Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Primer, Malign Plevral Mezotelyoma Tümör Hatlarının Oluşumu ve Genleşmesi

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63374

⸱

21 Nisan 2022

 ,  , 
1Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas MD Anderson Cancer Center

Bu makalede

Özet

Bu yöntem makalesinin amacı, cerrahi olarak rezeke edilmiş plevral mezotelyomadan primer tümör hücre hatlarının zenginleştirilmesi, üretilmesi ve genişletilmesi için sağlam ve tekrarlanabilir bir metodoloji göstermektir.

Özet

Nadir tümör tiplerinden primer tümör hücre hatlarının genişlemesi için mevcut metodolojiler eksiktir. Bu protokol, primer tümör hücrelerini cerrahi olarak rezeke edilmiş, malign plevral mezotelyomadan (MPM) genişletme yöntemlerini açıklayarak, sindirimden zenginleştirmeye, genişlemeye, kriyoprezervasyona ve fenotipik karakterizasyona kadar olan sürece tam bir genel bakış sağlar. Ek olarak, bu protokol, diferansiyel tripsinizasyon ve ayrışma yöntemlerinin fenotipik karakterizasyon için hücre yüzey belirteçlerinin tespiti üzerindeki etkisi gibi çoklu tümör tipleri için yararlı olabilecek tümör üretimi için kavramlar sunmaktadır. Bu çalışmanın en büyük sınırlaması, iki boyutlu (2D) bir kültür sisteminde genişleyecek tümör hücrelerinin seçimidir. Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri, medya takviyeleri, yapışmayı iyileştirmek için plaka kaplama ve alternatif ayrışma yöntemleri de dahil olmak üzere bu protokoldeki varyasyonlar, bu tekniği ve bir tümör hattı oluşturmanın genel başarı oranını artırabilir. Genel olarak, bu protokol bu nadir tümörden tümör hücrelerinin oluşturulması ve karakterize edilmesi için temel bir yöntem sağlar.

Giriş

Malign plevral mezotelyoma (MPM), asbest maruziyeti ile yüksek oranda ilişkili nadir bir tümördür. İmmünoterapiye dayalı yaklaşımlar cesaret verici sonuçlar göstermesine rağmen, bu hastalığı geliştiren hastalar için mevcut tedavi seçeneklerinin yetersizliği vardır ve genel 5 yıllık sağkalım oranı düşüktür 1,2. Bu hastalığı daha iyi anlamak ve hasta sonuçlarını iyileştirebilecek yeni terapötik hedefler belirlemek için birçok kurumda çabalar devam etmektedir. Birden fazla mezotelyoma fare modeli olsa da, primer mezotelyoma tümör hücrelerine erişim daha sınırlıdır3. Primer mezotelyoma tümör hücrelerinin in vitro genişlemesi, tümör hücrelerini doğrudan incelemek ve tümör infiltrasyonu yapan lenfositler gibi otolog immün hücrelerle etkileşimlerini incelemek için kullanılabilecek değerli bir model sistemi sağlayacaktır. Primer mezotelyoma tümör hücreleri hatlarının genişlemesi hakkında raporlar bulunmakla birlikte, bunlar azdır ve ayrıntılı bir standart operasyon prosedürü (SOP) sağlamamaktadır. Ayrıca, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) gibi ticari kaynaklardan birkaç hücre hattı mevcuttur. Primer tümör hatlarının mevcudiyeti sınırlı olmakla birlikte, tümör hücrelerinin plevral efüzyonlardan ve doğrudan tümör dokusundan genişletilebileceği gösterilmiştir 4,5. Ek olarak, genişlemiş tümör hücre hatlarının orijinal tümörün moleküler profilini koruduğu gösterilmiştir 4,5,6.

