Bu yöntem makalesinin amacı, cerrahi olarak rezeke edilmiş plevral mezotelyomadan primer tümör hücre hatlarının zenginleştirilmesi, üretilmesi ve genişletilmesi için sağlam ve tekrarlanabilir bir metodoloji göstermektir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Primer, Malign Plevral Mezotelyoma Tümör Hatlarının Oluşumu ve Genleşmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Nadir tümör tiplerinden primer tümör hücre hatlarının genişlemesi için mevcut metodolojiler eksiktir. Bu protokol, primer tümör hücrelerini cerrahi olarak rezeke edilmiş, malign plevral mezotelyomadan (MPM) genişletme yöntemlerini açıklayarak, sindirimden zenginleştirmeye, genişlemeye, kriyoprezervasyona ve fenotipik karakterizasyona kadar olan sürece tam bir genel bakış sağlar. Ek olarak, bu protokol, diferansiyel tripsinizasyon ve ayrışma yöntemlerinin fenotipik karakterizasyon için hücre yüzey belirteçlerinin tespiti üzerindeki etkisi gibi çoklu tümör tipleri için yararlı olabilecek tümör üretimi için kavramlar sunmaktadır. Bu çalışmanın en büyük sınırlaması, iki boyutlu (2D) bir kültür sisteminde genişleyecek tümör hücrelerinin seçimidir. Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri, medya takviyeleri, yapışmayı iyileştirmek için plaka kaplama ve alternatif ayrışma yöntemleri de dahil olmak üzere bu protokoldeki varyasyonlar, bu tekniği ve bir tümör hattı oluşturmanın genel başarı oranını artırabilir. Genel olarak, bu protokol bu nadir tümörden tümör hücrelerinin oluşturulması ve karakterize edilmesi için temel bir yöntem sağlar.
Giriş
Malign plevral mezotelyoma (MPM), asbest maruziyeti ile yüksek oranda ilişkili nadir bir tümördür. İmmünoterapiye dayalı yaklaşımlar cesaret verici sonuçlar göstermesine rağmen, bu hastalığı geliştiren hastalar için mevcut tedavi seçeneklerinin yetersizliği vardır ve genel 5 yıllık sağkalım oranı düşüktür 1,2. Bu hastalığı daha iyi anlamak ve hasta sonuçlarını iyileştirebilecek yeni terapötik hedefler belirlemek için birçok kurumda çabalar devam etmektedir. Birden fazla mezotelyoma fare modeli olsa da, primer mezotelyoma tümör hücrelerine erişim daha sınırlıdır3. Primer mezotelyoma tümö....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan tüm yöntemler, Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kurum İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır. Bu, bilgilendirilmiş onam sonrasında çıkarılan bakım standardı, cerrahi olarak rezeke edilmiş MPM tümörleri ile ilgilidir.
1. Tümör sindirim ortamının ve diğer ilişkili ortamların hazırlanması
- Tümör sindirim ortamını hazırlamak için, laminer akışlı bir davlumbazda 500 mL steril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamına 5 mL% 100 Pen / Strep (Penisilin / Streptomisin) ekleyin.
- Vakum filtrasyonu için ortamı 500 mL, 0,22 μm polietersülfon (PES) steril filtreye aktarın....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Erken geçiş kültürlerinin fibroblast kontaminasyonunu belirlemek için, hücreler, fibroblastların mevcut diğer yapışkan hücrelere göre sıklığını tanımlamak için ters faz mikroskobu kullanılarak değerlendirilir. Şekil 1, fibroblast kontaminasyonu olmayan bir kültüre kıyasla% 80 (Şekil 1A),% 50 (Şekil 1B) ve% 30 (Şekil 1C) artan fibroblast kontaminasyonunun örneklerini göstermektedir (Şekil 1D).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol basit olsa da, yakından takip edilmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Erken pasaj dondurma, başlangıçta başarısız olursa tümör hücresi zenginleştirme işlemini tekrarlama yeteneğini korumak için önemlidir. Doğru bölünme ve ortam açlığı tekniğine karar vermek için fibroblastik kontaminasyonu gözle değerlendirme yeteneği, kültürde fibroblast aşırı büyümesini önlemek için hayati öneme sahiptir. Ek olarak, diferansiyel tripsinizasyon yöntemi, inkübasyon sırasında hücrelerin dikkatli bir şekilde gözlemlenmesini.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
CH, Briacell Therapeutics için SAB ve Mezotelyoma Uygulamalı Araştırma Vakfı üyesidir. Diğer tüm yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Raquel Laza-Briviesca'ya bu protokolün başlatılmasına katkılarından ve Dr. Boris Sepesi, Reza Mehran ve David Rice'a doku koleksiyonları konusundaki işbirliğinden dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışmayla ilgili ek bir finansman yoktur.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10 mL serolojik pipetler | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL konik tüpler | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirasyonlu pipetler | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serolojik pipetler | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL konik tüpler | BD Falcon | 352098 | |
| 6 oyuklu mikroplakalar, doku kültürü tedavi edilmiş | Corning | 3516 | |
| Accutase | Yenilikçi Hücre Teknolojileri | AT104 | Akış sitometrisi için epitopların korunmasında daha etkili olduğu düşünülen bir proteaz-kollajenaz karışımı. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | İnvitrojen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mezotelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Sığır Serumu Albümini% 30 | Sigma | A8577-1L | |
| Hücre Ayrışma tamponu, enzim içermez | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Hücresi Süzgeç (70 & mikro; m) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| 15 mL ve 50 mL adaptörlü | |||
| Kollajenaz Tip 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | 1.5 g Kollajenaz tip I'i 100 mL steril DMEM'e çözün ve 5 mL hacimlerde alikot. İyice etiketleyin ve -20 ° C'de saklayın. |
| Kontrollü oranlı dondurma odası | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | Beyaz, opak 96 kuyulu mikroplaka. |
| Dimetil sülfoksit | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (sığır pankreasından) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot 50 &mu'da; L, iyi etiketleyin ve -20 ° C'de saklayın. Çözüldükten sonra 4 ° C'de tutun; 1 aya kadar C. |
| Dulbecco'nun Fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Etanol 200 geçirmez | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tüpler-filtre üstü | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal sığır serumu | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tüpleri | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Isıtıcı aparatlı octo-dissosiator | Miltenyi | 130-096-427 | Dezenfeksiyon sırasında C-tüplerine ısı uygulamak için kullanılan özel ısıtıcı aparat manşonları içerir. |
| Keçi serumu | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot ve -20 ° C'de saklayın. |
| Hank'in Dengeli Tuz çözeltisi, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidaz | Sigma-Aldrich | H3506 | 0.15 g Hyaluronidazı 100 mlL steril DMEM'e çözün ve 1.0 mL alikotlara dağıtın. İyice etiketleyin ve -20 ° C'de saklayın. |
| Ters fazlı mikroskop | |||
| Laminer akış başlığı | |||
| Canlı/ölü sarı boya | Yaşam Teknolojileri | L-34968 | |
| Mikropipetatör uçları, 20 & mikro; L | ART | 2149P | |
| Mikropipetleyici, 0.5-20 & L | |||
| Mycoalert tahlil kontrol seti | Lonza | LT07-518 | Aliquot pozitif kontroller ve -20 ° C'de saklayın. |
| Mycoalert Plus mikoplazma tespit kiti | Lonza | LT07-710 | Aliquot reaktifi ve substratı ve -20 ° C'de saklayın Negatif kontrol için kalan tamponu ve alikotu kaydedin ve -20 ° C'de saklayın. |
| Paraformaldehit %16 | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15710 | Bir PVDF şırınga filtresinden süzerek stoğu hazırlayın (Millex cat. no. SLVV033RS) ve çeker ocak altında alikot. -20 ° C'de saklayın. |
| Penisilin-streptomisin 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet yardımcısı | |||
| Lüminesan özellikli plaka okuyucu | BioTek | Synergy HT | bu özelliklere sahip herhangi bir plaka okuyucu kullanılabilir |
| RPMI 1640 medya | Corning | 10-040-CV | |
| Neşter | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP steril vakum filtrasyon sistemi, 0.22 & m PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore S2GPU05RE | ||
| Steriflip-GP filtre, 0.22 & m PES Express PLUS, 50 mL | EMD Kırlangıç | SCGP00525 | |
| Steril forseps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 şişeleri, doku kültürü ile tedavi | Corning | 430639 | |
| T75 şişeleri, doku kültürü ile tedavi edilmiş | Corning | 430641U | |
| Tripan mavisi çözeltisi %0,4Gibco | 15250-061 | ||
| Tripsin EDTA %0,05 | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain akridin portakal / propidyum iyodür (AO / PI) çözeltisi | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
Kaynaklar
- Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
- Baas, P., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
