Yüksek İçerikli Tarama ve Analiz Uygulamaları için Büyük Ölçekli Sferoid Üretimi için Sağlam Bir Yöntem

Alannah S. Chalkley; Margaritha M. Mysior; Jeremy C. Simpson

doi:10.3791/63436

Yöntem makalesi

Yüksek İçerikli Tarama ve Analiz Uygulamaları için Büyük Ölçekli Sferoid Üretimi için Sağlam Bir Yöntem

DOI:

10.3791/63436

⸱

28 Aralık 2021

Alannah S. Chalkley¹ , Margaritha M. Mysior¹ , Jeremy C. Simpson¹

¹Cell Screening Laboratory, UCD School of Biology and Environmental Science, University College Dublin

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, üç farklı sferoid tipinin üretimi için bir yöntemi, onları büyük ölçekli yüksek içerikli tarama ve analiz için uygun hale getirecek şekilde detaylandırmaktadır. Ek olarak, küresel ve bireysel hücre seviyelerinde nasıl analiz edilebileceğini gösteren örnekler sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek içerikli tarama (HCS) ve yüksek içerikli analiz (HCA), araştırmacılara hücrelerden büyük ölçekli nicel fenotipik ölçümler çıkarma yeteneği sağlayan teknolojilerdir. Bu yaklaşım, hücre biyolojisindeki çok çeşitli temel ve uygulamalı olaylar hakkındaki anlayışımızı derinleştirmek için güçlü olduğunu kanıtlamıştır. Bugüne kadar, bu teknoloji için uygulamaların çoğu, tek katmanlı olarak yetiştirilen hücrelerin kullanımına dayanıyordu, ancak bu tür modellerin dokularda meydana gelen etkileşimlerin ve süreçlerin çoğunu özetlemediği giderek daha fazla fark ediliyor. Bu nedenle, sferoidler ve organoidler gibi 3 boyutlu (3B) hücre gruplarının geliştirilmesinde ve kullanımında bir ortaya çıkmıştır. Bu 3D modeller kanser biyolojisi ve ilaç dağıtım çalışmaları bağlamında özellikle güçlü olmasına rağmen, HCS ve HCA için uygun tekrarlanabilir bir şekilde üretim ve analizleri bir takım zorluklar ortaya koymaktadır. Burada detaylandırılan protokol, çok hücreli tümör sferoidlerinin (MCTS) üretilmesi için bir yöntemi açıklamakta ve HCS ve HCA ile uyumlu bir şekilde üç farklı hücre hattına uygulanabileceğini göstermektedir. Yöntem, kuyu başına birkaç yüz sferoid üretimini kolaylaştırır ve bir tarama rejiminde kullanıldığında, hepsi aynı şekilde muamele edilen kuyu başına birkaç yüz yapıdan veri elde edilebilmesi için özel bir avantaj sağlar. Yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme için sferoidlerin nasıl işleneceğini ve HCA'nın hem sferoid seviyesinde hem de her bir sferoid içindeki bireysel hücrelerden nicel özellikleri nasıl çıkarabileceğini ayrıntılarıyla anlatan örnekler de verilmiştir. Bu protokol, hücre biyolojisindeki çok çeşitli önemli soruları cevaplamak için kolayca uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel olarak, hücre bazlı tahliller, etkili bir şekilde iki boyutlu (2D) bir ortam olarak kabul edilebilecek katı bir substrat üzerinde büyüyen tek katmanlı olarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, 2B hücre kültürü modellerinin bazı bağlamlarda fizyolojik alaka düzeyinden yoksun olduğu ve hücreler arasında meydana gelen karmaşık etkileşimlerin çoğunu kopyalayamadığı giderek daha fazla kabul ^{edilmektedir1}. Üç boyutlu (3D) hücre kültürü yöntemleri araştırmacılar arasında hızla popüler hale gelmektedir ve 3D hücre modelleri, doku ortamında hücrelerin karşılaştığı fizyolojik koşulları daha iyi taklit etmek için yüksek potansiyel