Laboratuvarımız MPM'nin tümör-immün mikroçevresini incelemekte ve cerrahi olarak rezeke edilen vakalardan primer MPM tümör hücreleri hatlarını genişletmek için bir yöntem geliştirmiştir. Bu yöntem, primer metastatik melanom tümör hücre hatlarının oluşturulmasındaki deneyimlerimizden uyarlanmıştır. Bu çalışmanın amacı, bir 2D model sistemi ve ardından fenotipik profilleme kullanarak primer mezotelyoma tümör hattı genişlemesine ayrıntılı ve pratik bir yaklaşım sağlamaktır. İlk basamak ayar2'de CTLA4 ve PD-1'i hedef alan kontrol noktası blokaj stratejilerinin son zamanlardaki başarısı göz önüne alındığında, birçok primer tümör hattı üretme yeteneği, hem tümörün içsel direnç mekanizmalarının anlaşılmasını daha da ileri götürebilir hem de T hücresi tanımayı değerlendirmek için önemli bir model sistemi sağlayabilir, böylece MPM'deki immün yanıt hakkındaki anlayışımızı derinleştirebilir.

Bu protokolün en büyük sınırlaması, her tümörün farklı bir mikro çevre içermesi ve genişleme başarısının yüksek derecede değişkenliğinin olmasıdır. Ek olarak, bu yöntem bir 2D kültür sisteminde genişleyebilen tümör hücrelerini seçer. Bir 3D sferoid veya organoid kültürünün üretimini içeren diğer yöntemler, daha yüksek bir genişleme başarı oranına izin verebilecek veya geleneksel bir 2D sistemde genişleyemeyen hücre çizgilerini türetme yeteneği ile sonuçlanabilecek alternatif bir yaklaşım sağlayabilir. Bu tür 3D kültürlerin, örneğin pankreas kanseri7 gibi genişlemesi zor olan tümör tiplerinin üretimi için yararlı olduğu gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler, Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kurum İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır. Bu, bilgilendirilmiş onam sonrasında çıkarılan bakım standardı, cerrahi olarak rezeke edilmiş MPM tümörleri ile ilgilidir.

1. Tümör sindirim ortamının ve diğer ilişkili ortamların hazırlanması

  1. Tümör sindirim ortamını hazırlamak için, laminer akışlı bir davlumbazda 500 mL steril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamına 5 mL% 100 Pen / Strep (Penisilin / Streptomisin) ekleyin.
    1. Vakum filtrasyonu için ortamı 500 mL, 0,22 μm polietersülfon (PES) steril filtreye aktarın.
      NOT: Filtrasyon ve aspirasyon adımları 75-150 torr'luk standart bir vakum basıncı ile yapılmalıdır.
    2. Tümör sindirim ortamını etiketleyip tarihlendirin ve 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Ortam, 4 °C'de 1 ay boyunca saklanabilir.
  2. Tümör sindirici enzimatik kokteyli hazırlamak için, laminer bir akış başlığında 50 mL'lik bir konik tüpe 2.5 mL'lik bir sindirim ortamına 2.5 mL% 3 kollajenaz tip 1, 1 mL 1.5 mg / mL hyaluronidaz, 20 μL 250.000 ünite / mL DNAse 1 ila 16.5 mL sindirim ortamı ekleyin.
    NOT: Tümör sindirici enzimatik kokteylin toplam hacmi 20 mL'dir; Bununla birlikte, tümör örneği başına sadece 10 mL'ye ihtiyaç vardır. Bu nedenle, kalan kokteyl ihtiyaç duyulana kadar -20 ° C'de saklanabilir. Aliquots'u yeniden dondurmayın.
  3. Tam tümör ortamı hazırlamak için, laminer bir akış başlığında 500 mL steril RPMI 1640'a 5 mL% 100 Pen / Strep ve 50 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
    1. Vakum filtrasyonu için ortamı 500 mL, 0,22 μm PES steril filtreye aktarın.
    2. Tüm tümör ortamını etiketleyip tarihlendirin ve 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Ortam, 4 °C'de 1 ay boyunca saklanabilir.
  4. Açlığa indirgenmiş serum ortamı hazırlamak için, laminer akışlı bir davlumbazda 500 mL steril RPMI 1640'a 5 mL %100 Pen/Strep ve 5 mL FBS ekleyin.
    1. Vakum filtrasyonu için ortamı 500 mL, 0,22 μm PES steril filtreye aktarın.
    2. İndirgenmiş serum ortamını etiketleyip tarihlendirin ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: Ortam, 4 °C'de 1 ay boyunca saklanabilir.
  5. Dondurucu ortam hazırlamak için, laminer bir akış başlığına 45 mL FBS'ye 5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin.
    1. Vakum filtrasyonu için ortamı 50 mL, 0,22 μm PES steril filtreye aktarın.
    2. Beş adet 15 mL konik tüpü etiketleyin ve tarihlendirin.
    3. Her tüpe 10 mL donma ortamı aktarın ve tüpleri -20 ° C'de saklayın.
  6. Mikoplazma testi için antibiyotik içermeyen ortam hazırlamak için, laminer bir akış başlığında 500 mL steril RPMI 1640'a 50 mL FBS ekleyin.
    1. Vakum filtrasyonu için ortamı 50 mL, 0,22 μm PES steril filtreye aktarın.
    2. Antibiyotiksiz ortamı etiketleyip tarihlendirin ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: Ortam, 4 °C'de 1 ay boyunca saklanabilir.
  7. Fenotipik analiz için floresan ile aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponu hazırlamak için, laminer bir akış başlığında 500 mL steril 1x fosfat tamponlu saline (PBS) 16,6 mL steril sığır serum albümini ekleyin.
    1. FACS tamponunu etiketleyip tarihlendirin ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: FACS tamponu, her iki bileşen de steril olarak depolandığı sürece filtre sterilizasyonu gerektirmez. FACS tamponu açılmadan önce 4 °C'de 6 ay saklanabilir.

