Bir İlaç Direnci Fenotipini Modüle Eden Faktörleri Tanımlamak için Havuzlanmış shRNA Kütüphanesi Taraması

Akut miyeloid lösemide (AML) terapötik seçenekler neredeyse son elli yıldır değişmeden kalmıştır ve sitarabin (AraC) ve antrasiklinler hastalığın tedavisinde temel taşı olarak kullanılmıştır. AML tedavisinin başarısındaki zorluklardan biri, lösemik kök hücrelerin kemoterapiye direncidir ve bu da hastalığın nüksetmesine yol açar ^1,2. Epigenetik regülasyon kanser patogenezinde ve ilaç direncinde hayati bir rol oynamaktadır ve umut verici terapötik hedefler olarak çeşitli epigenetik faktörler ortaya çıkmıştır ^3,4,5. Epigenetik düzenleyici mekanizmalar, kemoterapötik ilaçlara sürekli maruz kalma durumunda proliferasyonu ve sağkalımı etkilemektedir. Hematolojik olmayan malignitelerde yapılan çalışmalar, ilaç etkisinin üstesinden gelen hücrelerin küçük bir kısmının çeşitli epigenetik modifikasyonlara uğradığını ve bu hücrelerin hayatta kalmasına neden olduğunu bildirmiştir ^6,7. Bununla birlikte, epigenetik faktörlerin AML'de sitarabina karşı edinilmiş dirence aracılık etmedeki rolü araştırılmamıştır.

Yüksek verimli tarama, zamanla küresel önem kazanmış ve hücresel mekanizmalarda, yol profillemede ve moleküler düzeyde^potansiyel hedefleri tanımlamak için farklı yönlerden standart bir yöntem haline gelen ilaç keşfine bir yaklaşımdır ^8,9. Sentetik öldürücülük kavramı, her iki genin de tek başına pertürbasyonunun canlı olduğu, ancak her iki genin aynı anda canlılık kaybına neden olduğu iki gen arasındaki etkileşimi içerir¹⁰. Kanser tedavisinde sentetik öldürücülüğün kullanılması, sağlam sentetik öldürücü genetik etkileşimlerin tanımlanmasına ve mekanik olarak karakterize edilmesine yardımcı olabilir¹¹. AML'de edinilmiş sitarabin direncinden sorumlu epigenetik faktörleri tanımlamak için sentetik öldürücülüğe sahip yüksek verimli shRNA taramasının kombinatoryal bir yaklaşımını benimsedik.

Karışık soy lösemi geninin (MLL veya KMT2A) kromozomal translokasyonu ile yönlendirilen akut lösemilerin, hastalarda kötü sağkalım ile ilişkili olduğu bilinmektedir. MLL gen yeniden düzenlemelerinin ortaya çıkan kimerik ürünleri, yani MLL füzyon proteinleri (MLL-FP'ler), hematopoetik kök / progenitör hücreleri (HSPC'ler) çoklu epigenetik faktörlerin katılımıyla lösemik patlamalara dönüştürebilir. Bu epigenetik düzenleyiciler, lösemi programının sürdürülmesini belirleyen karmaşık bir ağ oluşturur ve bu nedenle potansiyel terapötik hedefler oluşturabilir. Bu bağlamda, MV4-11 AraC R olarak adlandırılan edinilmiş sitarabin dirençli hücre hattını geliştirmek için MV4-11 hücre hattını (FLT3-ITD mutasyonu ile MLL füzyon geni MLL-AF4'ü barındıran; MV4-11 P olarak adlandırılır) kullandık. Hücre hattı, ilaç tatili olarak bilinen ilaç tedavisinden aralıklı iyileşme ile artan dozlarda sitarabin'e maruz kaldı. Yarı-maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50) in vitro sitotoksisite testi ile değerlendirildi.

Bir pZIP lentiviral omurgaya sahip hEF1a promotörü tarafından yönlendirilen havuzlanmış epigenetik shRNA Kütüphanesini (bkz. Bu kütüphane, 407 epigenetik faktörü hedefleyen shRNA'lardan oluşur. Her faktörde 5-24 shRNA bulunur ve beş hedeflemeyen kontrol shRNA'sı da dahil olmak üzere toplam 5.485 shRNA bulunur. Modifiye edilmiş "UltrmiR" miR-30 iskelesi, verimli primer shRNA biyogenezi ve ekspresyonu^12,13 için optimize edilmiştir.

Bu deneyin ana hatları Şekil 1A'da gösterilmiştir. Mevcut protokol, bir süspansiyon hücre hattı olan MV4-11 AraC R hücre hattındaki epigenetik faktör shRNA kütüphanesini kullanarak RNAi taramasına odaklanmaktadır (Şekil 1B). Bu protokol, kişinin seçtiği herhangi bir ilaca dirençli hücre hattındaki hedeflenen herhangi bir kütüphaneyi taramak için kullanılabilir. Transdüksiyon protokolünün yapışkan hücreler için farklı olacağına dikkat edilmelidir.

Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBSC) yönergelerini takip edin ve lentivirüsü (BSL-2) işlemek için uygun tesisi kullanın. Personel, lentivirüsün kullanımı ve bertarafı konusunda uygun şekilde eğitilmelidir. Bu protokol, Vellore'deki Christian Medical College'ın biyogüvenlik yönergelerini takip etmektedir.

1. ShRNA'ların kalıcı ve uzun süreli ekspresyonunu elde etmek için en güçlü promotörün seçimi

NOT: Deney için seçilen hücre hattında shRNA'ların kararlı ve uzun süreli ekspresyonunu sağlayan promotörü tanımlamak için floresan proteinlerini eksprese eden farklı promotörlere sahip lentiviral vektörler kullanarak bir transdüksiyon deneyi yapmak önemlidir. Bu amaçla en sık kullanılan promotörler, yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden hEF1α (insan uzama faktörü 1α), hCMV (insan sitomegalovirüsü) ve SSFV (dalak odak oluşturan virüs) promotörleridir (Şekil 2A).

1. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücre sayımını gerçekleştirin. MV4-11 AraC R hücrelerini, 8 μg / mL polibren içeren% 10 RPMI ortamında (100 U / mL penisilin ve 100 U / mL streptomisin ile desteklenmiş% 10 FBS ile% 10 FBS ile RPMI) askıya alın. Tohum 1 x 10⁶ hücre 1.5 mL orta/kuyucuk içinde altı delikli bir plaka halinde üçlü olarak.
2. Her bir oyuğa farklı hacimlerde konsantre lentivirüsler (örneğin, lentivirüslerin titresine bağlı olarak 10 μL, 20 μL ve 40 μL) ekleyin. İçeriği karıştırmak için plakayı yavaşça döndürün.
3. 90 dakika boyunca 37 °C'de 920 x g'de santrifüjleme ile serpinti gerçekleştirin.
4. Plakaları derhal bir CO 2 inkübatöründe inkübe edin (37 ° C'de% 5 CO₂).
5. Başarılı bir transdüksiyon sağlamak için GFP ekspresyonunu 48 saat sonra bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
6. Transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için 72 saat sonra akış sitometrisi ile GFP ekspresyonunu ölçün.
7. Hücreleri toplam 2 hafta boyunca kültürleyin ve GFP ekspresyonunu periyodik olarak akış sitometrisi ile izleyin. Ortalama floresan yoğunluğu ve GFP + hücrelerinin yüzdesi ile ölçülen GFP ekspresyonundaki azalma, promotör susturulmasını gösterir.
8. GFP + hücrelerini 10. günde sıralayın ve sıralamadan sonra hücreleri 1 hafta boyunca kültürleyin. GFP ekspresyonunu kültür sırasında periyodik olarak kontrol edin.
9. Kapıyı ayarlamak için dönüştürülmemiş hücreleri kullanın. X ekseninde sağa doğru 1 x 10¹ ölçeğinin ötesinde bir popülasyon, GFP için pozitif bir popülasyon olarak kabul edilir.
10. Hücrelerin uzun süreli kültüründe GFP'nin kalıcı bir ekspresyonunu gösteren promotörü seçin.

