Bu protokoller, kullanıcıların Denizatı hücre dışı akı analizini kullanarak 3D kanser hücre hattı kaynaklı sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasını araştırmalarına yardımcı olacaktır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücre Dışı Akı Analizi Kullanarak Tek 3D Mikrodoku Sferoidlerinin Mitokondriyal Enerji Metabolizmasını Keşfetmek
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Sferoidler olarak adlandırılan üç boyutlu (3D) hücresel agregalar, son yıllarda in vitro hücre kültürünün ön saflarında yer almaktadır. Hücreleri iki boyutlu, tek hücreli tek katmanlı (2D kültür) olarak kültürlemenin aksine, küresel hücre kültürü, hücre dışı matris proteinlerinin ekspresyonu, hücre sinyalizasyonu, gen ekspresyonu, protein üretimi, farklılaşma ve proliferasyon dahil olmak üzere in vivo olarak var olan fizyolojik hücresel mimariyi ve özellikleri teşvik eder, düzenler ve destekler. 3D kültürün önemi, onkoloji, diyabet, kök hücre biyolojisi ve doku mühendisliği dahil olmak üzere birçok araştırma alanında kabul edilmiştir. Son on yılda, sferoidler üretmek ve metabolik işlevlerini ve kaderlerini değerlendirmek için geliştirilmiş yöntemler geliştirilmiştir.
Hücre dışı akı (XF) analizörleri, bir XF24 adacık yakalama plakası veya bir XFe96 küresel mikroplaka kullanarak sferoidler gibi 3D mikro dokularda mitokondriyal fonksiyonu keşfetmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, farklı protokoller ve XF teknolojisini kullanarak sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasının araştırılmasının optimizasyonu ayrıntılı olarak tanımlanmamıştır. Bu yazıda, XFe96 XF analizörü ile küresel mikroplakalar kullanılarak tek bir 3D sferoidde mitokondriyal enerji metabolizmasının araştırılması için ayrıntılı protokoller sunulmaktadır. Farklı kanser hücre hatları kullanarak, XF teknolojisinin sadece farklı boyutlarda değil, aynı zamanda farklı hacimlerde, hücre sayılarında, DNA içeriğinde ve tipinde 3D sferoidlerde hücresel solunum arasında ayrım yapabildiği gösterilmiştir.
Oligomisin, BAM15, rotenon ve antimisin A'nın optimal mitokondriyal efektör bileşik konsantrasyonları, 3D sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasının spesifik parametrelerini araştırmak için kullanılır. Bu yazıda ayrıca sferoidlerden elde edilen verileri normalleştirme yöntemleri tartışılmakta ve XF teknolojisini kullanarak küresel metabolizmayı keşfederken göz önünde bulundurulması gereken birçok husus ele alınmaktadır. Bu protokol, gelişmiş in vitro sferoid modellerde araştırma yapılmasına yardımcı olacaktır.
Giriş
Biyolojik araştırmalarda in vitro modellerdeki ilerlemeler son 20 yılda hızla ilerlemiştir. Bu tür modeller artık çip üzerinde organ modalitelerini, organoidleri ve 3D mikrodoku sferoidlerini içeriyor ve bunların hepsi in vitro ve in vivo çalışmalar arasındaki çeviriyi geliştirmek için ortak bir odak noktası haline geldi. Gelişmiş in vitro modellerin, özellikle de sferoidlerin kullanımı, doku mühendisliği, kök hücre araştırması, kanser ve hastalık biyolojisi 1,2,3,4,5,6,7 ve genetik toksikoloji
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Şekil 1: Hücresel sferoidlerin oluşturulması, hücre dışı akı analizi ve aşağı akış tahlilleri için grafiksel iş akışı. Dört kanser hücresi hattı, doku kültürü şişelerinden ayrılan tek katmanlı (A) olarak seçici olarak kültürlendi ve sferoidler (B) oluşturmak için ultra düşük bağlanmalı 96 kuyucuklu mikroplakalara tohumlandı. A549 akciğer karsinomu, HepG2 / C3A karaciğer karsinomu, SK-OV-3 yumurtalık adenokarsinomu ve MCF-7 meme ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İyi biçimlendirilmiş, kompakt sferoidler elde etmek için, her hücre hattı tohumlama yoğunluğu ve ekim süresi için ayrı ayrı optimize edilmiştir (Şekil 3). A549, HepG2 / C3A ve SK-OV-3 hücre hatları başlangıçta, kültürde 7 gün sonrasına kadar açıkça tanımlanmış çevrelere sahip yuvarlak sferoidlere ilerlemeyen gevşek agregalar oluşturdu. Tersine, MCF-7 hücreleri 3 gün içinde sferoidler oluşturabilir. Tüm sferoid modeller için kültür periyodundan sonra ilk hücre tohumlama yoğunluğu ile küresel .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Ana bulgular ve çıktılar
Bu makale, XFe96 XF Analyzer ile bir dizi kanser kaynaklı hücre hattı kullanarak tek 3D sferoidlerin mitokondriyal enerji metabolizmasını araştırmak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Zorla toplama için hücre kovucu teknolojiler kullanılarak A549, HepG2 / C3A, MCF7 ve SK-OV-3 hücresel sferoidlerin hızlı bir şekilde yetiştirilmesi için bir yöntem geliştirilmiş ve tanımlanmıştır. Bu protokol, (1) küresel kültür protokollerinin optimizasyonu ve sferoidlerin orijinal kültürl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
N.J.C, Sygnature Discovery Ltd ile BBSRC MIBTP CASE Award tarafından desteklenmiştir (BB/M01116X/1, 1940003)
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| A549 | ECACCnbsp;#86012804 | Akciğer karsinomu hücre hattı | |
| Agilent Denizatı XF RPMI Ortamı, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF tahlil ortamı, fenol kırmızısı, sodyum bikarbonat, glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat içermeyen 1 mM HEPES ile |
| Agilent Denizatı XFe96 Hücre Dışı Akı Analizörü | Agilent Technologies Inc. | - | Tek sferoidlerde küresel oksijen alım oranlarını ölçmek için alet |
| Antimisin A | Merck Yaşam Bilimleri | A8674 | Mitokondriyal solunum kompleksi III inhibitörü |
| BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitokondriyal protnofor birleştirici |
| Floresan bazlı tahliller | |||
| için siyah duvarlı mikroplaka Greiner Bio-One 655076CELLSTAR hücre itici yüzey 96 U kuyu mikroplakaları | Greiner Bio-One | 650970 | Sferoid oluşturmak için mikroplakalar |
| CellTiter-Glo 3D Hücre Canlılık Testi | Promega | G9681 | 3D mikrodoku sferoidlerinde hücre canlılığının belirlenmesi için test |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R& D Systems bir biyoteknoloji markası | 3439-100-01 | Kürelerin bağlanmasını kolaylaştırmak için XFe96 küresel mikroplakaları kaplamak için moleküler hücre yapıştırıcısı |
| D-(+)-Glukoz | Merck Yaşam Bilimleri | G8270 | Hücre kültürü büyümesi ve XF tahlil ortamı için takviye |
| Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | HepG2/C3A sferoidleri için kültür ortamı |
| EVOS XL Çekirdek Görüntüleme Sistemi | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Faz kontrastlı görüntüleme mikroskobu |
| EZ-PCR Mikoplazma test kiti | Biyolojik Endüstriler | 20-700-20 | Hücre kültürlerinde mikoplazma taraması |
| FIJI Sadece Görüntü J | Harmanlanmış görüntülerin analizi | ||
| Fetal sığır serumu | Merck Life Science | F7524 | Hücre kültürü ortamı için takviye |
| HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Karaciğer karsinom hücre hattı, ana HepG2 hücre hattının klonal bir türevi |
| Laktat-Glo | Promega | J5021 | Sfeorid kültür ortamı |
| L-glutamin (200 mM çözeltisi) | G7513 | Hücre kültürü büyümesi ve XF tahlil ortamı için takviye | |
| M50 Stereo mikroskop | Leica Mikrostemleri | LEICAM50 | Stereo diseksiyon mikroskobu; sfeorid kullanımı için kullanılır |
| MCF-7 | ECACC | # 86012803 | Meme adenokarsinomu hücre hattı |
| Streptomyces diastatochromogenes< / em> | Merck Life Science'dan | O4876 | ATP Sentaz İnhibitörü |
| Penisisilin-Streptomisin | Gibco | 15140122 | Hücre kültürü ortamına eklenen antibiyotikler |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Test Kiti | Initrogen | P7589 | Spehroidlerde dsDNA'nın analizi |
| Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitokondriyal Solunum Kompleksi I İnhibitörü |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | A549, MCF7 ve SK-OV-3 için kültür ortamı sferoidler |
| Denizatı Analitiği | Agilent Teknolojileri A.Ş. | Yapı 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
| Denizatı XFe96 Küresel FluxPak | Agilent Teknolojileri A.Ş. | 102905-100 | Her Denizatı XFe96 Küresel FluxPak şunları içerir: 6 Denizatı XFe96 Küresel Mikroplakalar (102978-100), 6 XFe96 sensör kartuşu ve 1 şişe Denizatı XF Kalibrant Çözeltisi 500 mL (100840-000) |
| Serolojik pipet: 5, 10 ve 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Hücre kültürü için sarf malzemeleri |
| SK-OV-3 | ECACCnbsp | ;#HTB-77 | Yumurtalık adenokarsinomu hücre hattı |
| Sodyum piruvat (100 mM çözelti) | Merck Life Science | S8636 | Hücre kültürü büyümesi ve XF tahlil ortamı için takviye |
| T75 cm2 hücre kültürü şişesi | Greiner Bio-One | 658175 | Hücre kültürlerinin bakımı için doku kültürü ile muamele edilmiş şişeler |
| TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Hücre ayrışma reaktifi |
| Dalga kontrol yazılımı | Agilent Technologies Inc. | - | |
| Geniş delikli | uç STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Küresel kullanım için geniş açıklıklı pipet uçları |
Kaynaklar
- Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753(2012).
- Amann, A., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis
Posted by JoVE Editors on 3/11/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis. The Representative Results section was updated.
Figure 5 was updated from:
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.