2. Tümör dokusunun sindirimi

  1. 10 mL tümör sindiren enzimatik kokteyli adım 1.2'den bir ayrışma tüpüne aktarın.
  2. Tümör dokusu parçasını steril bir neşter kullanarak steril bir 6 delikli plaka kapağına aktarın.
    NOT: Tümör dokusu ile transfer edilen ortam miktarı işlem için yeterlidir.
    1. Yeni bir steril neşter ve forseps kullanarak tüm yağ dokusunu, nekrotik dokuyu ve / veya kan pıhtılarını çıkarın.
      NOT: Yağ dokusu normalde sarımsı görünümde ve yarı katıdır. Nekrotik doku görünüşte çevreleyen dokudan daha koyu ve çok yumuşaktır; hem yağlı hem de nekrotik doku kolayca parçalanır. Kanlı doku parlak kırmızı görünür ve manipüle edildiğinde kanı ortama bırakabilir. Çıkarıldıktan sonra, ortaya çıkan tümör dokusu şekli tutmalı ve doku tipine bağlı olarak soluk veya pembe olmalıdır.
    2. Tüm tümör dokusunu 1mm3 küçük parçalara ayırın. Dokunun kurumamasını sağlamak için, tümör dokusuna 500 μL steril 1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ekleyin.
  3. Tümör fragmanlarını, 10 mL tümör sindiren enzimatik kokteyl içeren ayrışma tüpüne aktarın (adım 2.1). Tüpü sıkıca kapatın, kapağı doku ayrıştırıcısının üzerine yan tarafa yerleştirin ve ısıtıcı aparatını, ayrışma tüpünün üzerine bir manşon gibi uygulayarak ve yerine tıklamak için bastırarak ekleyin.
    NOT: Her tüp için maksimum kapasite 4 g tümör ve 10 mL hacimdir.
  4. Ayrıştırıcı 37C_h_TDK_1 önceden programlanmış ayarı seçin. Yanıp sönen kırmızı ışıkta belirtildiği gibi tıkanma hatası olmadığından emin olmak için 10 dakika sonra durumu kontrol edin.
    NOT: Bu program, sıcaklık 37 °C'de açıkken 1 saat boyunca 1.865 rpm'de çalışır.
    NOT: Tıkanma meydana gelirse, ayrışma tüpünü çıkarın ve kapakta sıkışan herhangi bir dokuyu yerinden çıkarmak için manuel olarak döndürün; daha sonra tüpü ayrıştırıcının üzerine yerleştirin ve programa devam edin.
  5. 1 saatlik sindirimi takiben, ayrışma tüpünü çıkarın ve laminer bir akış başlığına yerleştirin. 50 mL'lik bir konik tüpün üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirerek ve sindirilen tümörü filtreye 10 mL'lik bir pipet kullanarak pipetleyerek sindirilmiş tümörü filtreleyin. Filtre tıkanırsa, yeni bir filtreye geçin.
    1. Ayrışma tüpünü 10 mL taze tümör sindirim ortamı ile durulayın ve yıkamayı filtreden geçirin.
    2. 70 μm filtreyi çıkarın ve atın.
    3. Tümör sindirim ortamı ile toplam hacmi 40 mL'ye getirin.
  6. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj.
  7. Bir vakum kaynağına bağlı 2 mL aspire edici pipet kullanarak, peleti rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin ve 10 mL steril tam tümör ortamı kullanarak hücreleri yeniden askıya alın.
  8. 2.6 adımını yineleyin.
  9. Süpernatantı adım 2.7'de açıklandığı gibi aspire edin. Hücreleri 3 mL steril tam tümör ortamında yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu steril 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın.
  10. Plakayı% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde tutun.
  11. 24 saat sonra, kullanılan ortamı sindirilmiş tümörden 1. kuyudaki aynı 6 delikli plakadaki yeni bir kuyuya (kuyu 2) aktarın. 1'e 3 mL steril tam tümör ortamı ekleyin.
  12. Kullanılan ortamı kuyu 1 ve 2'den aktarın ve adım 2.11'den 24 saat sonra aynı 6 delikli plakada kuyu 3'te birleştirin. Kuyu 1 ve 2'ye 3 mL steril tam tümör ortamı ekleyin.
  13. Ortamı 3 kuyucuğun hepsinden aspire edin ve 3 mL'lik tam tümör ortamını pipet, adım 2.12'den 48 saat sonra her bir kuyucuğa aspire edin.

3. Primer tümör hücre hattının oluşturulması

  1. Ters faz mikroskobu kullanarak, erken geçiş kültüründe fibroblast kontaminasyonunun yüzdesini belirleyin.
    NOT: Fibroblastlar genellikle uzun ve düzensizdir ve kötü tanımlanmış bir hücresel zara sahiptir. Z ölçeğinde ince veya düz görünürler.
    1. Fibroblast kontaminasyonu, erken geçiş kültüründeki hücrelerin% 20'sinden fazlaysa, tüm ortamı azaltılmış serum ortamı ile değiştirdikten sonra kültürlemeye devam edin.
    2. 3.1.1. adımdaki azaltılmış serum ortamı ile değiştirmeyi 3-4 hafta boyunca haftada iki kez tekrarlayın.
    3. Kültür% 80 akıcılığa ulaştığında, 50:50'yi 6 delikli bir plakanın 2 yeni kuyucuğuna bölerek hücreleri geçirin. Hücreler% 80 akıcılığa ulaştığında azaltılmış serum ortamında 50:50 pasajına devam edin.
    4. Adım 3.1.3'ü 4 haftaya kadar tekrarlayın, kültür %80 akıcılığa ulaştığında 50:50'yi bölerek gerektiğinde daha büyük kültür şişelerinde geçiş yapın. Fibroblast popülasyonu% 10 veya daha azına düşürülmezse, fibroblast kontaminasyonunu gidermek için diferansiyel tripsinizasyon yöntemini denemek için adım 3.2'ye devam edin. Aksi takdirde, adım 3.3'e geçin.
  2. Tümör hücrelerini zenginleştirmek için, serum içeren ortamı çıkarmak için kuyuyu 1x PBS ile hafifçe durulayın.
    1. Tripsin aşağıdaki gibi ekleyin: 6 delikli bir plakada kuyu başına 1 mL, T25 şişe için 2 mL, T75 şişe için 3 mL.
    2. 6 delikli plakayı veya şişeyi 1 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. Plakayı veya şişeyi inkübatörden çıkarın ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücrelerin yapışmasını kontrol edin. Hücreler kısmen kalkıyor veya yüzüyorsa, askıya alınmış hücreleri ve tripsini sadece yavaşça çıkarın. Hücreleri, eşit veya daha büyük hacimli tam tümör ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.
      NOT: Yapışma özelliklerine dayanan bu kısmi hücre koleksiyonu, çoklu fraksiyonların ilkidir.
    3. Tüm hücreler kaldırılana veya 4 kesir kaldırılana kadar 3.2.1 ve 3.2.2 numaralı adımları yineleyin.
    4. Tüm bağımsız fraksiyonları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın.
    5. Süpernatantı adım 2.7'de açıklandığı gibi aspire edin ve 5 mL steril, azaltılmış serum ortamı kullanarak hücreleri yeniden askıya alın.
    6. Hücreleri her fraksiyon için bir T25 şişesine yerleştirin ve şişeleri 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin.
    7. Fibroblastlara karşı tümör hücreleri için hangi fraksiyonun zenginleştirildiğini belirlemek için 48 saat sonra kültürü değerlendirin. Fibroblast bakımından zengin şişeleri atın. Fibroblast kontaminasyonu% <10 ise, tam tümör ortamında genişlemeye devam edin ve adım 4'e geçin. Fibroblast kontaminasyonu% 10-30 ise, 3.1.2-3.1.4 adımlarını tekrarlayın. Fibroblast kontaminasyonu% 30'dan büyükse, 3.2-3.2.7 adımlarını tekrarlayın.
  3. Erken geçiş kültüründe az sayıda fibroblast tespit edilirse veya hiç fibroblast tespit edilmezse, hücreler 6 delikli plakalarında veya şişelerinde% 80 oranında birleştikten sonra 50:50'yi bölerek hücreleri tam tümör ortamında geçirmeye devam edin.

4. Erken pasaj primer tümör hücre hattının genişlemesi

  1. Primer tümör kültürü% 10 veya daha az fibroblast kontaminasyonu içerdiğinde, ortamı aspire edin ve haftada iki kez steril tam tümör ortamı ile değiştirin.
    NOT: Bir T25 için en uygun orta hacim 5 mL'dir; T75 12 mL'dir; T150 25 mL'dir.
    1. Kültür 50:50'yi, plakada veya şişede% 80 akıcılığa ulaştığında gerektiğinde daha büyük şişelere geçirin.
      NOT: Kültürün, büyümesine bağlı olarak daha yüksek bir oranda geçirilmesi gerekebilir. Kültürün her 3-5 günde bir% 80 akıcılığa ulaşmasını sağlayın.
  2. Kültür 4. veya daha yüksek bir geçitte olana kadar geçiş. Kültür, en az iki T75 şişesinde %80 oranında birleştiğinde, 5. adıma geçin.

5. Kurulan primer tümör hücre hattının karakterizasyonu ve bankacılığı

  1. Cryopreserve bir T75 şişeyi erken geçiş donması olarak. Kalan T75 şişelerinin mikoplazma testi için, adım 5.2'ye devam edin.
    1. Erken geçiş hücrelerinin kriyoprezervasyonu için, adım 1.5'te hazırlanan 1 tüp aliquoted dondurma ortamını çözün.
    2. Hücreleri tripsinizasyon yoluyla toplayın, önce plakayı adım 3.2'de açıklandığı gibi 1x PBS ile yıkayın ve adım 3.2.1'de açıklandığı gibi tripsin ekleyin.
    3. Şişeyi 3 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. Şişeyi inkübatörden çıkarın ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücrelerin yapışmasını kontrol edin. Hücreler kalkıyor veya yüzüyorsa, asılı hücreleri ve tripsinimi yavaşça çıkarın. Hücreleri, eşit veya daha büyük hacimli tam tümör ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.
      NOT: Hücreler 3 dakika sonra yapışkan kalırsa, şişeyi 2 dakika daha inkübatöre geri yerleştirin.
    4. Tüpü hafifçe pipetleyerek iyice karıştırın ve saymak için 20 μL'yi çıkarın.
    5. Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın.
    6. Hücreler dönerken, tripan mavisi veya akridin turuncu / propidium iyodür (AO / PI) gibi laboratuvara özgü bir sayma protokolü kullanarak sayın.
    7. Dondurucu ortamda santrifüjlemeyi takiben hücreleri en az 2 × 106 hücre/1 mL dondurucu ortam ile yeniden askıya alın.
    8. Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini adım 5.1.7'den önceden etiketlenmiş 1.5 mL kriyovyallere aktarın.
    9. Kriyovalleri kontrollü bir donma odasına yerleştirin ve hemen -80 ° C'ye aktarın.
    10. Hücreleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarmadan önce -80 ° C'de 1 haftaya kadar saklayın.
  2. Mikoplazma testi için bir T75 şişe 50:50'yi bölün. Ortamı adım 1.6'da hazırlanan antibiyotiksiz ortama değiştirin.
    1. 72 saat sonra, testten önce mikoplazma tespit reaktifini, substratını ve kontrollerini oda sıcaklığında 15 dakika boyunca çözün.
    2. Test edilecek her kültürden 1 mL süpernatant toplayın ve 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.
    3. Süpernatantı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj ederek askıya alınmış hücreleri toplayın.
    4. 100 μL numune süpernatantını ve kontrollerini beyaz bir 96 delikli plakaya yükleyin. Her numuneye ve kontrole 100 μL mikoplazma tespit reaktifi ekleyin.
    5. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    6. Plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin ve parlaklığı okuyun (A Okuma, yani ilk Okuma).
      NOT: Mikoplazma kiti üreticisinin protokolü, çok işlevli plaka okuyucularda varsayılan ayarların korunmasını belirtir. Okuma, 1 sn'lik bir entegrasyon süresi ve 135 kazanç ile Lüminesans uç noktasında ayarlanır. Plaka okuyucu, her deney için kazanç sinyalini optimize etmek üzere bir Otomatik ölçeklendirme rutini kullanır. 1 s entegrasyon süresi standart varsayılandır. Her iki ayar da plaka okuyucu tarafından yorumlanan ışıldayan sinyalin yoğunluğunu ayarlamak için kullanılır ve bireysel plaka okuyucusuna bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.
    7. Plakayı plaka okuyucudan çıkarın ve her numuneye ve kontrollere 100 μL mikoplazma algılama substratı ekleyin.
    8. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    9. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve parlaklığı okuyun (B Okuma, yani ikinci Okuma).
    10. Mikoplazma pozitifliğini belirlemek için, Reading B'nin Reading A'ya oranını belirleyin.
      NOT: Mikoplazma pozitiflik oranları, mikoplazma kiti üreticisinin protokolünde açıklanmıştır. A ve B okumaları aynı ayarlarla elde edilir ve sadece okuma sırasını yansıtır.
      1. 1'< bir oranın mikoplazma-negatif olduğunu düşünün.
      2. 1-1.2 oranının sonuçsuz olduğunu düşünün ve adım 5.2'yi tekrarlayın.
      3. 1.2> bir oranın mikoplazma-pozitif olduğunu düşünün ve bu kültürü izleyin; gerekirse kültürü sonlandırın.
  3. Mikoplazma-negatif tümör hücrelerinin akım sitometrisi karakterizasyonu
    1. Hücre ayrışma tamponu kullanarak tümör hücrelerini yerinden çıkarın.
    2. Hücreleri sayın ve hücreleri adım 1.7'den itibaren FACS tamponunda 1 × 106 / mL'de yeniden askıya alın.
    3. Yüzey boyama için 100 μL hücre süspansiyonunu ayrı tüplere çıkarın.
    4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj.
    5. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca FACS tamponunda 500 μL% 5 keçi serumunda inkübe ederek Fc reseptörlerini bloke edin.
    6. 2 mL FACS tamponu ekleyin ve süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın.
    7. Süpernatantı aspire edin ve antikorların yüzey leke karışımını (Tablo 1) ve FACS tamponunu ekleyin, böylece son hacim 100 μL olur.
    8. Adım 5.3.6'yı yineleyin.
    9. Süpernatantı aspire edin ve 200 μL% 1 paraformaldehit (PFA) artı% 0.25 EtOH'de yeniden süspansiyon sağlayarak hücreleri sabitleyin. Numuneler ışıktan korunarak oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
    10. Adım 5.3.6'yı yineleyin. Uygun bir akış sitometresi kullanarak elde etmek için hücreleri 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.
      NOT: Mezotelyoma tümör hücrelerinin mezotelin ve N-kadherin için pozitif olması beklenmektedir. Bazıları CD90'ı da ifade edebilir.
  4. Sırasıyla adım 4.1 ve 5.1'de açıklandığı gibi tam tümör ortamında ve bankada genişletin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Erken geçiş kültürlerinin fibroblast kontaminasyonunu belirlemek için, hücreler, fibroblastların mevcut diğer yapışkan hücrelere göre sıklığını tanımlamak için ters faz mikroskobu kullanılarak değerlendirilir. Şekil 1, fibroblast kontaminasyonu olmayan bir kültüre kıyasla% 80 (Şekil 1A),% 50 (Şekil 1B) ve% 30 (Şekil 1C) artan fibroblast kontaminasyonunun örneklerini göstermektedir (Şekil 1D).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol basit olsa da, yakından takip edilmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Erken pasaj dondurma, başlangıçta başarısız olursa tümör hücresi zenginleştirme işlemini tekrarlama yeteneğini korumak için önemlidir. Doğru bölünme ve ortam açlığı tekniğine karar vermek için fibroblastik kontaminasyonu gözle değerlendirme yeteneği, kültürde fibroblast aşırı büyümesini önlemek için hayati öneme sahiptir. Ek olarak, diferansiyel tripsinizasyon yöntemi, inkübasyon sırasında hücrelerin dikkatli bir şekilde gözlemlenmesini...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

CH, Briacell Therapeutics için SAB ve Mezotelyoma Uygulamalı Araştırma Vakfı üyesidir. Diğer tüm yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Raquel Laza-Briviesca'ya bu protokolün başlatılmasına katkılarından ve Dr. Boris Sepesi, Reza Mehran ve David Rice'a doku koleksiyonları konusundaki işbirliğinden dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışmayla ilgili ek bir finansman yoktur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 mL serolojik pipetlerBD Falcon357551
15 mL konik tüplerBD Falcon352097
2 mL aspirasyonlu pipetlerBD Falcon357558
5 mL serolojik pipetlerBD Falcon357543
50 mL konik tüplerBD Falcon352098
6 oyuklu mikroplakalar, doku kültürü tedavi edilmişCorning3516
AccutaseYenilikçi Hücre TeknolojileriAT104Akış sitometrisi için epitopların korunmasında daha etkili olduğu düşünülen bir proteaz-kollajenaz karışımı.
anti-CD325 (N-Cadherin) PEİnvitrojen12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7BD Biosciences561558
anti-Mezotelin APCMiltenyi130-118-096
Sığır Serumu Albümini% 30SigmaA8577-1L
Hücre Ayrışma tamponu, enzim içermezThermo Fisher Scientific13151014
Hücresi Süzgeç (70 & mikro; m)Greiner Bio-One542-070
15 mL ve 50 mL adaptörlü
Kollajenaz Tip 1Sigma-AldrichC-01301.5 g Kollajenaz tip I'i 100 mL steril DMEM'e çözün ve 5 mL hacimlerde alikot. İyice etiketleyin ve -20 ° C'de saklayın.
Kontrollü oranlı dondurma odasıThermo Fisher Scientific15-350-50
CryovialsThermo Fisher Scientific5000-0020
CulturPlate-96Packard Instrument Company6005680Beyaz, opak 96 kuyulu mikroplaka.
Dimetil sülfoksitThermo Fisher ScientificBP231-100
DNAse I (sığır pankreasından)Sigma-AldrichD4527Aliquot 50 &mu'da; L, iyi etiketleyin ve -20 ° C'de saklayın. Çözüldükten sonra 4 ° C'de tutun; 1 aya kadar C.
Dulbecco'nun Fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi 1xCorning21-031-CV
Etanol 200 geçirmezThermo Fisher ScientificA4094
FACS tüpler-filtre üstüBD Falcon352235
Fetal sığır serumuGemini-Bio100-106
GentleMACS C-tüpleriMiltenyi130-093-237
GentleMACS Isıtıcı aparatlı octo-dissosiatorMiltenyi130-096-427Dezenfeksiyon sırasında C-tüplerine ısı uygulamak için kullanılan özel ısıtıcı aparat manşonları içerir.
Keçi serumuSigma-AldrichG9023Aliquot ve -20 ° C'de saklayın.
Hank'in Dengeli Tuz çözeltisi, 500 mLCorningMT21022CV
HyaluronidazSigma-AldrichH35060.15 g Hyaluronidazı 100 mlL steril DMEM'e çözün ve 1.0 mL alikotlara dağıtın. İyice etiketleyin ve -20 ° C'de saklayın.
Ters fazlı mikroskop
Laminer akış başlığı
Canlı/ölü sarı boyaYaşam TeknolojileriL-34968
Mikropipetatör uçları, 20 & mikro; LART2149P
Mikropipetleyici, 0.5-20 & L
Mycoalert tahlil kontrol setiLonzaLT07-518Aliquot pozitif kontroller ve -20 ° C'de saklayın.
Mycoalert Plus mikoplazma tespit kitiLonzaLT07-710Aliquot reaktifi ve substratı ve -20 ° C'de saklayın Negatif kontrol için kalan tamponu ve alikotu kaydedin ve -20 ° C'de saklayın.
Paraformaldehit %16Elektron Mikroskobu Bilimleri15710Bir PVDF şırınga filtresinden süzerek stoğu hazırlayın (Millex cat. no. SLVV033RS) ve çeker ocak altında alikot. -20 ° C'de saklayın.
Penisilin-streptomisin 10.000 U/mLGibco15140-122
Pipet yardımcısı
Lüminesan özellikli plaka okuyucuBioTekSynergy HTbu özelliklere sahip herhangi bir plaka okuyucu kullanılabilir
RPMI 1640 medyaCorning10-040-CV
NeşterAndwin2975#21
Stericup Quick Release-GP steril vakum filtrasyon sistemi, 0.22 & m PES Express PLUS, 500 mLEMD Millipore S2GPU05RE
Steriflip-GP filtre, 0.22 & m PES Express PLUS, 50 mLEMD KırlangıçSCGP00525
Steril forsepsThermo Fisher Scientific12-000-157
T25 şişeleri, doku kültürü ile tedaviCorning430639
T75 şişeleri, doku kültürü ile tedavi edilmişCorning430641U
Tripan mavisi çözeltisi %0,4Gibco15250-061
Tripsin EDTA %0,05 Corning25-052-CI
ViaStain akridin portakal / propidyum iyodür (AO / PI) çözeltisiNexcelomCS2-0106-5ML
santrifüj edilmiş

Kaynaklar

  1. Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
  2. Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
  3. Testa, J. R., Berns, A. Preclinical models of malignant mesothelioma. Frontiers in Oncology. 10, 101(2020).
  4. Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
  5. Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
  6. Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
  7. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  8. Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
  9. Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
  10. Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
  11. Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
  12. Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tümör Hücresi GenişletmePrimer Tümör HatlarıTümör DisosiasyonuDiferansiyel TripsinizasyonFibroblast KontaminasyonuFenotipik KarakterizasyonAkış SitometrisiKriyoprezervasyonYüzey Markörü Ekspresyonu
Primer, Malign Plevral Mezotelyoma Tümör Hatlarının Oluşumu ve Genleşmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.