2. Havuzlanmış lentiviral insan epigenetik faktör shRNA kütüphanesinin hazırlanması

1. Her plakada 8 mL% 10 DMEM ortamı (100 U / ml penisilin ve 100 U / ml streptomisin içeren% 10 FBS içeren DMEM) içeren üç adet 10 cm hücre kültürü kabında kültür 293T hücreleri (iyi bir proliferasyon hızına sahip düşük bir geçiş sayısında).
2. Hücreler% 60 akıcılığa ulaştığında, ortamı tam bir ortamla değiştirin.
3. Serumsuz ortam, lentiviral ambalaj (psPAX2) ve zarf plazmidi (pMD2.G), havuzlanmış kütüphane plazmidleri ve son olarak transfeksiyon reaktifi içeren transfeksiyon karışımını ( Tablo 1'de belirtildiği gibi) hazırlayın.
4. İyice karıştırmak için karışıma dokunun ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
5. Transfeksiyon karışımını 293T hücrelerine ekleyin ve plakaları döndürerek yavaşça karıştırın. Plakaları bir CO 2 inkübatöründe inkübe edin (37 ° C'de% 5 CO₂). Ortamı 24 saat sonra değiştirin.
6. 48 saat sonra, 293T hücrelerinde yüksek transfeksiyon verimliliği sağlamak için bir floresan mikroskobu altında GFP ekspresyonunu kontrol edin.
7. Virüs süpernatantlarını 48 saat, 60 saat ve 72 saat sonra toplayın ve 4 ° C'de saklayın. Virüsü topladıktan sonra her zaman noktasına taze ortam (8 mL) ekleyin.
8. Virüs süpernatantlarını bir havuza alın. Havuzlanan virüslerin toplam hacmi şöyle olacaktır: ~8 mL/plaka x 3 koleksiyon= ~24 mL/plaka; ~24 mL/plaka x 3 plaka = 3 plakadan ~72 mL.
9. Havuza alınmış virüsleri 0,4 μm filtreyle filtreleyin.
10. Yüksek bir virüs titresi elde etmek için, havuzlanmış virüsleri ultrasantrifüjleme ile konsantre edin. Filtrelenmiş virüs süpernatanı iki adet 70 Ti tüpe (32 mL/tüp) aktarın ve yavaş hızlanma ve yavaşlama ile 2 saat boyunca 18.000x g'de santrifüj yapın. 4 °C'ye kadar önceden soğutulmuş bir rotor ve santrifüj kullanın.
11. Tüpleri santrifüjden yavaşça çıkarın ve süpernatantı tamamen çıkarın.
12. Bir mikropipet kullanarak, peleti 400 μL DMEM'de (FBS ve antibiyotik olmadan) nazikçe askıya alın. Buz üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin ve peletleri her iki tüpten de karıştırın.
13. Virüsleri alikote edin ve -80 ° C'de dondurun.
    NOT: Tüpler ve virüsler 2.10.-2.13 adımları sırasında buz üzerinde tutulmalıdır. Virüsü düz ortamla askıya alırken köpürmekten kaçının. Ortam 4 °C'de tutulmalıdır.
14. Virüsün konsantrasyonunu (x) aşağıdaki gibi hesaplayın:
    Konsantrasyon öncesi toplam hacim = 72 mL (72.000 μL)
    Konsantre olduktan sonraki hacim = 400 μL
    Konsantrasyon = 72.000/400= 180x

3. Lentivirüslerin transdüksiyon etkinliğinin tahmini

1. Lentivirüslerin başarılı bir şekilde hazırlandığını doğrulamak için konsantre virüs ile 293T hücrelerini farklı hacimlerde (2 μL, 4 μL, 8 μL) dönüştürün.
   NOT: Konsantre virüsler küçük hacimlerde (1-2 μL) yüksek iletim verimliliği (>%50) gösteriyorsa, konsantre virüsün istenen miktarlarda (100x ila 75x) seyreltilmesi önerilir.
2. MV4-11 AraC R hücre hattında titrasyon deneyleri gerçekleştirmek için konsantre virüsü DMEM ile (FBS ve antibiyotikler olmadan) 100 kata kadar seyreltin.
3. Tohum 1 x 10⁶ hücre (MV4-11 AraC R hücre hattı, 8 μg / mL polibren içeren 1.5 mL% 10 RPMI ortamında) altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğunda. Farklı hacimlerde virüslerle dönüştürmek için dört kuyucuk hazırlayın.
4. 100x virüslerden oluşan dört farklı birim (örneğin, 1 μL, 1,5 μL, 2 μL ve 2,5 μL) ekleyin.
5. 37 °C'de 90 dakika boyunca plakanın 920 x g'de santrifüjlenmesiyle serpinti yapın.
6. 72 saat sonra, GFP + hücrelerinin yüzdesini akış sitometrisi ile ölçün.
7. %30 iletim verimliliği elde etmek için virüslerin hacmini belirleyin. Bu düşük iletim verimliliği, hücre başına tek shRNA entegrasyonu sağlamaktır.

4. İlaca dirençli hücre hattında havuzlanmış epigenetik shRNA kütüphanesinin transdüksiyonu

1. Hedef hücre hattı MV4-11 AraC R'yi 0,5 x 10⁶ hücre/mL yoğunlukta tutun. Hücrelerin kültürde üstel büyüme aşamasında olduğundan emin olun.
2. Deney için alınacak hücre sayısını, viral integrantların sayısına göre aşağıdaki gibi hesaplayın.
   Transdüksiyon için gerekli hücre sayısı = 5.485 (shRNA sayısı) × 500 (katlanır shRNA gösterimi) / 0.25 (MOI) = 10.982.000 ~11 x 10⁶ hücre
3. 16 mL'lik %10 RPMI ortamında 1,1 x 10⁷ hücreyi yeniden askıya alın.
4. Polibrene (8 μg / mL) ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından, önceki bölümde hesaplandığı gibi %30 iletim verimliliği elde etmek için gerekli virüs hacmini ekleyin.
5. Tüm hücreleri altı kuyucuklu bir plaka üzerinde 1 x 10⁶ hücre / 1.5 mL'lik bir yoğunlukta kuyu başına% 10 RPMI ortamına tohumlayın.
6. Plakayı 37 °C'de 920 x g'de 90 dakika santrifüj yapın.
7. Plakayı bir CO 2 inkübatöründe gece boyunca inkübe edin (37 ° C'de% 5 CO₂ ).
8. 24 saat sonra, ortamı değiştirin ve dönüştürülmüş hücreleri bir T-75 şişesine aktarın.
9. 48 saat sonra, başarılı bir transdüksiyon sağlamak için GFP'yi bir floresan mikroskobu altında kontrol edin.
10. 72 saat sonra, GFP + hücrelerinin yüzdesini akış sitometrisi ile sayın.

5. GFP pozitif hücrelerin zenginleştirilmesi

NOT: Dönüştürülen hücreleri 5-7 gün boyunca 0,5 x 10⁶ hücre/mL yoğunlukta kültürleyerek genişletin. Bu hücreler, bir sonraki adımda belirtildiği gibi, GFP'ye göre sıralanarak seçilen, dönüştürülmüş ve dönüştürülmemiş karışık bir popülasyondur.

1. GFP+ dönüştürülmüş hücrelerin, akış sıralama ayarları yüksek saflık ve düşük verim olarak ayarlanmış şekilde akış ayıklamasını gerçekleştirin. Kapıyı ayarlamak için dönüştürülmemiş hücreleri kullanın. 1 x 10^2'nin ötesinde sağa doğru bir popülasyon pozitif bir popülasyon olarak kabul edilir.
2. Sıralanmış hücreleri% 5 RPMI'da toplayın (100 U / mL penisilin ve 100 U / mL streptomisin ile desteklenmiş% 5 FBS ile RPMI).
3. Sıralanmış hücreleri% 10 RPMI ortamında kültürleyin.
4. 72 saat sonra, %95 > sıralama verimliliği sağlamak için GFP+ hücrelerinin yüzdesinin sıralama sonrası tahminini gerçekleştirin.
   NOT: shRNA kütüphanesinin 450x ila ~500x^temsilini elde etmek için sıralamadan sonra ~3-5 x 10 6 GFP pozitif hücre elde ettiğinizden emin olun.

6. İlaç direncine aracılık eden epigenetik faktörleri tanımlamak için bırakma taraması

1. ShRNA kütüphanesini kültüre alın, hücreleri 5 güne kadar% 10 RPMI'da dönüştürdü. Kriyoproteksiyon, gerekirse ilaç tedavisinden önce gelecekteki deneyler için dönüştürülmüş hücreleri korur.
2. 25 °C'de 5 dakika boyunca 280 x g'de 1 x 10⁷ hücreyi çift halinde santrifüj yapın. Süper natantı atın ve peletleri -80 ° C'de saklayın. Bu örnekler epigenetik shRNA kütüphanesi için temel referans görevi görecektir.
3. Kalan dönüştürülmüş hücreleri, her biri kitaplığın 500x temsilini sağlayan bir hücre sayısında tutulan kopyalar (R1 ve R2) olarak kültürleyin.
4. Kopyalardan birini ilaçla (10 μM sitarabin) (R2) ve diğerini ilaç tedavisi (R1) olmadan tedavi edin.
5. Her 72 saatte bir ilaçla ve ilaçsız şişelerin ortamını değiştirin. 9 günlük kümülatif ilaç maruziyeti için orta değişimi 3x tekrarlayın.
6. 9 günlük ilaç tedavisinden sonra, tripan mavisi dışlama yöntemiyle hücrelerin yaşayabilirliğini kontrol edin.
7. Kalan hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 280 x g'de santrifüj yapın. Steril PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın ve hücreleri yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 280 x g'de santrifüj.
8. Süpernatantı atın ve DNA ekstraksiyonu için peletleri -80 ° C'de saklayın.

7. Entegre shRNA'ların PCR ile amplifikasyonu

1. DNA'yı, dönüştürülmüş bazal hücrelerden (T) (adım 6.2.) ve ilaçla tedavi edilen (R2) ve ilaçla tedavi edilmeyen hücrelerden (R1) çıkarın.
2. Bir florometre kullanarak numunenin konsantrasyonunu kontrol edin.
3. PCR için gerekli DNA miktarını aşağıdaki gibi hesaplayın:
   5,485 (hayır. shRNA'ların) × 500 (shRNA gösterimi) × 1 x 6.6⁻¹² (g/diploid genom) = 15 μg DNA
4. Örnekleri PCR'nin ilk turuna tabi tutun.
   NOT: PCR reaksiyon karışımı, termal döngü koşulları ile birlikte Tablo 2'de gösterilmiştir. Astarların detayları Ek Tablo 1'de verilmiştir.
5. Tüp başına 850 ng DNA içeren çoklu reaksiyonlar ayarlayın (toplam 43 reaksiyon için).
   NOT: PCR'nin ilk turu, shRNA'nın yan bölgelerini yükseltir ve 397 bp'lik bir amplikon boyutu ile sonuçlanır.
6. PCR ürünlerini bir araya getirin ve standart bir jel / PCR saflaştırma kitinin 3-4 sütununu kullanarak PCR ürünlerini saflaştırın.
   NOT: Ayrıntılar Tablo 3'te verilmiştir.
7. Ürünü her kolondan 50 μL tamponda süzün ve elutları bir araya getirin.
8. DNA'yı nicelleştirin ve -20 ° C'de saklayın.
   NOT: Reaktifler, termal döngücü koşulları ile Tablo 4'te tablolaştırılmıştır. İkinci tur PCR, tek akışlı bir hücrede NGS'de çoklama için gerekli olan INDEX dizisine sahip primerleri kullanır. Bu nedenle, her örnek farklı bir dizinle etiketlenmelidir. Astar dizileri Ek Tablo 1'de verilmiştir.
9. Her numune ve negatif kontrol için toplam 50 μL reaksiyon hacminde 500 ng birincil PCR ürünü ile dört reaksiyon ayarlayın.
10. % 2 TBE agaroz jeli kullanarak tüm ürünü elektroforez için yükleyin ve 1 kb'lik bir moleküler merdiven kullanarak bant boyutunu onaylayın. Amplikonun boyutu 399 bp'dir.
11. PCR ürünlerini jel dokümantasyon sisteminde görselleştirin.
12. Belirli bandı tüketin ve bir jel saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın.
    NOT: Kit ile saflaştırma hesaplamaları Tablo 3'te verilmiştir.
13. 30 μL elüsyon tamponunun son hacminde elut. Her bir elüentin yaklaşık konsantrasyonu, toplam hacmi 30 μL olan yaklaşık 80-90 ng / μL olacaktır.

