Method Article

Nöromelanin Granüllerinin Proteomik Profilinin LC-MS/MS Analizi için Lazer Mikrodiseksiyon Tabanlı Protokol

DOI:

10.3791/63289

⸱

December 16th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medizinisches Proteom-Center, Medical Faculty, Ruhr-University Bochum, 2Medical Proteome Analysis, Center for Proteindiagnostics (PRODI), Ruhr-University Bochum, 3Center of Mental Health; Clinic and Policlinic for Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital Wuerzburg, 4Psychiatry Department of Clinical Research, University of Southern Denmark Odense University Hospital, 5Center of Mental Health, Department of Child and Adolescent Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital of Wuerzburg, University of Wuerzburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, nöromelanin granüllerinin lazer mikrodiseksiyonu yoluyla insan post-mortem substantia nigra pars compacta dokusundan izole edilmesi için sağlam bir protokol sunulmuştur. Bu revize edilmiş ve optimize edilmiş protokol, numune toplama için gereken süreyi büyük ölçüde en aza indirir, gerekli numune miktarını azaltır ve LC-MS / MS analizi ile proteinlerin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini geliştirir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöromelanin, substantia nigra pars compacta'nın dopaminerjik nöronlarında nöromelanin granüllerinde (NMG'ler) bulunan siyah-kahverengimsi bir pigmenttir. Nöromelaninin yanı sıra, NMG'ler çeşitli proteinler, lipitler ve metaller içerir. NMG'leri içeren dopaminerjik nöronlar, Parkinson hastalığı ve Lewy cisimcikli demans gibi nörodejeneratif hastalıklarda tercihen kaybolmasına rağmen, NMG oluşumunun mekanizması ve NMG'lerin sağlık ve hastalıktaki rolü hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu nedenle, NMG'lerin moleküler karakterizasyonu hakkında daha fazla araştırma yapılması esastır. Ne yazık ki, proteinlerin izolasyonu için standart protokoller yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemeye dayanır ve bu nedenle yüksek miktarda insan dokusu gerektirir. Bu nedenle, burada NMG'lerin ve çevresindeki substantia nigra (SN) dokusunun tarafsız ve otomatik bir şekilde minimum miktarda doku kullanılarak toplanmasını sağlayan otomatik bir lazer mikrodiseksiyon (LMD) tabanlı protokol oluşturulmuştur. Eksize edilen numuneler daha sonra proteomik bileşimlerini deşifre etmek için kütle spektrometresi ile analiz edilir. Bu iş akışıyla, 514 proteini yalnızca NMG'lerde ve 181'i SN'de tanımlanan 2.079 protein tanımlandı. Mevcut sonuçlar, her iki proteom için% 87.6'lık bir örtüşmeye ulaşan benzer bir LMD tabanlı yaklaşım kullanılarak önceki bir çalışma ile karşılaştırılmış ve burada sunulan revize edilmiş ve optimize edilmiş protokolün uygulanabilirliğini doğrulamıştır. Mevcut bulguları doğrulamak için, ilgili proteinler hedeflenen kütle spektrometrisi, örneğin paralel reaksiyon izleme (PRM) deneyleri ile analiz edildi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Her doku, farklı hücre tiplerinin heterojen bir karışımından oluşur, ancak bir hücre tipinin spesifik izolasyonu genellikle daha kesin bir karakterizasyon için vazgeçilmezdir. Bir mikroskobu lazer uygulamasıyla birleştiren lazer mikrodiseksiyonu (LMD), doku alanlarının, tek hücrelerin veya hücresel alt yapıların karmaşık bir kompozitten spesifik izolasyonu için güçlü bir araçtır. LMD'nin kütle spektrometresi (LMD-MS) ile kombinasyon halinde uygulanması, DNA1, RNA2 ve proteinlerinizolasyonu 3,4,5 dahil olmak üzere çeşitli araştır....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan beyin dokusunun kullanımı, Alman yönetmeliklerine ve yönergelerine göre, Almanya'daki Bochum Ruhr Üniversitesi etik komitesi (dosya numarası 4760-13) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol ticari olarak elde edilen substantia nigra pars compacta doku dilimlerine uygulanmıştır. Sunulan protokolün grafiksel bir genel bakışı Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Doku kesitleme

  1. Kriyostat odasını önceden soğutun.
    NOT: Her doku, ilgili satıcı protokolünde bulunabilen farklı kriyostat sıcaklıkları gerektirir.
  2. Paslanmaz çelik bıçağı %70 etanol ile temizleyin ve bıçak tutucu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMG'lerin ve SN dokusunun spesifik izolasyonu, bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için en önemli adımdır. LMD'nin satıcı tarafından sağlanan yazılımındaki Görüş Alanı Analizi işlevi kullanılarak NMG'ler renge bağlı bir şekilde otomatik olarak seçilebilir. Bu nedenle, NMG'leri içeren doku alanları (Şekil 2A) tanımlanmalı ve NMG'lerin etiketlenmesiyle sonuçlanan ayarlanmış renk eşiklerine sahip bir Görüş Alanı Analizi yapılmalıdır (Şekil 2B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LMD, spesifik doku alanlarının, tek hücrelerin veya hücre altı yapıların izolasyonu için yaygın olarak uygulanan bir tekniktir. Burada sunulan revize edilmiş ve otomatik protokolde, bu teknik nöromelanin granüllerinin (NMG'ler) ve NMG'yi çevreleyen dokunun (SN) spesifik izolasyonu için uygulanır. Şimdiye kadar, NMG'lerin insan post-mortem beyin dokusundan izole edilmesi için iki farklı yaklaşım yayınlanmış ve yaygın olarak kullanılmıştır:

a) 1 g substantia nigra dokusu tükete.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma de tarafından desteklenmiştir. NBI, Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı'nın (BMBF) (hibe numarası FKZ 031 A 534A) ve P.U.R.E. (Avrupa Protein Araştırma Birimi Ruhr) ve Protein Teşhis Merkezi'nin (ProDi) bir projesi, her ikisi de Almanya'nın Kuzey-Ren Vestfalya eyaletindeki Yenilik, Bilim ve Araştırma Bakanlığı'ndan hibe alıyor.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-ditiyotreitolAppliChemA1101
AsetonitrilMerck1.00029.2500
Amonyum bikarbonatSigma-AldrichA6141
Formik asitSigma-Aldrich56302
İyodoasetamidAppliChemA1666,0100
Mikro Tüp 500Carl Zeiss415190-9221-000
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid kütle spektrometresiThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeamZeiss494800-0014-000
PEN Membran sürgüsüCarl Zeiss415190-9041-000
<>substantia nigra pars compacta doku dilimleriNavarrabiomed Biobank (Pamplona, İspanya)
Trifloroasetik asitMerck91707
Tripsin sıralama sınıfıServa37283.01
Ultimate 3000 RSLC nano LC sistemiThermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
Yazılımın Adı<strong>Weblink/CompanyVersion
FreeStyleThermo Fisher Scientific1.6
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/ 1.6.17.0
PALMRoboZeiss4.6 pro
Perseushttps://www.maxquant.org/perseus/1.6.15.0
Skylinehttps://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view20.2.0.343
XCaliburThermo Fisher Bilimsel4.3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316(2011).
  2. Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser MicrodissectionNeuromelanin GranulesProteomic AnalysisMass SpectrometrySubstantia NigraProtein QuantificationLabel Free QuantificationTryptic DigestionParallel Reaction MonitoringDopaminergic Neurons

Related Articles