Yöntem makalesi

Bir İlaç Direnci Fenotipini Modüle Eden Faktörleri Tanımlamak için Havuzlanmış shRNA Kütüphanesi Taraması

2.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63383

⸱

17 Haziran 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Haematology, Christian Medical College, 2Department of Biotechnology, Thiruvalluvar University, 3Centre for Stem Cell Research, Christian Medical College

Bu makalede

Özet

Bir lentiviral shRNA havuzu kullanılarak yüksek verimli RNA girişimi (RNAi) taraması, malignitelerde terapötik olarak ilgili sentetik ölümcül hedefleri tespit etmek için bir araç olabilir. Akut miyeloid lösemide (AML) epigenetik efektörleri araştırmak için havuzlanmış bir shRNA tarama yaklaşımı sunuyoruz.

Özet

Kazanılmış kemo-direncin klinik olarak ilgili itici mekanizmalarını anlamak, akut miyeloid lösemili (AML) hastalarda direnci atlatmanın ve sağkalımı iyileştirmenin yollarını aydınlatmak için çok önemlidir. Kemoterapiden kurtulan lösemik hücrelerin küçük bir kısmı, kemoterapötik hakareti tolere etmek için hazır bir epigenetik duruma sahiptir. Kemoterapiye daha fazla maruz kalmak, bu ilaç persister hücrelerin sabit bir epigenetik duruma ulaşmasını sağlar, bu da değişmiş gen ekspresyonuna yol açar, bu da ilaca dirençli popülasyonların çoğalmasına ve sonunda nüks veya refrakter hastalığa neden olur. Bu nedenle, ilaca dirençli lösemik hücrelerin sağkalımını gerektiren epigenetik modülasyonların belirlenmesi kritik öneme sahiptir. Kazanılmış bir sitarabin-dirençli AML hücre hattında havuzlanmış shRNA kütüphanesi taramasını kullanarak nükleozid analog sitarabin'e (AraC) dirence aracılık eden epigenetik modülatörleri tanımlamak için bir protokol detaylandırıyoruz. Kütüphane, yüksek verimli epigenetik faktör taramasına izin veren 407 insan epigenetik faktörünü hedefleyen 5.485 shRNA yapısından oluşmaktadır.

Giriş

Akut miyeloid lösemide (AML) terapötik seçenekler neredeyse son elli yıldır değişmeden kalmıştır ve sitarabin (AraC) ve antrasiklinler hastalığın tedavisinde temel taşı olarak kullanılmıştır. AML tedavisinin başarısındaki zorluklardan biri, lösemik kök hücrelerin kemoterapiye direncidir ve bu da hastalığın nüksetmesine yol açar 1,2. Epigenetik regülasyon kanser patogenezinde ve ilaç direncinde hayati bir rol oynamaktadır ve umut verici terapötik hedefler olarak çeşitli epigenetik faktörler ortaya çıkmıştır 3,4,5. Epigenetik düzenleyici mekanizmalar, kemoterapötik ilaçlara sürekli maruz kalma durumunda proliferasyonu ve sağkalımı etkilemektedir. Hematolojik olmayan malignitelerde yapılan çalışmalar, ilaç etkisinin üstesinden gelen hücrelerin küçük bir kısmının çeşitli epigenetik modifikasyonlara uğradığını ve bu hücrelerin hayatta kalmasına neden olduğunu bildirmiştir 6,7. Bununla birlikte, epigenetik faktörlerin AML'de sitarabina karşı edinilmiş dirence aracılık etmedeki rolü araştırılmamıştır.

Yüksek verimli tarama, zamanla küresel önem kazanmış ve hücresel mekanizmalarda, yol profillemede ve moleküler düzeydepotansiyel hedefleri tanımlamak için farklı yönlerden standart bir yöntem haline gelen ilaç keşfine bir yaklaşımdır 8,9. Sentetik öldürücülük kavramı, her iki genin de tek başına pertürbasyonunun canlı olduğu, ancak her iki genin aynı anda canlılık kaybına neden olduğu iki gen arasındaki etkileşimi içerir10. Kanser tedavisinde sentetik öldürücülüğün kullanılması, sağlam sentetik öldürücü genetik etkileşimlerin tanımlanmasına ve mekanik olarak karakterize edilmesine yardımcı olabilir11. AML'de edinilmiş sitarabin direncinden sorumlu epigenetik faktörleri tanımlamak için sentetik öldürücülüğe sahip yüksek verimli shRNA taramasının kombinatoryal bir yaklaşımını benimsedik.

Karışık soy lösemi geninin (MLL veya KMT2A) kromozomal translokasyonu ile yönlendirilen akut lösemilerin, hastalarda kötü sağkalım ile ilişkili olduğu bilinmektedir. MLL gen yeniden düzenlemelerinin ortaya çıkan kimerik ürünleri, yani MLL füzyon proteinleri (MLL-FP'ler), hematopoetik kök / progenitör hücreleri (HSPC'ler) çoklu epigenetik faktörlerin katılımıyla lösemik patlamalara dönüştürebilir. Bu epigenetik düzenleyiciler, lösemi programının sürdürülmesini belirleyen karmaşık bir ağ oluşturur ve bu nedenle potansiyel terapötik hedefler oluşturabilir. Bu bağlamda, MV4-11 AraC R olarak adlandırılan edinilmiş sitarabin dirençli hücre hattını geliştirmek için MV4-11 hücre hattını (FLT3-ITD mutasyonu ile MLL füzyon geni MLL-AF4'ü barındıran; MV4-11 P olarak adlandırılır) kullandık. Hücre hattı, ilaç tatili olarak bilinen ilaç tedavisinden aralıklı iyileşme ile artan dozlarda sitarabin'e maruz kaldı. Yarı-maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50) in vitro sitotoksisite testi ile değerlendirildi.

Bir pZIP lentiviral omurgaya sahip hEF1a promotörü tarafından yönlendirilen havuzlanmış epigenetik shRNA Kütüphanesini (bkz. Bu kütüphane, 407 epigenetik faktörü hedefleyen shRNA'lardan oluşur. Her faktörde 5-24 shRNA bulunur ve beş hedeflemeyen kontrol shRNA'sı da dahil olmak üzere toplam 5.485 shRNA bulunur. Modifiye edilmiş "UltrmiR" miR-30 iskelesi, verimli primer shRNA biyogenezi ve ekspresyonu12,13 için optimize edilmiştir.

Bu deneyin ana hatları Şekil 1A'da gösterilmiştir. Mevcut protokol, bir süspansiyon hücre hattı olan MV4-11 AraC R hücre hattındaki epigenetik faktör shRNA kütüphanesini kullanarak RNAi taramasına odaklanmaktadır (Şekil 1B). Bu protokol, kişinin seçtiği herhangi bir ilaca dirençli hücre hattındaki hedeflenen herhangi bir kütüphaneyi taramak için kullanılabilir. Transdüksiyon protokolünün yapışkan hücreler için farklı olacağına dikkat edilmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBSC) yönergelerini takip edin ve lentivirüsü (BSL-2) işlemek için uygun tesisi kullanın. Personel, lentivirüsün kullanımı ve bertarafı konusunda uygun şekilde eğitilmelidir. Bu protokol, Vellore'deki Christian Medical College'ın biyogüvenlik yönergelerini takip etmektedir.

1. ShRNA'ların kalıcı ve uzun süreli ekspresyonunu elde etmek için en güçlü promotörün seçimi

NOT: Deney için seçilen hücre hattında shRNA'ların kararlı ve uzun süreli ekspresyonunu sağlayan promotörü tanımlamak için floresan proteinlerini eksprese eden farklı promotörlere sahip lentiviral vektörler kullanarak bir transdüksiyon deneyi yapmak önemlidir. Bu amaçla en sık kullanılan promotörler, yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden hEF1α (insan uzama faktörü 1α), hCMV (insan sitomegalovirüsü) ve SSFV (dalak odak oluşturan virüs) promotörleridir (Şekil 2A).

  1. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücre sayımını gerçekleştirin. MV4-11 AraC R hücrelerini, 8 μg / mL polibren içeren% 10 RPMI ortamında (100 U / mL penisilin ve 100 U / mL streptomisin ile desteklenmiş% 10 FBS ile% 10 FBS ile RPMI) askıya alın. Tohum 1 x 106 hücre 1.5 mL orta/kuyucuk içinde altı delikli bir plaka halinde üçlü olarak.
  2. Her bir oyuğa farklı hacimlerde konsantre lentivirüsler (örneğin, lentivirüslerin titresine bağlı olarak 10 μL, 20 μL ve 40 μL) ekleyin. İçeriği karıştırmak için plakayı yavaşça döndürün.
  3. 90 dakika boyunca 37 °C'de 920 x g'de santrifüjleme ile serpinti gerçekleştirin.
  4. Plakaları derhal bir CO 2 inkübatöründe inkübe edin (37 ° C'de% 5 CO2).
  5. Başarılı bir transdüksiyon sağlamak için GFP ekspresyonunu 48 saat sonra bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
  6. Transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için 72 saat sonra akış sitometrisi ile GFP ekspresyonunu ölçün.
  7. Hücreleri toplam 2 hafta boyunca kültürleyin ve GFP ekspresyonunu periyodik olarak akış sitometrisi ile izleyin. Ortalama floresan yoğunluğu ve GFP + hücrelerinin yüzdesi ile ölçülen GFP ekspresyonundaki azalma, promotör susturulmasını gösterir.
  8. GFP + hücrelerini 10. günde sıralayın ve sıralamadan sonra hücreleri 1 hafta boyunca kültürleyin. GFP ekspresyonunu kültür sırasında periyodik olarak kontrol edin.
  9. Kapıyı ayarlamak için dönüştürülmemiş hücreleri kullanın. X ekseninde sağa doğru 1 x 101 ölçeğinin ötesinde bir popülasyon, GFP için pozitif bir popülasyon olarak kabul edilir.
  10. Hücrelerin uzun süreli kültüründe GFP'nin kalıcı bir ekspresyonunu gösteren promotörü seçin.

2. Havuzlanmış lentiviral insan epigenetik faktör shRNA kütüphanesinin hazırlanması

  1. Her plakada 8 mL% 10 DMEM ortamı (100 U / ml penisilin ve 100 U / ml streptomisin içeren% 10 FBS içeren DMEM) içeren üç adet 10 cm hücre kültürü kabında kültür 293T hücreleri (iyi bir proliferasyon hızına sahip düşük bir geçiş sayısında).
  2. Hücreler% 60 akıcılığa ulaştığında, ortamı tam bir ortamla değiştirin.
  3. Serumsuz ortam, lentiviral ambalaj (psPAX2) ve zarf plazmidi (pMD2.G), havuzlanmış kütüphane plazmidleri ve son olarak transfeksiyon reaktifi içeren transfeksiyon karışımını ( Tablo 1'de belirtildiği gibi) hazırlayın.
  4. İyice karıştırmak için karışıma dokunun ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  5. Transfeksiyon karışımını 293T hücrelerine ekleyin ve plakaları döndürerek yavaşça karıştırın. Plakaları bir CO 2 inkübatöründe inkübe edin (37 ° C'de% 5 CO2). Ortamı 24 saat sonra değiştirin.
  6. 48 saat sonra, 293T hücrelerinde yüksek transfeksiyon verimliliği sağlamak için bir floresan mikroskobu altında GFP ekspresyonunu kontrol edin.
  7. Virüs süpernatantlarını 48 saat, 60 saat ve 72 saat sonra toplayın ve 4 ° C'de saklayın. Virüsü topladıktan sonra her zaman noktasına taze ortam (8 mL) ekleyin.
  8. Virüs süpernatantlarını bir havuza alın. Havuzlanan virüslerin toplam hacmi şöyle olacaktır: ~8 mL/plaka x 3 koleksiyon= ~24 mL/plaka; ~24 mL/plaka x 3 plaka = 3 plakadan ~72 mL.
  9. Havuza alınmış virüsleri 0,4 μm filtreyle filtreleyin.
  10. Yüksek bir virüs titresi elde etmek için, havuzlanmış virüsleri ultrasantrifüjleme ile konsantre edin. Filtrelenmiş virüs süpernatanı iki adet 70 Ti tüpe (32 mL/tüp) aktarın ve yavaş hızlanma ve yavaşlama ile 2 saat boyunca 18.000x g'de santrifüj yapın. 4 °C'ye kadar önceden soğutulmuş bir rotor ve santrifüj kullanın.
  11. Tüpleri santrifüjden yavaşça çıkarın ve süpernatantı tamamen çıkarın.
  12. Bir mikropipet kullanarak, peleti 400 μL DMEM'de (FBS ve antibiyotik olmadan) nazikçe askıya alın. Buz üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin ve peletleri her iki tüpten de karıştırın.
  13. Virüsleri alikote edin ve -80 ° C'de dondurun.
    NOT: Tüpler ve virüsler 2.10.-2.13 adımları sırasında buz üzerinde tutulmalıdır. Virüsü düz ortamla askıya alırken köpürmekten kaçının. Ortam 4 °C'de tutulmalıdır.
  14. Virüsün konsantrasyonunu (x) aşağıdaki gibi hesaplayın:
    Konsantrasyon öncesi toplam hacim = 72 mL (72.000 μL)
    Konsantre olduktan sonraki hacim = 400 μL
    Konsantrasyon = 72.000/400= 180x

3. Lentivirüslerin transdüksiyon etkinliğinin tahmini

  1. Lentivirüslerin başarılı bir şekilde hazırlandığını doğrulamak için konsantre virüs ile 293T hücrelerini farklı hacimlerde (2 μL, 4 μL, 8 μL) dönüştürün.
    NOT: Konsantre virüsler küçük hacimlerde (1-2 μL) yüksek iletim verimliliği (>%50) gösteriyorsa, konsantre virüsün istenen miktarlarda (100x ila 75x) seyreltilmesi önerilir.
  2. MV4-11 AraC R hücre hattında titrasyon deneyleri gerçekleştirmek için konsantre virüsü DMEM ile (FBS ve antibiyotikler olmadan) 100 kata kadar seyreltin.
  3. Tohum 1 x 106 hücre (MV4-11 AraC R hücre hattı, 8 μg / mL polibren içeren 1.5 mL% 10 RPMI ortamında) altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğunda. Farklı hacimlerde virüslerle dönüştürmek için dört kuyucuk hazırlayın.
  4. 100x virüslerden oluşan dört farklı birim (örneğin, 1 μL, 1,5 μL, 2 μL ve 2,5 μL) ekleyin.
  5. 37 °C'de 90 dakika boyunca plakanın 920 x g'de santrifüjlenmesiyle serpinti yapın.
  6. 72 saat sonra, GFP + hücrelerinin yüzdesini akış sitometrisi ile ölçün.
  7. %30 iletim verimliliği elde etmek için virüslerin hacmini belirleyin. Bu düşük iletim verimliliği, hücre başına tek shRNA entegrasyonu sağlamaktır.

4. İlaca dirençli hücre hattında havuzlanmış epigenetik shRNA kütüphanesinin transdüksiyonu

  1. Hedef hücre hattı MV4-11 AraC R'yi 0,5 x 106 hücre/mL yoğunlukta tutun. Hücrelerin kültürde üstel büyüme aşamasında olduğundan emin olun.
  2. Deney için alınacak hücre sayısını, viral integrantların sayısına göre aşağıdaki gibi hesaplayın.
    Transdüksiyon için gerekli hücre sayısı = 5.485 (shRNA sayısı) × 500 (katlanır shRNA gösterimi) / 0.25 (MOI) = 10.982.000 ~11 x 106 hücre
  3. 16 mL'lik %10 RPMI ortamında 1,1 x 107 hücreyi yeniden askıya alın.
  4. Polibrene (8 μg / mL) ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından, önceki bölümde hesaplandığı gibi %30 iletim verimliliği elde etmek için gerekli virüs hacmini ekleyin.
  5. Tüm hücreleri altı kuyucuklu bir plaka üzerinde 1 x 106 hücre / 1.5 mL'lik bir yoğunlukta kuyu başına% 10 RPMI ortamına tohumlayın.
  6. Plakayı 37 °C'de 920 x g'de 90 dakika santrifüj yapın.
  7. Plakayı bir CO 2 inkübatöründe gece boyunca inkübe edin (37 ° C'de% 5 CO2 ).
  8. 24 saat sonra, ortamı değiştirin ve dönüştürülmüş hücreleri bir T-75 şişesine aktarın.
  9. 48 saat sonra, başarılı bir transdüksiyon sağlamak için GFP'yi bir floresan mikroskobu altında kontrol edin.
  10. 72 saat sonra, GFP + hücrelerinin yüzdesini akış sitometrisi ile sayın.

5. GFP pozitif hücrelerin zenginleştirilmesi

NOT: Dönüştürülen hücreleri 5-7 gün boyunca 0,5 x 106 hücre/mL yoğunlukta kültürleyerek genişletin. Bu hücreler, bir sonraki adımda belirtildiği gibi, GFP'ye göre sıralanarak seçilen, dönüştürülmüş ve dönüştürülmemiş karışık bir popülasyondur.

  1. GFP+ dönüştürülmüş hücrelerin, akış sıralama ayarları yüksek saflık ve düşük verim olarak ayarlanmış şekilde akış ayıklamasını gerçekleştirin. Kapıyı ayarlamak için dönüştürülmemiş hücreleri kullanın. 1 x 102'nin ötesinde sağa doğru bir popülasyon pozitif bir popülasyon olarak kabul edilir.
  2. Sıralanmış hücreleri% 5 RPMI'da toplayın (100 U / mL penisilin ve 100 U / mL streptomisin ile desteklenmiş% 5 FBS ile RPMI).
  3. Sıralanmış hücreleri% 10 RPMI ortamında kültürleyin.
  4. 72 saat sonra, %95 > sıralama verimliliği sağlamak için GFP+ hücrelerinin yüzdesinin sıralama sonrası tahminini gerçekleştirin.
    NOT: shRNA kütüphanesinin 450x ila ~500xtemsilini elde etmek için sıralamadan sonra ~3-5 x 10 6 GFP pozitif hücre elde ettiğinizden emin olun.

6. İlaç direncine aracılık eden epigenetik faktörleri tanımlamak için bırakma taraması

  1. ShRNA kütüphanesini kültüre alın, hücreleri 5 güne kadar% 10 RPMI'da dönüştürdü. Kriyoproteksiyon, gerekirse ilaç tedavisinden önce gelecekteki deneyler için dönüştürülmüş hücreleri korur.
  2. 25 °C'de 5 dakika boyunca 280 x g'de 1 x 107 hücreyi çift halinde santrifüj yapın. Süper natantı atın ve peletleri -80 ° C'de saklayın. Bu örnekler epigenetik shRNA kütüphanesi için temel referans görevi görecektir.
  3. Kalan dönüştürülmüş hücreleri, her biri kitaplığın 500x temsilini sağlayan bir hücre sayısında tutulan kopyalar (R1 ve R2) olarak kültürleyin.
  4. Kopyalardan birini ilaçla (10 μM sitarabin) (R2) ve diğerini ilaç tedavisi (R1) olmadan tedavi edin.
  5. Her 72 saatte bir ilaçla ve ilaçsız şişelerin ortamını değiştirin. 9 günlük kümülatif ilaç maruziyeti için orta değişimi 3x tekrarlayın.
  6. 9 günlük ilaç tedavisinden sonra, tripan mavisi dışlama yöntemiyle hücrelerin yaşayabilirliğini kontrol edin.
  7. Kalan hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 280 x g'de santrifüj yapın. Steril PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın ve hücreleri yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 280 x g'de santrifüj.
  8. Süpernatantı atın ve DNA ekstraksiyonu için peletleri -80 ° C'de saklayın.

7. Entegre shRNA'ların PCR ile amplifikasyonu

  1. DNA'yı, dönüştürülmüş bazal hücrelerden (T) (adım 6.2.) ve ilaçla tedavi edilen (R2) ve ilaçla tedavi edilmeyen hücrelerden (R1) çıkarın.
  2. Bir florometre kullanarak numunenin konsantrasyonunu kontrol edin.
  3. PCR için gerekli DNA miktarını aşağıdaki gibi hesaplayın:
    5,485 (hayır. shRNA'ların) × 500 (shRNA gösterimi) × 1 x 6.6−12 (g/diploid genom) = 15 μg DNA
  4. Örnekleri PCR'nin ilk turuna tabi tutun.
    NOT: PCR reaksiyon karışımı, termal döngü koşulları ile birlikte Tablo 2'de gösterilmiştir. Astarların detayları Ek Tablo 1'de verilmiştir.
  5. Tüp başına 850 ng DNA içeren çoklu reaksiyonlar ayarlayın (toplam 43 reaksiyon için).
    NOT: PCR'nin ilk turu, shRNA'nın yan bölgelerini yükseltir ve 397 bp'lik bir amplikon boyutu ile sonuçlanır.
  6. PCR ürünlerini bir araya getirin ve standart bir jel / PCR saflaştırma kitinin 3-4 sütununu kullanarak PCR ürünlerini saflaştırın.
    NOT: Ayrıntılar Tablo 3'te verilmiştir.
  7. Ürünü her kolondan 50 μL tamponda süzün ve elutları bir araya getirin.
  8. DNA'yı nicelleştirin ve -20 ° C'de saklayın.
    NOT: Reaktifler, termal döngücü koşulları ile Tablo 4'te tablolaştırılmıştır. İkinci tur PCR, tek akışlı bir hücrede NGS'de çoklama için gerekli olan INDEX dizisine sahip primerleri kullanır. Bu nedenle, her örnek farklı bir dizinle etiketlenmelidir. Astar dizileri Ek Tablo 1'de verilmiştir.
  9. Her numune ve negatif kontrol için toplam 50 μL reaksiyon hacminde 500 ng birincil PCR ürünü ile dört reaksiyon ayarlayın.
  10. % 2 TBE agaroz jeli kullanarak tüm ürünü elektroforez için yükleyin ve 1 kb'lik bir moleküler merdiven kullanarak bant boyutunu onaylayın. Amplikonun boyutu 399 bp'dir.
  11. PCR ürünlerini jel dokümantasyon sisteminde görselleştirin.
  12. Belirli bandı tüketin ve bir jel saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın.
    NOT: Kit ile saflaştırma hesaplamaları Tablo 3'te verilmiştir.
  13. 30 μL elüsyon tamponunun son hacminde elut. Her bir elüentin yaklaşık konsantrasyonu, toplam hacmi 30 μL olan yaklaşık 80-90 ng / μL olacaktır.

8. Yeni nesil sıralama ve veri analizi

  1. Jel saflaştırılmış ürünü adım 7.13'ten itibaren sıralayın. tükenmiş shRNA'lar için okuma sayısını elde etmek için yeni nesil bir sıralayıcıda (örneğin, Illumina).
  2. Fastx takım kitini (sürüm 0.7) kullanarak oluşturulan FastQ okumalarının adaptör dizilerini kırpın.
  3. Filtrelenmiş okumaları, iki uyumsuzluğa izin verme parametresiyle bir Bowtie hizalayıcısı kullanarak referans dizilerine hizalayın. Adaptör kırpmasından sonra okuma uzunluğunun yaklaşık 21 bp olduğundan emin olun.
  4. Samtools (sürüm 1.9) programını kullanarak dosyaları yükleyin. Flagstat seçeneğini kullanın ve hizalama özetini hesaplayın.
  5. Kırpılmış fastQ dosyalarını CRISPRCloud2 (CC2) yazılımına (https://crispr.nrihub.org/) referans shRNA dizileriyle birlikte FASTA dosyaları biçiminde yükleyin ve talimatları uygulayarak analizi gerçekleştirin.
    1. CC2'deki Analizi Başlat bağlantısına tıklayın.
    2. Ekran türünü Hayatta Kalma ve Bırakma ekranları olarak seçin. Grup sayısını ayarlayın ve her grubun adını yazın.
    3. Referans kitaplığını FASTA dosya biçiminde yükleyin. Yüklenen veriler işlenir. Sonuçları almak için çıktı URL'sine tıklayın.
      NOT: Bu yazılım, sgRNA / shRNA seviyelerindeki farklılıkları ölçmek için değiştirilmiş bir Öğrenci t-testi ile bir beta-binom modeli kullanır, ardından gen seviyesi önemini tahmin etmek için Fisher'ın kombine olasılık testi gelir. Tedavi edilen (zenginleştirilmiş/tükenmiş) ve tedavi edilmemiş örnekler (baz çizgisi) arasındaki epigenetik faktörler için shRNA'ların tahmini log 2 kat değişikliklerini (Log2Fc) "p-değerleri" ve "FDR değerleri" ile hesaplar.
  6. FDR değerinin Bırakma ekranı için "Negatif" ve Hayatta Kalma ekranı için "Pozitif" olduğundan emin olun.
    NOT: CC2, okumaları saymak ve shRNA'ların örnekler arasındaki kıvrım gösterimini (zenginleştirme veya tükenme) hesaplamak için kullanılan bir analiz platformudur.
  7. CC2 sonuçlarından önemli ölçüde zenginleştirilmiş ve tükenmiş shRNA'ları (FDR <0.05) tanımlayın.
    NOT: Her faktöre karşı 5-24 shRNA vardır. shRNA'ların her biri için FDR değerlerini kontrol edin; <0.01 olan FDR'yi düşünün ve seçilen shRNA'lar için bir ortalama alın. En iyi 40 isabeti düşünün. Log2Fc veya FDR negatif değerlerine göre seçilen faktörlerin grafiğini çizin. Hedeflemeyen shRNA'ların, kontrol shRNA'ları olarak hizmet ettikleri için verilerin orijinalliğini sağlamak için önemli FDR değerlerine sahip olduklarından emin olun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Genel tarama iş akışı Şekil 1A'da gösterilmiştir. MV4-11 AraC R'nin (48 h) in vitro sitotoksisitesi, MV4-11 AraC R'deki IC50'nin sitarabine, MV4-11 P'den daha yüksek olduğunu ortaya koydu (Şekil 1B). Bu hücre hattı çalışmada sitarabin direncinden sorumlu epigenetik faktörlerin taranmasında model olarak kullanılmıştır.

Şekil 2A , doğrusallaştırılmış pZIP vektör haritalarını üç fa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

RNA girişimi (RNAi), siRNA ve shRNA taramasını içeren fonksiyonel genomik çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. ShRNA'nın yararı, plazmid vektörlerine dahil edilebilmeleri ve genomik DNA'ya entegre edilebilmeleri, böylece kararlı ekspresyon ve dolayısıyla hedef mRNA'nın daha uzun süreli nakavtıyla sonuçlanmalarıdır. Havuzlanmış shRNA kütüphanesi taraması, geleneksel dizili ekranlara (siRNA) kıyasla sağlam ve uygun maliyetlidir. Genom çapında bir ekranda belirli bir protein sınıfının özgünlüğünü tanımlamak hanta...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması ve açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen SRV'ye BT / PR8742 / AGR / 36/773/2013 hibe Biyoteknoloji Bölümü tarafından finanse edilmektedir; ve Biyoteknoloji Bölümü Hindistan BT / COE / 34 / SP13432 / 2015 ve Bilim ve Teknoloji Bölümü, Hindistan: EMR / 2017 / 003880 ila P.B. RVS ve P.B. sırasıyla Wellcome DBT Hindistan İttifakı IA / S / 17/1 / 503118 ve IA / S / 15 / 1 / 501842 tarafından desteklenmektedir. S.D. CSIR-UGC bursu tarafından desteklenmektedir ve S.I. ICMR kıdemli araştırma bursu tarafından desteklenmektedir. Abhirup Bagchi, Sandya Rani ve CSCR Flow Cytometry Core Facility personeline yardımları için teşekkür ederiz. MedGenome Inc.'e de yüksek verimli dizileme ve veri analizine yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler< / güçlü>
100 bp Merdiven Hiper MerdivenBIOLINEBIO-33025
1kb Merdiven Hiper MerdivenBIOLINEBIO-33056
AgarozLonza Seachekm50004
Betain (5mM)SigmaB03001VL
BorikAsit Nitelikleri12005
Hücre kültürü plastik malzemeUygulanabilir
Sitozin ve beta;-D-arabinofuranosid hidroklorürSigmaC1768-500MG
DMEMMP BIO
DMSOWak Chemie GMBHKriyöz DMSO 10ml
EDTASigmaE5134
Etidyum BromürSigmaE1510-10 mL
Fetal Sığır SerumuThermo Fisher Scientific16000044
Jel/PCR Saflaştırma KitiMACHEREY-NAGELREF  740609.50
Gibco- RPMI 1640Thermo Fisher Scientific23400021
Buzul Asetik AsitThermoQ11007
hCMV GFP PlazmidTransomikTransOmik Promotör seçim KITI
hEF1a GFPlasmidTransomicsTransOmics Promotör seçimi KITI
HEK 293TATCCCRL-11268
HL60 hücre hattıATCCCCL-240
KOD Sıcak Başlangıç PolimerazMerck71086
Molm13 hücre hattıEllen Weisberg Laboratuvarı, Dana Farber Kanser Enstitüsü, Boston, MA, ABDDana Farber Kanser Enstitüsü, Boston, MA, ABD
MV4-11 hücre hattıATCCCRL-9591
Penisilin streptomisinThermo Fisher Bilimsel
psPAX2 ve pMD2.GAddgene Addgeneplazmid no.12260 & Addgene plazmid no. 12259
Qubit dsDNA HS Test KitiInvitrogenREF Q32854
SFFV  GFP PlazmidTransomikTransOmics Promotör seçim KITI
Transomics'ten shERWOOD-UltrmiR shRNA KütüphanesiTransomicsCat No. TLH UD7409; Parti No: A116. V 132.14
Trans-IT-LTI Mirus MirusMirusKatalog Numarası: MIR2300
TrisMP Biyomedikal0219485591
Tripan MaviSigma-AldrichT8154-100ML
Ultra santrifüj TüpleriBeckman Coulter  103319
Ekipmanlar< / güçlü>
<2 / alt> inkübatörüThermo Fisher
BD Aria III hücre sıralayıcıBecton Dickinson
Beckman Coulter Optima L-100K- UltrasantrifüjBeckman Coulter
SantrifüjThermo Multiguge 3SR +
ChemiDoc Görüntüleme sistemi ( Fluro Chem M sistemi)Fluro Chem
Leica AF600Leica
Işık MikroskobuZeiss Axiovert 40c
NanodropThermo Scientific
Qubit 3.0 FlorometreInvitrogen
Termal DöngüleyiciBioRad
91233354 15140122% 2<>

Kaynaklar

  1. Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441(2016).
  3. Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
  4. Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
  5. Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
  6. Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
  7. Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
  8. Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
  9. Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
  10. O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
  11. Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
  12. Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
  13. Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
  14. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  15. Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
  16. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Epigenetik Mod lat rlerSitarabin DirenciAkut Miyeloid L semiLentiviral Transd ksiyonAk SitometrisiNegatif Seleksiyon TaramaYeni Nesil DizilemeGen Nakavt

İlgili makaleler