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre kültürü

Medya hazırlama
1. Hücre hattının türüne bağlı olarak belirli hücre kültürü ortamları hazırlayın. Hücre bakımı için tüm ortamların% 10 fetal sığır serumu (FBS) içerdiğinden emin olun.
  NOT: Farklı hücre satırları farklı ortamlar kullanır. HT-29 kolon karsinom hücreleri (ATCC HTB-38) McCoys 5A +% 10 FBS'de yetiştirilir. HepG2 hepatosellüler karsinom hücreleri (ATCC HB-8065) Minimum Esansiyel Orta +% 1 L-glutamin +% 10 FBS'de yetiştirilir. H358 bronkoalveoler karsinom hücreleri (ATCC CRL-5807) RPMI 1640 orta +% 1 L-glutamin +% 10 FBS'de yetiştirilir. L-glutamin ve FBS içeren tüm ortamlar tam medya olarak adlandırılır. H....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, çeşitli tümör dokularını temsil etmek için farklı hücre tiplerini kullanarak, sferoidler şeklinde 3D hücre kültürü montajları üretmek için sağlam bir yöntem detaylandırılmıştır. Bu yöntem, kuyu başına yüzlerce sferoid üretilmesine izin verir, bu da hücre bazlı tahlillerin yüksek içerikli bir şekilde yapılmasını sağlar (Şekil 1). Bu yaklaşım daha önce HT-29 ^{sferoidlerinde16} nanopartikül alımını ve HepG2 sferoidlerinde17 nanopartikül kaynaklı toksisiteyi .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan yaklaşım, HCS ve HCA için uygun bir şekilde kuyu başına birkaç yüz sferoid üretmek için bir platformu detaylandırmaktadır. Kuyu başına sadece bir sferoid oluşumuna izin veren düz tabanlı ve yuvarlak tabanlı ULA plakalarının kullanımı gibi diğer popüler yöntemlerle ^{karşılaştırıldığında18,19}^, bu yöntem yüksek çözünürlüklü bilgilerin çok sayıda sferoidden bir tarama formatında çıkarılmasına olanak sağlar. Özellikle, bu yöntem, çeşitli tümör tiplerin.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmayla ilgili rakip çıkarların olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) tarafından JCS'ye verilen altyapı araştırma hibesinin desteğini kabul etmektedir. UCD Hücre Tarama Laboratuvarı'ndaki çalışmalar UCD Bilim Koleji tarafından desteklenmektedir. ASC, İrlanda Araştırma Konseyi (IRC) İrlanda Hükümeti Lisansüstü Bursu (GOIPG / 2019/68) tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar ayrıca laboratuvarın tüm üyelerine katkıları ve yararlı tartışmaları için teşekkür eder. Şekil 1'deki resim BioRender'da oluşturulmuştur.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 0.05 Tripsin-EDTA (1x), fenol kırmızısı	Gibco	25300054
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma Aldrich	A6003
Kalsiyum klorür	Fisher Scientific	10050070
CellCarrier-96 Ultra Mikroplakalar, doku kültürü ile tedavi edilmiş, siyah, 96 oyuklu	kapaklı Perkin Elmer	6055302	Bu plakalar Fenoplakalar
olarak yeniden adlandırılmıştırDimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Fetal Sığır Serumu (FBS), nitelikli, AB onaylı, Güney Amerika menşeli, ısıyla inaktive	edilmiş Gibco	10500064
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Keçi anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029
L-Glutamin çözeltisi, 200 mM	Gibco	25030024
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	14533
Magnezyum klorür	Fisher Scientific	10647032
Matrigel Bazal Membran Matrisi, Fenol Kırmızısı içermez, LDEV içermez, 10 mL	Corning	356237	Bu Matrigel formülasyonu, BD Biosciences'ta aynı katalog numarasıyla da bulunabilir
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış Matrigel	BD Biosciences	356231	Bu Matrigel formülasyonu, Corning
McCoy'un 5A ortamı	Gibco'da	aynı
McCoy'un L glutamin ve sodyum bikarbonat içeren 5A ortamında, fenol kırmızısı	Hidroklon	10358633
Minimum Esansiyel Ortam (MEM)		21090022
Minimum Esansiyel Ortam (MEM), glutamin içermez, fenol kırmızısı	içermez Gibco	51200046
Fare monoklonal anti-LAMP1 antikoru (konsantre)	Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası	H4A3-a
Neubauer sayım odası	Hirschmann	8100203
Nunclon kapaklı doku kültürü kabı, polistiren, 92 mm x 17 mm	ThermoFisher Scientific	150350
Opera Phoenix HCS Sistemi ve Harmony HCA yazılımı	Perkin Elmer	HCSHH14000000
Paraformaldehit (PFA)	Sigma Aldrich	P6148
Phalloidin Alexa Fluor 568	Invitrogen	A12380
Fosfat Tamponlu Salin (PBS) tabletleri	Sigma Aldrich	P4417
Polisorbat 20	Sigma Aldrich	P5927
RPMI 1640 Orta, GlutaMAX Takviyesi	Gibco	61870010
RPMI 1640 Orta, glutaminsiz, fenol kırmızısı içermez	Gibco	11835063
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
Stericup steril vakum filtre üniteleri	Millipore	SCGVU05RE

. katalog numarasıyla 26600023 olmadan da bulunabilir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Spheroid Production Multicellular Tumor Spheroids 3D Cell Culture Confocal Microscopy Fluorescence Imaging Morphological Analysis Cell Segmentation Drug Delivery Studies Proteomic Analysis

Yüksek İçerikli Tarama ve Analiz Uygulamaları için Büyük Ölçekli Sferoid Üretimi için Sağlam Bir Yöntem

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler