında ayrıma izin verir. E-S arazileri analiz boyunca kalite değerlendirmesi için bir araç olarak kullanılır; örnek olarak Şekil 4'e bakın.
   4. Tek moleküler problar ve agregalar arasındaki ayrımcılık için fotobleaching'in adım adım analizini yapın. Aşağıdaki seçeneklerden birini kabul etmeyi seçin.
      NOT: Bu amaçla, analiz yazılımı, donör çıkarma (_IDD + IDA) ve alıcı çıkarma (_IAA) üzerine floresan yoğunluğuna ayrı ayrı değişiklik noktası algılama algoritması ^PELT37'nin özel ^{bir uygulamasını uygular}.
      1. Donör kısmi ağartma gösterirken kabul eden floroforun tek bir adımda ağarttığı (yani, sıfır olmayan yoğunluğa ağartma adımı olmadığı) 1 seçeneğini seçin.
         NOT: Bu seçenek, donörün alıcıdan önce tek bir adımda ağarttığı yörüngeleri daha da reddeder. Seçenek 1, yüksek kabul eden fotobleaching oranlarında tercih edilen seçimdir.
      2. Kısmi kabul edici ağartma yokken donörün tek bir adımda ağarttığı seçenek 2'yi seçin.
         NOT: Bu seçenek, bağışçının alıcıdan sonra tek bir adımda ağarttığı yörüngeleri daha da reddeder. Donör fotobleaching oranlarının yüksek olması durumunda tercih edilen tercih 2 seçeneğidir.
      3. Seçenek 3'ü seçin, burada florofor tek bir adımda ağartılırken, diğeri kısmen ağartmaz.
         NOT: Seçenek 3, 1 ve 2 seçeneklerinden daha yüksek esneklik sağlar ve veri analizi için önerilen tercih olacaktır.
      4. Donör ve kabul eden floroforların tek adımlı fotobleaching gösterdiği veya hiç fotobleaching göstermediği seçenek 4'ü seçin.
         NOT: Düşük fotobleaching oranları durumunda seçenek 4 tercih edilir.
   5. Kabul eden kanala donör emisyon sızıntısı için düzeltme faktörlerini α, doğrudan kabul edeni δ, algılama verimliliklerini γ ve heyecan verici verimlilikleri β ¹⁷ hesaplayın.
   6. FRET verimliliğini Eapp'in görünür verimliliğinden ve stoichiometry S'nin görünür stoichiometry _Sapp'tan hesaplamak için düzeltme faktörlerini kullanın.
   7. Daha fazla filtreleme adımı gerçekleştirin. Her yörüngedeki ilk ağartma olayından önce yalnızca veri noktalarını seçin. Ayrıca, analizi tek moleküllü problarla sınırlamak için yalnızca 0,35 < S < 0,6'yı karşılayan veri noktalarının en az% 75'ine sahip yörüngeleri kabul edin (sayılar ayarlanabilir).
      NOT: Üst ve alt sınırlar, ilgi gören nüfusun analizden dışlanacak popülasyonlara (örneğin, yalnızca bağışçı ve yalnızca kabul eden nüfuslar) yayılmasına göre seçilmelidir. Deneyime dayanarak, 0.35 < S < 0.6 birçok deneysel durum için iyi bir seçim olduğu ortaya çıktı.
   8. Analizi görünüm alanındaki farklı bölgelerle sınırlamak için uygun yardımcı görüntülerde (bkz. adımlar 2.2.1 ve 6.1.7) genel veya uyarlanabilir eşikleme ^{yöntemleri35} aracılığıyla görüntü segmentasyonu gerçekleştirin.
      NOT: Bu, örneğin, bir hücre SLB arabiriminde veya desenli bir yapıda bulunan probların özel olarak değerlendirilmesine izin verilir.

9. Sonuçların çizilme ve daha fazla analiz (03. Plot.ipynb)

NOT: Jupyter not defterinin ekran görüntüleri ve işlev çağrısı parametrelerinin açıklaması için Ek Bilgiler'e bakın.

1. Yanlış stoichiometry sinyallerinin doğru şekilde tanımlandığını ve kaldırıldığını doğrulamak için E-S çizimleri oluşturun.
2. FRET verimlilik dağılımlarına iyi bir genel bakış sağlamak için FRET verimliliklerinin histogramlarını çizin. Farklı deneylerden elde edilen sonuçların uygun karşılaştırması için histogramları grupla.
3. Verileri daha fazla değerlendirin (örneğin, difüzyon analizi, FRET verimliliklerinin moleküler kuvvet sensörleri veya geçiş analizi kullanılarak yapılan deneylerde kuvvetlere dönüştürülmesi) bilimsel Python kütüphanelerinden yararlanarak not defterinde.
   NOT: Veriler, diğer analiz yazılımlarına giriş olarak birçok dosya biçiminde de dışa aktarılabilir.

Results

Deneyin bilimsel sorusuna bağlı olarak smFRET parçalarından çeşitli düşük ve üst düzey bilgiler çıkarılabilir. Burada, analog ve dijital problara sahip analiz boru hatları örnekleri sunulmaktadır: peptit bazlı moleküler kuvvet ^sensörü16 ve ^{konformasyonu38'in} stokastik anahtarlamalı bir DNA probu. Bu probların tasarım ve çalışma prensibi için Şekil 5'e bakın.

Yerelleştirme ve izleme algoritmaları protokolde açıklandığı gibi yürütüldükten sonra, paket ilk parametreleri ve sonraki filtre adımlarını optimize etmek için birden fazla veri görselleştirme aracı sunar: (i) bireysel smFRET olaylarının görselleştirilmesi, (ii) belirli ilgi bölgelerindeki verileri analiz etmek için isteğe bağlı görüntü segmentasyonu, (iii) filtre adımlarının FRET verimliliği ve stoichiometry (E-S) çizimleri aracılığıyla izlenmesi. Tek moleküllü verilerin görselleştirilmesi Şekil 6'da sunulmuştur.

Son olarak, filtrelenmiş FRET olayları bir E-S çizimi ve bir FRET verimlilik histogramı ile temsil edilir (Şekil 4). E-S çizimi, yukarıda belirtilen filtreleme adımlarını optimize etmek ve nihai sonucu araştırmak için kullanışlı bir araçtır. Kısmen ağartılmış veya eksik etiketlenmiş FRET sensörleri stoichiometry değerlerine göre hariç tutulabilir. Hareketlilik parametreleri , x-y çiziminde (Şekil 6) veya ortalama kare yer değiştirme (MSD) grafiğinde (Şekil 4) tek bir yörünge yolu çizilerek incelenebilir. İlk yöntem özellikle mobili hareketsiz olaylardan ayırt etmek için yararlıdır, ikincisi ise difüzyon katsayısını hesaplamak için kullanılır.

Şekil 4: Örnek çıktı. (A) FRET verimliliği, cam destekli bir lipid bilayerini süsleyen ve bir T hücresi tarafından zorlanan moleküler kuvvet sensörünün (sol panel) bir popülasyonu için stoichiometry 'ye (E-S arsa) karşı çizilir. Yalnızca bir popülasyon bulutu görülebilir. FRET verimliliklerinin ilgili histogramı, hücrelerin varlığı ve yokluğunda (orta panel) bir kuvvet sensörü popülasyonu arasındaki farkı örneklem eder. T hücrelerinin varlığında sensör popülasyonunun daha düşük FRET verimliliğine kayma gözlenemez, bu da sensör modülünün kuvvete bağlı olarak çok az veya hiç esnemediğini gösterir. Bu deneysel koşulların MSD çizimi, bir T hücresinin altındaki kuvvet sensörü popülasyonunun ilişkisiz benzerlerinden (sağ panel) çok daha yavaş hareket ettiğini doğrular. (B) Aynı analiz, cam destekli sıvı lipid bilayerini süsleyen Holliday junction DNA sensörü ile yapılmıştır. E-S arsası, FRET verimlilik histogramında da belirgin olan iki popülasyonu açıkça göstermektedir. MSD çizimi, hızlı hareket eden bir sensör popülasyonunun varlığını gösterir. Kısaltmalar: FRET = Förster rezonans enerji transferi; MSD = ortalama kare yer değiştirme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Intramoleküler FRET problarının tasarımı ve çalışma prensibi. (A) Mekanik moleküler kuvvetlerin ölçülmesi için analog peptit sensörü. Donör ve kabul eden floroforlar peptit omurgasının her iki ucuna da yaygın olarak bağlanır. Sensör modülü, belirli bir ligand'a özel olarak tutturulur, bu da hücre yerleşik bir yüzey reseptörüne bağlanır (burada, özellikle T hücre reseptörünün beta zincirini tanıyan bir antikor parçası). Reseptör-ligand bağlanması üzerine kuvvet uygulanır ve sensör modülü bağ dekoltesi sonrası uzar ve sonunda geri tepir. Bu panel ^16'dan değiştirildi. (B) FRET geçişlerinin nicelleştirilmesi için dijital DNA sensörü. FRET sensörü Holliday kavşağı oluşturan dört DNA teli oluşur. Donör ve kabul eden florofor iki tellere birlikte bağlanır. Holliday kavşakları, çevredeki tampon koşullarına bağlı olarak konformasyonlarını sık sık değiştirir. Bu konformasyonların stokastik anahtarlamaları, bireysel probların FRET verimliliği ölçülerek izlenebilir. Kısaltmalar: TCR = T hücre reseptörü; FRET = Förster rezonans enerji transferi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: FRET problarının lokalizasyonu ve takibi örnekleri. (A) Bireysel olayların FRET verimliliği ve stoichiometry, donör haber alma (D → D), donör ekscitasyonu üzerine kabul eden florofor (D → A) ve kabul eden flüforun alıcı ekscitasyon (A → A) üzerindeki yoğunluğu ölçülerek hesaplanır. En yakın komşu filtreleme, yakın yayıcıların nokta yayma işlevlerinin üst üste binmesiyle sapmayı önler. Görüntü segmentasyonu, kullanıcının ilgi alanı içinde yerelleştirilmiş belirli smFRET olaylarını (örneğin, bir hücre veya mikropattern) seçmesine olanak tanır. Görüntü segmentasyonuna örnek olarak, T hücreleri Fura-2 ile boyandı (solda görüntülendi) ve hücre kenarlarını tanımlamak için uyarlanabilir eşiğe tabi tutuldu (turuncu noktalı çizgi). Ölçek çubukları = moleküler kuvvet sensörini kullanarak 5 μm. (B) smFRET yörüngeleri. Tek tek yörüngeler x-y düzleminde çizilebilir, difüzyon davranışlarını ve lokalizasyonlarını (sol panel) görselleştirir. Ayrıca, her yörüngenin yoğunlukları, FRET geçişlerini veya ağartma adımlarını tanımlamak için zaman içinde çizilebilir (orta panel sol panelden kırmızı yörüngeyi gösterir). Elde edilen FRET verimliliği ve stoichiometry benzer şekilde görselleştirilebilir (sağ panel). (C) Holliday kavşak DNA sensörünü kullanarak smFRET yörüngeleri. Ölçümler sırasında tampon olarak HBSS + ₁₂ mM MgCl2 kullanılmıştır. Bu örneklerin sıra ucuna yakın görünür kabul edici ağartma adımı dışında, her sensör için FRET geçişlerinin sıklığı belirlenebilir. Holliday kavşakları konformasyonlarını yüksek frekansla değiştirirken, moleküler kuvvet sensörü FRET geçişleri sergilemez. Bu bilgiler, gözlemlenen geçişlerin sayısını artırmak veya azaltmak için çerçeveler arasındaki gecikme gibi deneysel koşulları ayarlamayı mümkün kılar. Kısaltmalar: FRET = Förster rezonans enerji transferi; smFRET = tek moleküllü FRET; HBSS = Hank'in dengeli tuz çözeltisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Bilgi: Tek moleküllerin lokalizasyonu ve takibi (01. Tracking.ipynb). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Bu makalede, mobil ancak yüzeye bağlı prob moleküllerinden kaynaklanan smFRET verilerinin otomatik kayıtları ve nicel analizi için bir işlem hattı ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Yüzey hareketsiz probları veya probların bir konfokal eksitasyon hacmine girip çıkmasını içeren smFRET deneylerine yönelik iki baskın yaklaşımı ^tamamlar17. Zamanın bir fonksiyonu olarak doğru FRET verimliliğini ve moleküler pozisyonları sağlar. Bu nedenle, geçiş ^kinetiği1, FRET histogramları39 veya iki boyutlu difüzyon22'yi ölçmek için özel analiz programları için giriş olarak kullanılabilir.

Yazılım, Kullanıcıya ücretsiz kullanım, değişiklik ve yeniden dağıtım hakkı veren Açık Kaynak Girişimi tarafından onaylanan ücretsiz ve açık kaynaklı bir lisans altında piyasaya sürülür. Github, hataları bildirerek veya ^code40'a katkıda bulunarak yazılımı elde etmeyi ve geliştirme sürecine katılmayı mümkün olduğunca kolaylaştırmak için bir geliştirme ve dağıtım platformu olarak seçildi. Python ile yazılan yazılım, tescilli bileşenlere bağlı değildir. Jupyter dizüstü bilgisayarların kullanıcı arayüzü olarak seçimi, her analiz adımında verilerin incelenmesini kolaylaştırır ve boru hattının özellikle eldeki deneysel sistem için uyarlayıp genişletilmesini sağlar. Sdt-python ^library32 temel görevi görür ve tek moleküllü lokalizasyon, difüzyon analizi, floresan yoğunluğu analizi, renk kanalı kaydı, kolokalizasyon analizi ve yatırım getirisi işleme gibi floresan mikroskopi verilerini değerlendirmek için işlevsellik uygular.

Prensip olarak, tek parçacıklı izleme tek, iki veya üç boyutlu sistemlerde yapılabilir. Burada, tek moleküllü analiz boru hattı 2D mobil sistemlerin çalışmasına göre uyarlandı. Bu seçim, mobil floresan probları sunmak için düzlem destekli lipid bilayerler (SLB'ler) gibi basit sistemlerin kullanılabilirliğini yansıtır. Bu tür lipid bilayer sistemleri tipik olarak, toplu fraksiyonun SLB'nin temel fizikokimyasal parametrelerini (faz ve viskozite gibi) belirlediği ve küçük fraksiyonun biyomoleküller için bağlanma bölgeleri sağladığı iki veya daha fazla fosfolipid moieties oluşur. Bu bağlanma bölgeleri, hevesli veya streptavidin bazlı protein platformları için biyotinilasyonlu fosfolipidler veya histidin etiketleri ile protein platformları için nikel-NTA konjuge fosfolipidler ^olabilir41. Proteinleri SLB'ye bağlamak için uygun platformun seçimi bilimsel soruya bağlıdır. Okuyucular, başarıyla kullanılan stratejilere örnek olarak literatür16,38,42'ye başvurabilir. Numunedeki probların yoğunluğu, çakışan nokta yayılma işlevlerini önlemek için yeterince düşük olmalıdır; tipik olarak, ^μm2 başına 0,1 molekülden daha az önerilir. Uygun bir prob yoğunluğunu gösteren bir örnek için temsili sonuçlar bölümüne (özellikle Şekil 6) bakın. Analiz yöntemi, canlı hücrelerin plazma zarında yaygın olan tek floresan etiketli protein molekülleri için de geçerlidir.

SmFRET deneylerinin kritik bir yönü, FRET problarının kendilerinin üretimi ve karakterizasyonudur. Bir FRET çifti için florofor seçerken, Förster yarıçapları beklenen boyalar arası mesafelerle ^{eşleşmelidir43}. Fotobleachinge dayanıklı boyalar uzun süre iz bırakmaları nedeniyle tercih edilir. Bununla birlikte, yüksek ağartma oranları için, kolokalize moleküllerden kaynaklanan multiemitter olaylarını adım adım fotobleaching analizi ile tanımak için bir florofor türü kullanılabilir; protokol bölümündeki 8.1.4 adımına bakın. Florofor çiftleri, özellikle ve etkileşim moleküllerine spesifik olarak bağlanmalı ve intra-veya intermoleküler FRET çiftleri oluşturmalıdır.

smFRET'i diğer hazır tekniklerle birleştirmek, uzamsal çözünürlüğünü kırınım sınırının ötesine (^STED44 aracılığıyla) artırabilir. Burada sunulan smFRET izleme algoritması, yaklaşımın yeni deneysel ayarlara ve model sistemlerine uygulanabilirliğini genişletiyor. Bu, (i) mobil biyomoleküllerin stoichiometristindeki kinetik değişiklikler, (ii) mobil biyomoleküllerin dinamik ilişkisi, (iii) serbestçe yayılan reaktanların enzymatic reaksiyonlarının oranı ve (iv) mobil biyomoleküllerin konformasyonel değişikliklerinin kinetiği çalışmalarını içerir. İlk iki örnek, intermoleküler FRET'i gösteren model sistemleri gerektirir, yani donör ve alıcı, ilgi çekici biyomoleküler varlıkları ayırmak için eşlenir. İkinci örnekler, aynı moleküler varlık (intramoleküler FRET) içinde donör ve alıcı taşıyan biyosensörlerden yararlanabilir.

intramoleküler FRET tabanlı sensörler, biyomoleküllerin içsel konformasyonel ^{değişimleri1,2,3,4}, endojen veya dış kuvvet yükünün neden olduğu konformasyonel değişiklikler (moleküler kuvvet ^{sensörleri16}) veya ^{kalsiyum45 ve pH46} gibi nano ortamdaki iyon konsantrasyonları hakkında fikir verebilir . Model sistemine ve tercih edilen ankraj platformuna bağlı olarak, bu tür smFRET olayları 2D veya 3D olarak izlenebilir: (i) bir plazma zarı içindeki reseptör-ligand etkileşim sürelerinin ölçülmesi, membran bağlantılı sinyal amplifikasyon basamaklarının birlikteliği ve yüzey reseptörlerinin stoichiometry değişiklikleri için smFRET olaylarının düzlemsel takibi; (ii) smFRET olaylarının hacim takibi, canlı hücrelerde veya in vitro yeniden oluşturulmuş sistemlerde herhangi bir intra-veya intermoleküler FRET probu için kullanılabilir.

SmFRET izleme yöntemi esas olarak intramoleküler FRET probları göz önünde bulundurularak geliştirilmiştir. Bu problar, aglomeralanmış ve yanlış sentezlenmiş (örneğin, tamamlanmamış etiketlenmiş) moleküllerden ve floroforlardan birinin fotobleached olduğu problardan gelen verileri reddetmek için sömürülen sabit ve iyi bilinen sayıda floresan etikete sahiptir. Bununla birlikte, filtreleme adımlarını ayarlayarak, yöntem intermoleküler FRET problarına da uygulanabilir. Örneğin, sadece tek bir donör ve tek bir kabul eden florofor içeren molekülleri kabul etmek yerine, donör ve alıcı boyalarının mekansal yörüngelerini inceleyebilir ve örneğin, donör-kabul eden yörüngeleri birlikte dağıtmak için seçebilirsiniz.

3D-DAOSTORM algoritması, emisyon ışını yolundaki silindirik bir lens nedeniyle astigmat üzerinden optik eksen boyunca bir sinyalin konumunu belirleme desteğine sahip olduğu için, 3D deneyler analiz boru hattına kolayca entegre edilebilir. Bu durumda, kabul edenin çıkarılması üzerine gelen kabul eden sinyal, stoichiometry ve eksenel pozisyonu belirlemeye yarar. Analiz yazılımı, büyük ölçüde otomasyon ve filtreleme şemalarını kullanarak hareketsiz problar içeren deneylerden elde edilen verileri değerlendirmek için de kullanılabilir. Aslında, Holliday kavşaklarından gelen smFRET verimlilik veri kümeleri jel fazlı ^bilayers38 üzerinde hareketsiz hale getirildi yazılımın erken bir sürümü kullanılarak analiz edildi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoil-sn-glisero-3-[(N-(5-amino-1-karboksipentil)iminodiasetik asit)süksinil] (nikel tuzu) (Ni-NTA-DOGS)	Avanti Polar Lipidler	790404P
1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC)	Avanti Polar Lipidler	850375P
1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin (POPC)	Avanti Polar Lipidler	850457P
&alfa; Plan-FLUAR 100x/1.45 yağ objektifi	Zeiss	000000-1084-514
Axio Observer mikroskop gövdesi	Zeiss
Bant geçiren filtre	Chroma Technology Corp	ET570/60m	donör emisyon filtresi
Bant geçiren filtre	Chroma Technology Corp	ET675/50m	alıcı emisyon filtresi
Conda-Forge	Conda-Forge Topluluğu		Anaconda/miniconda Lameller için topluluk tarafından korunan Python paket deposu
60 mm x 24 mm #1.5	MENZEL
Dichroic ayna	Semrock Inc	FF640-FDi01-25× 36	verici ve alıcı emisyonunun ayrılması
Dikroik ayna (dörtlü bant)	Semrock Inc	Di01-R405 / 488/532 / 635-25 & kez; 36	uyarma ve emisyon ışığının ayrılması
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
FCS	Sigma-Aldrich	F7524	görüntüleme tamponu
perde analizi	Schü TU Wien'deki		smFRET veri analizi için Python paketi; sürüm 3
Fura-2	Thermo Fisher Scientific	11524766
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	görüntüleme tamponu için
iBeam Smart 405-S 405 nm lazer	Toptica Photonics AG
iXon Ultra 897 EMCCD kamera	Andor Technology Ltd
Lab-Tek odaları ( 8 kuyu)	Thermo Fisher Scientific	177402PK	numune hazırlama ve görüntüleme için
Millenia Prime 532 nm lazer	Spectra Physics
miniconda	Anaconda, Inc.		Python 3 dağıtımı. Min. sürüm: 3.7
Tek değerlikli streptavidin (bakteri ekspresyonu için plazmitler)	Addgene	20860 & 20859
OBIS 640 nm lazer	Coherent Inc	1185055
Optosplit II	Cairn Research
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5253	görüntüleme tamponu
için Plazma temizleyici	Harrick Plazma	PDC-002
sdt-python	Schü TU Wien'deki		grubu Veri analizi için Python kütüphanesi; Versiyon 17
TetraSpek boncuk boyutu kiti	Thermo Fisher Scientific	T14792	Görüntü kaydı için rastgele dağıtılmış, hareketsiz hale getirilmiş referans belirteçleri
SUV oluşumu için	ultrason banyosu	VWR