8. Yeni nesil sıralama ve veri analizi

1. Jel saflaştırılmış ürünü adım 7.13'ten itibaren sıralayın. tükenmiş shRNA'lar için okuma sayısını elde etmek için yeni nesil bir sıralayıcıda (örneğin, Illumina).
2. Fastx takım kitini (sürüm 0.7) kullanarak oluşturulan FastQ okumalarının adaptör dizilerini kırpın.
3. Filtrelenmiş okumaları, iki uyumsuzluğa izin verme parametresiyle bir Bowtie hizalayıcısı kullanarak referans dizilerine hizalayın. Adaptör kırpmasından sonra okuma uzunluğunun yaklaşık 21 bp olduğundan emin olun.
4. Samtools (sürüm 1.9) programını kullanarak dosyaları yükleyin. Flagstat seçeneğini kullanın ve hizalama özetini hesaplayın.
5. Kırpılmış fastQ dosyalarını CRISPRCloud2 (CC2) yazılımına (https://crispr.nrihub.org/) referans shRNA dizileriyle birlikte FASTA dosyaları biçiminde yükleyin ve talimatları uygulayarak analizi gerçekleştirin.
   1. CC2'deki Analizi Başlat bağlantısına tıklayın.
   2. Ekran türünü Hayatta Kalma ve Bırakma ekranları olarak seçin. Grup sayısını ayarlayın ve her grubun adını yazın.
   3. Referans kitaplığını FASTA dosya biçiminde yükleyin. Yüklenen veriler işlenir. Sonuçları almak için çıktı URL'sine tıklayın.
      NOT: Bu yazılım, sgRNA / shRNA seviyelerindeki farklılıkları ölçmek için değiştirilmiş bir Öğrenci t-testi ile bir beta-binom modeli kullanır, ardından gen seviyesi önemini tahmin etmek için Fisher'ın kombine olasılık testi gelir. Tedavi edilen (zenginleştirilmiş/tükenmiş) ve tedavi edilmemiş örnekler (baz çizgisi) arasındaki epigenetik faktörler için shRNA'ların tahmini log 2 kat değişikliklerini (Log2Fc) "p-değerleri" ve "FDR değerleri" ile hesaplar.
6. FDR değerinin Bırakma ekranı için "Negatif" ve Hayatta Kalma ekranı için "Pozitif" olduğundan emin olun.
   NOT: CC2, okumaları saymak ve shRNA'ların örnekler arasındaki kıvrım gösterimini (zenginleştirme veya tükenme) hesaplamak için kullanılan bir analiz platformudur.
7. CC2 sonuçlarından önemli ölçüde zenginleştirilmiş ve tükenmiş shRNA'ları (FDR <0.05) tanımlayın.
   NOT: Her faktöre karşı 5-24 shRNA vardır. shRNA'ların her biri için FDR değerlerini kontrol edin; <0.01 olan FDR'yi düşünün ve seçilen shRNA'lar için bir ortalama alın. En iyi 40 isabeti düşünün. Log2Fc veya FDR negatif değerlerine göre seçilen faktörlerin grafiğini çizin. Hedeflemeyen shRNA'ların, kontrol shRNA'ları olarak hizmet ettikleri için verilerin orijinalliğini sağlamak için önemli FDR değerlerine sahip olduklarından emin olun.

Genel tarama iş akışı Şekil 1A'da gösterilmiştir. MV4-11 AraC R'nin (48 h) in vitro sitotoksisitesi, MV4-11 AraC R'deki IC50'nin sitarabine, MV4-11 P'den daha yüksek olduğunu ortaya koydu (Şekil 1B). Bu hücre hattı çalışmada sitarabin direncinden sorumlu epigenetik faktörlerin taranmasında model olarak kullanılmıştır.

Şekil 2A , doğrusallaştırılmış pZIP vektör haritalarını üç farklı promotörle göstermektedir: hEF1α (insan uzama faktörü 1α), hCMV (insan sitomegalovirüsü) ve SSFV (dalak odağı oluşturan virüs), UltramiR dizisi içindeki karıştırılmış shRNA ile. Şekil 2B, kütüphane deneyinde kullanılan pZIP vektör haritasını ve hEF1a promotörü tarafından yönlendirilen seçilebilir belirteç olarak Zsgreen ve puromisin ile epigenetik faktörü hedefleyen shRNA'yı göstermektedir. Bu vektörler en güçlü promotör deneyinin seçiminde kullanılmıştır.

Hedef hücrelerde tutarlı ve uzun süreli bir ekspresyon elde etmek için en güçlü promotörün seçimi Şekil 3'te gösterilmiştir. MFI ile ölçülen GFP'nin miktarı, her üç promotör için de MV4-11 AraC R'de 72 saatin sonunda% 90'dan fazla transdüksiyon verimliliği göstermiştir. GFP ekspresyonu için histogram, hCMV için heterojen bir popülasyonu, ancak transdüksiyonun 3. gününde hEF1a ve SFFV durumunda homojen bir popülasyonu göstermektedir (Şekil 3A). Çubuk grafik, MV4-11 AraC R'de transdüksiyonun 3. gününde üç farklı promotör (hEF1α, hCMV ve SFFV) tarafından yönlendirilen GFP ekspresyonunu göstermektedir (Şekil 3B). SFFV güdümlü GFP, transdüksiyonun 5. gününde MFI'da bir azalma gösterdi (Şekil 3C). hEF1a güdümlü GFP transdüced MV4-11 ebeveyn hattı sonrası sıralamada MFI'da azalma gözlenmedi. Böylece, hEF1a promotörü hücre hattı için uygun bir promotör olarak tanımlanmıştır (Şekil 3D).

Şekil 4A, 48 saatlik transfeksiyondan sonra 293T hücrelerinde havuzlanmış shRNA kütüphanesi plazmidlerinin transfeksiyon verimliliğini göstermektedir. GFP ifadesi parlaktı ve iyi transfeksiyon verimliliğini gösteriyordu. Virüs toplama sonrasında, hazırlanan havuzlanmış virüsün transdüksiyon verimliliği, 293T hücrelerinde üç farklı konsantrasyonda (2 μL, 4 μL ve 8 μL) kontrol edildi. 2 μL virüsünün bile 8 μL virüsünkiyle aynı verimle sonuçlandığını ve böylece yüksek viral titreyi doğruladığını gözlemledik (Şekil 4B).

Şekil 5 , MV4-11 AraC R hücre hattında havuzlanmış kütüphane transdüksiyonunu ve lentiviral titrenin belirlenmesini göstermektedir. Havuzlanmış shRNA kütüphanesi lentivirüsü 100x seyreltildi ve daha sonra MV4-11 AraC R hücre hattına farklı hacimlerde (1 μL, 1.5 μL, 2 μL ve 2.5 μL) eklendi. Verimlilik 72 saatin sonunda kontrol edildi. Transdüksiyon verimliliği, virüsün 2-2.5 μL'si için% 30 idi ve hücre başına bir shRNA entegrasyonunu doğruladı (Şekil 5A). 1.1 x 107 MV4-11 AraC R hücrelerinde 2.5μl havuzlanmış kütüphane virüsü ile transdüksiyon% 30 transdüksiyon verimliliği ile sonuçlandı. GFP-pozitif hücreler, havuzlanmış shRNA kütüphanesini temsil eden sıralandı (Şekil 5B).

MV4-11 AraC R hücre hattında havuzlanmış shRNA epigenetik lentivirüsünün transdüksiyonundan sonra, GFP-pozitif hücreler 5. gün veya 7. günde sıralandı (Şekil 6). Bu sıralanmış hücreler 9 gün boyunca sitarapine uzun süre maruz kaldı. Canlılık 9. günde kontrol edildi ve hücreler DNA için toplandı. (Şekil 6A). Çubuk grafik, sitarabin varlığında transdüke edilen hücrelerin proliferasyon hızındaki azalmayı göstermektedir (Şekil 6B).

Örneklerden çıkarılan DNA, iki tur PCR'ye tabi tutuldu ve son jel salınımlı ürün, NGS tarafından nicelleştirilen zenginleştirilmiş shRNA'ları temsil etti. Şekil 7A, PCR'nin 1. ve 2. turlarında kullanılan astarın bağlanma bölgelerini göstermektedir; burada 1. tur primerler, entegre shRNA'nın yan bölgelerine bağlanır ve 2. ileri astar, döngü dizisine bağlanır. Ters astar, PCR'nin 1. turunda yükseltilmiş vektörün bir bölgesine bağlanır. Şekil 7B ve Şekil 7C, jel salınımlı, saflaştırılmış ve NGS analizi için gönderilen 1. (397 bp) ve 2. tur PCR (399 bp) sonunda PCR ürününün bant boyutunu göstermektedir.

DNA'yı standart bir kalite kontrol prosedürüne tabi tuttuktan sonra, örnekler NGS analizi için işlendi. Havuzlanmış shRNA taramasında zenginleştirilmiş ve tükenmiş shRNA'ları tanımlamak için kullanıcı dostu, bulut tabanlı bir analiz platformu olan CRISPRCloud2'yi kullandık. Şekil 8 , AML'de sitarabin direncine aracılık edebilecek epigenetik faktörleri hedef alan zenginleştirilmiş veya tükenmiş shRNA'ların temsilini göstermektedir.

Şekil 1: Etüdün anahattı ve modeli . (A) İş akışına genel bakışın çizimi. (B) MV4-11 ebeveyn ve AraC'ye dirençli hücreler, artan sitarabin konsantrasyonları (0.1 μM ila 1000 μM) ile tedavi edilir ve MTT testi ile canlılık açısından değerlendirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Doğrusallaştırılmış vektörlerin çizimi. (A) Üç vektör, UltramiR dizisi içindeki karıştırılmış shRNA ile hEF1α (insan uzama faktörü 1α), hCMV (insan sitomegalovirüsü) ve SSFV (dalak odağı oluşturan virüs) olmak üzere üç farklı promotörle haritalandırılır. (B) hEF1α promotörü ile kütüphane deneyinde kullanılan vektör haritasının ve seçilebilir belirteç olarak Zsgreen ve puromisin ile epigenetik faktörü hedefleyen shRNA'nın gösterilmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: shRNA'ların kalıcı ve uzun süreli ekspresyonunu elde etmek için en güçlü promotörün seçimi . (A) hEF1a, hCMV ve SFFV promotörleri için 72 saatin sonunda akış sitometrisi ile ölçülen GFP için temsili akış grafikleri. hCMV heterojen bir tepe noktası gösterirken, hEF1a ve SFFV tek bir homojen tepe noktası gösterir. (B) MV4-11 AraC R hücre hattında promotör verimliliği. (C) SFFV güdümlü GFP, uzun süreli kültürde GFP'nin susturulmasını gösterir. (D) hEF1a güdümlü GFP hücreleri, hücrelerin sıralanmasından sonra sürekli ekspresyon gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Hazırlanan havuzlanmış shRNA lentivirüsünün etkinliğinin kontrol edilmesi . (A) Floresan mikroskopi görüntüleri, 10x büyütme kullanılarak 48 saatin sonunda 293T'de transfekte edilen havuzlanmış shRNA kütüphanesinin transfeksiyon verimliliğini göstermektedir. (B) Havuzlanan virüsün transdüksiyon verimliliği, 10x büyütme kullanılarak değişen virüs hacimlerine (2μL, 4μL ve 8μL) sahip 293T hücrelerinde değerlendirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Hedef hücre hattında havuzlanmış kütüphane transdüksiyonu ve lentiviral titrenin belirlenmesi. (A) MV4-11 AraC R hücre hattı, değişen virüs hacimleriyle (1μL, 1.5μL, 2μL ve 2.5μL) transdüke edildi. Verimlilik, 72 saat sonunda kontrol edildi. (B) Havuzlanmış kütüphane virüsünün 1 x 107 MV4-11 AraC R hücrelerinde transdüksiyonu,% 30 iletim verimliliği elde etmek için, daha sonra GFP-pozitif hücrelerin sıralanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: İlaç direncine aracılık eden epigenetik faktörleri tanımlamak için bırakma taraması . (A) Dirençli hücrelerin zenginleştirilmesi için ilaç tedavisinin şematik gösterimi. Kütüphane ile enfekte olmuş hücreler 9 gün boyunca uzun süreli sitarabin maruziyetine maruz bırakıldı, ardından canlılık kontrol edildi ve DNA ekstraksiyonu için hücreleri topladı. (B) Dirençli hücre hatlarında uzun süreli sitarabin maruziyetine canlılığın azaltılması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Entegre shRNA'yı temsil eden ampliklerin hazırlanması . (A) PCR'nin 1. ve 2. turlarında kullanılan astarın bağlanma bölgeleri, burada 1. yuvarlak primerler entegre shRNA'nın yan bölgelerine bağlanır ve ikinci ileri astar döngü dizisine bağlanır. Tersi, 1. PCR'deki yükseltilmiş vektör bölgesinin bir bölgesine bağlanır. (B) 1. tur PCR'nin (397 bp) sonundaki PCR ürününün bant boyutunun gösterimi. (C) 2. tur PCR ürünü (399bp) jel salınımlı, saflaştırılmış ve NGS için verilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: AML hücre hattında (MV-4-11 Ara-C R hücre hattı) tarama sonuçları. DNA'yı standart bir kalite kontrol prosedürüne tabi tuttuktan sonra, örnekler NGS analizi için işlendi. Havuzlanmış shRNA taramasında zenginleştirilmiş ve tükenmiş shRNA'ları tanımlamak için kullanıcı dostu, bulut tabanlı bir analiz platformu olan CRISPRCloud2'yi kullandık.  Şekil, AML'de sitarabin direncine aracılık edebilecek epigenetik faktörleri hedef alan zenginleştirilmiş veya tükenmiş shRNA'ları temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Transfeksiyon Plazmid Karışımının Hazırlanması (10cm plaka için hesaplama) Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: PCR'nin 1. Turu için PCR reaksiyon karışımı Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: 1. PCR ürünlerinin saflaştırılması için hesaplamalar Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 4: PCR'nin 2. Turu için PCR reaksiyon karışımı Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların çıkar çatışması ve açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.