Yöntem makalesi
Bir lentiviral shRNA havuzu kullanılarak yüksek verimli RNA girişimi (RNAi) taraması, malignitelerde terapötik olarak ilgili sentetik ölümcül hedefleri tespit etmek için bir araç olabilir. Akut miyeloid lösemide (AML) epigenetik efektörleri araştırmak için havuzlanmış bir shRNA tarama yaklaşımı sunuyoruz.
Kazanılmış kemo-direncin klinik olarak ilgili itici mekanizmalarını anlamak, akut miyeloid lösemili (AML) hastalarda direnci atlatmanın ve sağkalımı iyileştirmenin yollarını aydınlatmak için çok önemlidir. Kemoterapiden kurtulan lösemik hücrelerin küçük bir kısmı, kemoterapötik hakareti tolere etmek için hazır bir epigenetik duruma sahiptir. Kemoterapiye daha fazla maruz kalmak, bu ilaç persister hücrelerin sabit bir epigenetik duruma ulaşmasını sağlar, bu da değişmiş gen ekspresyonuna yol açar, bu da ilaca dirençli popülasyonların çoğalmasına ve sonunda nüks veya refrakter hastalığa neden olur. Bu nedenle, ilaca dirençli lösemik hücrelerin sağkalımını gerektiren epigenetik modülasyonların belirlenmesi kritik öneme sahiptir. Kazanılmış bir sitarabin-dirençli AML hücre hattında havuzlanmış shRNA kütüphanesi taramasını kullanarak nükleozid analog sitarabin'e (AraC) dirence aracılık eden epigenetik modülatörleri tanımlamak için bir protokol detaylandırıyoruz. Kütüphane, yüksek verimli epigenetik faktör taramasına izin veren 407 insan epigenetik faktörünü hedefleyen 5.485 shRNA yapısından oluşmaktadır.
Akut miyeloid lösemide (AML) terapötik seçenekler neredeyse son elli yıldır değişmeden kalmıştır ve sitarabin (AraC) ve antrasiklinler hastalığın tedavisinde temel taşı olarak kullanılmıştır. AML tedavisinin başarısındaki zorluklardan biri, lösemik kök hücrelerin kemoterapiye direncidir ve bu da hastalığın nüksetmesine yol açar 1,2. Epigenetik regülasyon kanser patogenezinde ve ilaç direncinde hayati bir rol oynamaktadır ve umut verici terapötik hedefler olarak çeşitli epigenetik faktörler ortaya çıkmıştır 3,4,5. Epig....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBSC) yönergelerini takip edin ve lentivirüsü (BSL-2) işlemek için uygun tesisi kullanın. Personel, lentivirüsün kullanımı ve bertarafı konusunda uygun şekilde eğitilmelidir. Bu protokol, Vellore'deki Christian Medical College'ın biyogüvenlik yönergelerini takip etmektedir.
1. ShRNA'ların kalıcı ve uzun süreli ekspresyonunu elde etmek için en güçlü promotörün seçimi
NOT: Deney için seçilen hücre hattında shRNA'ların kararlı ve uzun süreli ekspresyonunu sağlayan promotörü tanımlamak için floresan proteinlerini eksprese eden farklı promotörlere sahip lentiviral vektörl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Genel tarama iş akışı Şekil 1A'da gösterilmiştir. MV4-11 AraC R'nin (48 h) in vitro sitotoksisitesi, MV4-11 AraC R'deki IC50'nin sitarabine, MV4-11 P'den daha yüksek olduğunu ortaya koydu (Şekil 1B). Bu hücre hattı çalışmada sitarabin direncinden sorumlu epigenetik faktörlerin taranmasında model olarak kullanılmıştır.
Şekil 2A , doğrusallaştırılmış pZIP vektör haritalarını üç fa.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
RNA girişimi (RNAi), siRNA ve shRNA taramasını içeren fonksiyonel genomik çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. ShRNA'nın yararı, plazmid vektörlerine dahil edilebilmeleri ve genomik DNA'ya entegre edilebilmeleri, böylece kararlı ekspresyon ve dolayısıyla hedef mRNA'nın daha uzun süreli nakavtıyla sonuçlanmalarıdır. Havuzlanmış shRNA kütüphanesi taraması, geleneksel dizili ekranlara (siRNA) kıyasla sağlam ve uygun maliyetlidir. Genom çapında bir ekranda belirli bir protein sınıfının özgünlüğünü tanımlamak hanta.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların çıkar çatışması ve açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Bu çalışma kısmen SRV'ye BT / PR8742 / AGR / 36/773/2013 hibe Biyoteknoloji Bölümü tarafından finanse edilmektedir; ve Biyoteknoloji Bölümü Hindistan BT / COE / 34 / SP13432 / 2015 ve Bilim ve Teknoloji Bölümü, Hindistan: EMR / 2017 / 003880 ila P.B. RVS ve P.B. sırasıyla Wellcome DBT Hindistan İttifakı IA / S / 17/1 / 503118 ve IA / S / 15 / 1 / 501842 tarafından desteklenmektedir. S.D. CSIR-UGC bursu tarafından desteklenmektedir ve S.I. ICMR kıdemli araştırma bursu tarafından desteklenmektedir. Abhirup Bagchi, Sandya Rani ve CSCR Flow Cytometry Core Facility personeline yardımları için teşekkür ederiz. MedGenome Inc.'e de yüksek verimli dizileme ve veri analizine ya....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifler< / güçlü> | |||
| 100 bp Merdiven Hiper Merdiven | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Merdiven Hiper Merdiven | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agaroz | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betain (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Borik | Asit Nitelikleri | 12005 | |
| Hücre kültürü plastik malzeme | Uygulanabilir | ||
| Sitozin ve beta;-D-arabinofuranosid hidroklorür | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | ||
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Kriyöz DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Etidyum Bromür | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Sığır Serumu | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Jel/PCR Saflaştırma Kiti | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Buzul Asetik Asit | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plazmid | Transomik | TransOmik Promotör seçim KITI | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promotör seçimi KITI | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 hücre hattı | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Sıcak Başlangıç Polimeraz | Merck | 71086 | |
| Molm13 hücre hattı | Ellen Weisberg Laboratuvarı, Dana Farber Kanser Enstitüsü, Boston, MA, ABD | Dana Farber Kanser Enstitüsü, Boston, MA, ABD | |
| MV4-11 hücre hattı | ATCC | CRL-9591 | |
| Penisilin streptomisin | Thermo Fisher Bilimsel | ||
| psPAX2 ve pMD2.G | Addgene Addgene | plazmid no.12260 & Addgene plazmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Test Kiti | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plazmid | Transomik | TransOmics Promotör seçim KITI | |
| Transomics'ten shERWOOD-UltrmiR shRNA Kütüphanesi | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Parti No: A116. V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus Mirus | Mirus | Katalog Numarası: MIR2300 | |
| Tris | MP Biyomedikal | 0219485591 | |
| Tripan Mavi | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra santrifüj Tüpleri | Beckman Coulter | 103319 | |
| Ekipmanlar< / güçlü> | |||
| <2 / alt> inkübatörü | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III hücre sıralayıcı | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultrasantrifüj | Beckman Coulter | ||
| Santrifüj | Thermo Multiguge 3SR + | ||
| ChemiDoc Görüntüleme sistemi ( Fluro Chem M sistemi) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Işık Mikroskobu | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Florometre | Invitrogen | ||
| Termal Döngüleyici | BioRad |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste