Yüksek İçerikli Tarama ve Analiz Uygulamaları için Büyük Ölçekli Sferoid Üretimi için Sağlam Bir Yöntem

Özet

Bu protokol, üç farklı sferoid tipinin üretimi için bir yöntemi, onları büyük ölçekli yüksek içerikli tarama ve analiz için uygun hale getirecek şekilde detaylandırmaktadır. Ek olarak, küresel ve bireysel hücre seviyelerinde nasıl analiz edilebileceğini gösteren örnekler sunulmaktadır.

Özet

Yüksek içerikli tarama (HCS) ve yüksek içerikli analiz (HCA), araştırmacılara hücrelerden büyük ölçekli nicel fenotipik ölçümler çıkarma yeteneği sağlayan teknolojilerdir. Bu yaklaşım, hücre biyolojisindeki çok çeşitli temel ve uygulamalı olaylar hakkındaki anlayışımızı derinleştirmek için güçlü olduğunu kanıtlamıştır. Bugüne kadar, bu teknoloji için uygulamaların çoğu, tek katmanlı olarak yetiştirilen hücrelerin kullanımına dayanıyordu, ancak bu tür modellerin dokularda meydana gelen etkileşimlerin ve süreçlerin çoğunu özetlemediği giderek daha fazla fark ediliyor. Bu nedenle, sferoidler ve organoidler gibi 3 boyutlu (3B) hücre gruplarının geliştirilmesinde ve kullanımında bir ortaya çıkmıştır. Bu 3D modeller kanser biyolojisi ve ilaç dağıtım çalışmaları bağlamında özellikle güçlü olmasına rağmen, HCS ve HCA için uygun tekrarlanabilir bir şekilde üretim ve analizleri bir takım zorluklar ortaya koymaktadır. Burada detaylandırılan protokol, çok hücreli tümör sferoidlerinin (MCTS) üretilmesi için bir yöntemi açıklamakta ve HCS ve HCA ile uyumlu bir şekilde üç farklı hücre hattına uygulanabileceğini göstermektedir. Yöntem, kuyu başına birkaç yüz sferoid üretimini kolaylaştırır ve bir tarama rejiminde kullanıldığında, hepsi aynı şekilde muamele edilen kuyu başına birkaç yüz yapıdan veri elde edilebilmesi için özel bir avantaj sağlar. Yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme için sferoidlerin nasıl işleneceğini ve HCA'nın hem sferoid seviyesinde hem de her bir sferoid içindeki bireysel hücrelerden nicel özellikleri nasıl çıkarabileceğini ayrıntılarıyla anlatan örnekler de verilmiştir. Bu protokol, hücre biyolojisindeki çok çeşitli önemli soruları cevaplamak için kolayca uygulanabilir.

Giriş

Geleneksel olarak, hücre bazlı tahliller, etkili bir şekilde iki boyutlu (2D) bir ortam olarak kabul edilebilecek katı bir substrat üzerinde büyüyen tek katmanlı olarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, 2B hücre kültürü modellerinin bazı bağlamlarda fizyolojik alaka düzeyinden yoksun olduğu ve hücreler arasında meydana gelen karmaşık etkileşimlerin çoğunu kopyalayamadığı giderek daha fazla kabul ^{edilmektedir1}. Üç boyutlu (3D) hücre kültürü yöntemleri araştırmacılar arasında hızla popüler hale gelmektedir ve 3D hücre modelleri, doku ortamında hücrelerin karşılaştığı fizyolojik koşulları daha iyi taklit etmek için yüksek potansiyel ^{göstermektedir2}. Kullanılan birkaç farklı 3D hücre derlemesi türü vardır, ancak en yaygın iki tip sferoidler ve organoidlerdir. Sferoidler birçok farklı hücre hattından yetiştirilebilir ve kullanılan hücre tipine ve montaj yöntemlerine bağlı olarak çeşitli şekil ve boyutlar ^{benimseyebilirler3}. Dahası, sferoidler, kanser hücre hatlarından yetiştirildiklerinde çok hücreli tümör sferoidleri (MCTS) olarak da adlandırılabilir ve bu modeller preklinik in vitro ilaç dağıtımı ve toksisite çalışmaları için özel bir kullanım alanı ^{bulmuştur4,5}. Öte yandan organoidler, vücudumuzdaki dokuları ve organları daha iyi taklit etmeyi amaçlar ve daha karmaşık morfolojik düzenlemeleri benimseyebilirler. Organoidlerin üretimi, yetişkin kök hücrelerin veya pluripotent kök hücrelerin kullanılmasını içerir; bunlar, ilgilenilen doku veya organa benzemek için uygun hücrelere yeniden programlanabilir. Öncelikle organların gelişimini araştırmak ve hastalıkları ve konakçı-patojen etkileşimlerini modellemek için ^{kullanılırlar6}.

3B hücre derlemeleri oluşturmak için kullanılan bir dizi farklı yöntem vardır. İskele tabanlı yöntemler, hücrelerin içinde bağlanabileceği veya büyüyebileceği bir substrat veya destek sağlar. Bu iskeleler çeşitli şekillerde olabilir ve çeşitli malzemelerden yapılabilir. En yaygın olanları hücre dışı matriks (ECM) bileşenleri ve hidrojellerdir ve hücrelerin doğal hücre dışı ortamına benzeyecek ve böylece fizyolojik etkileşimleri kolaylaştıracak şekilde ^{tasarlanmıştır4,7}. ECM bodrum materyali Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu tümöründen ekstrakte edilmiş ve laminin, tip IV kollajen ve ^perlecan8 dahil olmak üzere zengin bir ECM bileşenleri karışımı içerdiği gösterilmiştir. Bununla birlikte, avantajlı bileşimine rağmen, kullanımıyla ilgili iki ana zorluk vardır: partiden partiye değişkenliği ve 10 ° ^C8,9'un altında ve üstünde iki farklı agrega durumuna sahip olması. Buna karşılık, hidrojeller bileşenlerine ve sertliklerine göre esnek olma avantajına sahiptir ve istenen belirli 3D hücre düzeneğine uyacak şekilde ^{özelleştirilebilirler7,10}. İskele bazlı yöntemler organoid büyüme için gereklidir, ancak aynı zamanda sferoidler için de yaygın olarak kullanılmaktadır. Hücrelerin büyüdükleri yüzeye yapışmasını engelleyerek çalışan iskelesiz yöntemler, genellikle sadece küresel montaj ile uyumludur. Örnekler arasında, hücrelerin sferoidlere toplanmasına izin veren düz tabanlı veya U-dipli ultra düşük bağlantı (ULA) plakaları veya iplikçik/rotasyon şişelerinde hücrelerin sürekli ajitasyonunun kullanılması ^{sayılabilir10}.

Çok çeşitli biyolojik olayları incelemek için 3D hücre montajlarının kullanımı hızla popülerlik kazanmaktadır; ancak, kültürleri için seçilen yöntemin, aşağı akış analizleri için planlara uygun ve uyumlu olması esastır. Örneğin, ULA plakalarının kullanımı yüksek tutarlılığa sahip sferoidler üretir; Bununla birlikte, bu yöntem kuyu başına tek bir sferoid üretimi ile sınırlıdır, böylece verim sınırlandırılır. 3D yapının floresan görüntülemesi planlanırken özellikle dikkat edilmesi gerekir. Montajın yetiştirildiği alt tabaka veya plaka optik olarak uyumlu olmalı ve kullanılmış olabilecek iskelelerin neden olduğu ışık saçılmasının etkilerini en aza indirmek için özen ^{gösterilmelidir11}. Bu özel sorun, mikroskop objektif lenslerinin sayısal açıklığı arttıkça daha akut hale gelir.

Muhtemelen bir 3B hücre modeliyle çalışmayı seçmenin en önemli nedenlerinden biri, yalnızca tüm montaj hakkında değil, aynı zamanda içindeki tek tek hücreler hakkında hacimsel görüntüleme verilerini çıkarmaktır. Özellikle MCTS modelleri, terapötiklerin dışarıdan merkezi hücrelere (bir tümörde ihtiyaç duyacakları gibi) nasıl geçtiğine dair anlayışımızı derinleştirmek için çok güçlü olduğunu kanıtlamaya ^başlıyor12 ve bu nedenle farklı katmanlardaki bireysel hücrelerden bilgi edinmek çok önemlidir. Tek tek hücrelerden kantitatif bilgileri çıkaran görüntüleme teknolojisi, yüksek içerikli analiz (HCA) olarak adlandırılır ve tarama bağlamında güçlü bir ^{yaklaşımdır13}. Bugüne kadar, HCA neredeyse sadece tek katmanlı kültürlere uygulanmıştır, ancak bu yaklaşımın çok çeşitli hücresel fonksiyonların ve süreçlerin incelenmesini sağlayan 3B kültürlere uygulanma gücüne sahip olduğunun giderek daha fazla farkına ^{varılmıştır14}. Çok sayıda 3B montajın analiz edilebilmesi ve potansiyel olarak her yapının içinden hücre düzeyinde veri sağlaması açık bir avantaja sahip olacaktır. Bununla birlikte, potansiyel olarak kalın hücre gruplarının görüntülenmesi ve oluşturulan büyük veri kümelerinin görüntülenmesiyle ilgili zorlukların üstesinden gelinmesi gerekir.

Bu makalede, MCTS'nin 96 kuyucuklu bir formatta büyük ölçekli üretimi için sağlam bir iskele tabanlı yöntem sunulmuştur. Yöntem, her kuyucukta birkaç yüz 3D hücre düzeneğinin üretimini kolaylaştırır. Karaciğer, akciğer ve kolonun katı tümör modellerini temsil eden üç farklı hücre tipi için örnekler gösterilmiştir. Oluşan sferoidler çeşitli boyutlarda olabilir ve bu nedenle HCA, belirli bir boyuttaki ve / veya morfolojideki yapıları seçmek için kullanılır. Bu özellik, gözlemlenen herhangi bir fenotipin farklı boyutlardaki sferoidler arasında karşılaştırılabilmesi, ancak hepsinin aynı kuyuda aynı şekilde muamele görmesi için ek avantaj sağlar. Bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile uyumludur, daha da önemlisi, aynı hücresel gruplardan hem hücre düzeyinde hem de hücre altı düzeyinde nicel veriler sağlar. Bu sferoid üretim yöntemi, kuyu başına tek bir sferoid üreten yöntemlere göre ek bir avantaja sahiptir, her bir kuyuda üretilen çok sayıda sferoid, transkriptom ve proteom profillemesi gibi diğer aşağı akış analizleri için potansiyel olarak yeterli biyokütle sağlar.

Protokol

1. Hücre kültürü

1. Medya hazırlama
   1. Hücre hattının türüne bağlı olarak belirli hücre kültürü ortamları hazırlayın. Hücre bakımı için tüm ortamların% 10 fetal sığır serumu (FBS) içerdiğinden emin olun.
      NOT: Farklı hücre satırları farklı ortamlar kullanır. HT-29 kolon karsinom hücreleri (ATCC HTB-38) McCoys 5A +% 10 FBS'de yetiştirilir. HepG2 hepatosellüler karsinom hücreleri (ATCC HB-8065) Minimum Esansiyel Orta +% 1 L-glutamin +% 10 FBS'de yetiştirilir. H358 bronkoalveoler karsinom hücreleri (ATCC CRL-5807) RPMI 1640 orta +% 1 L-glutamin +% 10 FBS'de yetiştirilir. L-glutamin ve FBS içeren tüm ortamlar tam medya olarak adlandırılır. Hücreleri sferoidler olarak büyümek üzere kaplarken, ECM bodrum malzemesinin renklendirilmesini önlemek için% 10 FBS'li fenol kırmızısı içermeyen bir ortam gerekir, bu da görüntüleme işlemi sırasında eserlere neden olabilir.
2. Alt kültür hücreleri
   1. Hücreler yaklaşık% 80 birleştiğinde, 2 mL tripsin-EDTA (% 0.25 (w / v) tripsin / 0.53 mM EDTA) ile kısaca yıkayın. Tripsin-EDTA'yı aspire edin, 3 mL taze tripsin-EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 3-5 dakika kuluçkaya yatırın.
   2. Hücreler hücre kültürü kabından ayrıldığında, 7 mL taze tam ortam ekleyin.
   3. Pipet, 10 cm'lik yeni bir hücre kültürü kabına 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve hücrelerin 1:10 seyreltilmesini sağlamak için 9 mL taze komple ortam ekleyin.
   4. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO2 ile 37 ° C'de _{kültürleyin}.
   5. Hücre hattına bağlı olarak hücreleri her 3-5 günde bir alt kültüre alın.

2. Sferoidlerin oluşumu

1. 96 delikli plakaları ECM bodrum malzemesi ile kaplayın
   1. ECM bodrum malzemesini gece boyunca buz üzerinde çözün.
   2. ECM bodrum malzemesini -20 °C'de tutulan önceden soğutulmuş uçlar kullanarak soğuk fenol kırmızısız serum içermeyen ortamda seyreltin.
      NOT: ECM bodrum malzemesinin son konsantrasyonu, kullanılan hücre hattına bağlıdır. HT-29 ve H358 hücreleri için, 4 mg · ^mL-1 ECM bodrum malzemesi kullanın. HepG2 hücreleri için, 4 mg · ^mL-1 azaltılmış büyüme faktörü ECM bodrum malzemesi kullanın.
   3. ECM bodrum malzemesinin/orta solüsyonunun 15 μL'lik pipeti, 96 delikli bir görüntüleme plakasına yerleştirilir.
      NOT: Büyük ölçekli sferoid üretimi için bu adım, ECM bodrum malzemesini içeren uçlar ve hazne soğutulduğu sürece hem 8 kanallı pipet hem de 96 kanallı pipet kafası ile gerçekleştirilebilir.
   4. Plakayı 4 ° C'de 91 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj yapın.
   5. Plakayı 37 ° C'de 30 dakikadan fazla olmamak üzere inkübe edin.
2. Alt kültür ve sayım hücreleri
   1. Plaka inkübasyon döneminde, hücreleri tripsin-EDTA ile inkübe edin ve% 10 FBS içeren eksiksiz bir ortamda yeniden askıya alın.
   2. Pipet, hücre süspansiyonunun 10 μL'sini bir hemositometre sayma odasına yerleştirir. Odanın 4 çeyreğindeki hücre sayısını sayın.
   3. 4 kadran içindeki ortalama hücre sayısını belirleyerek hücre süspansiyonu içindeki hücre sayısını hesaplayın.
      NOT: Hücreler, otomatik hücre sayma cihazları kullanılarak da sayılabilir.
   4. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 4 dakika boyunca 135 x g'de santrifüj edin.
   5. Hücreler peletlendikten sonra, süpernatantı aspire edin ve mL başına 1 x ¹⁰⁶ hücre konsantrasyonu elde etmek için hücreleri fenol kırmızısı içermeyen tam bir ortamda yeniden askıya alın.
3. ECM bodrum malzemesi kaplı plakalara tohum hücreleri
   1. Hücreleri fenol kırmızısı içermeyen tam bir ortamda seyreltin.
      NOT: Tohumlanan hücrelerin yoğunluğu, kullanılan hücre hattına bağlıdır. HT-29 ve HepG2 hücreleri için, kuyu başına 3 x ¹⁰⁴ hücre tohumlanır; H358 hücreleri için, kuyu başına 4 x ¹⁰⁴ hücre tohumlanır.
   2. Hücreleri kuyucuk başına toplam 35 μL hacimde tohumlayın. Onları dairesel bir hareketle damla damla eklediğinizden emin olun.
      NOT: Büyük ölçekli küresel üretim için, pipetleme dairesel hareketi sağlanabildiği sürece bu adım 8 kanallı pipetle gerçekleştirilebilir.
   3. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 1 saat boyunca% 5 _{CO2 ile inkübe edin}.
   4. Fenol kırmızısı içermeyen tam ortamda bir ECM bodrum malzemesi çözeltisi hazırlayın, bu da kuyuda% 2 ECM bodrum malzemesinin nihai konsantrasyonu ile sonuçlanır. Bunu başarmak için, kuyu başına 23.8 μL fenol kırmızısız tam ortama 1.2 μL ECM bodrum malzemesi ekleyin, bu da kuyu başına 60 μL'lik bir son hacimle sonuçlanır.
   5. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO2 ile 37 ° C'de _{inkübe edin}.
   6. Ertesi gün, ortamı 100 μL taze fenol kırmızısız tam ortam ile değiştirin.
   7. Ortamı her iki günde bir 100 μL taze fenol kırmızısız tam ortam ile değiştirin.

3. Sferoidlerin immünofloresan boyanması

NOT: Bu protokol Nürnberg ve ark., ^202015'ten uyarlanmıştır. Bu uyarlamalar temel olarak, bu protokolde açıklanan sferoidlerin Nürnberg ve ark. ^{çalışmalarında15} kullanılanlardan daha küçük olduğu ve bu nedenle daha kısa kuluçka sürelerini kolaylaştırdığı gerçeğine dayanmaktadır. Örneğin, engelleme süreleri 2 saatten 1 saate düşürülür. Ek olarak, protokol sferoidlerin yüksek verimli üretimi için tasarlandığından, tüm işleme adımları, sferoidlerin kültürlendiği kuyuda gerçekleştirilir, yani bireysel sferoidlerin tüplere aktarılması gerekli değildir.

1. Sabitleme ve boyama için gerekli tüm çözeltileri ve tamponları hazırlayın
   1. 200 mL suya 1 PBS tablet ekleyerek Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) hazırlayın. PBS'yi otoklav edin.
   2. 3.1.3-3.1.4 adımlarını izleyerek paraformaldehit (PFA) hazırlayın.
   3. Bir duman davlumbazında 400 mL PBS'yi 60-70 °C'ye ısıtmak için ısıtılmış bir karıştırıcı kullanın. Karıştırırken 15 g PFA ekleyin. PFA çözündükten sonra, 50 μL 1 M CaCl2 ve 50 μL 1 M _MgCl2 ekleyin.
   4. 500 mL'lik bir son hacim oluşturmak için 100 mL PBS ekleyin. PFA'yı pH 7.4'e dengelemek için NaOH kullanın. PFA'yı steril vakum filtrelerinden (gözenek boyutu 0,22 μm), aliquot'tan süzün ve -20 ° C'de saklayın.
   5. 50 mL PBS'ye 3.75 g glisin ekleyerek 1 M glisin stok çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
   6. 2.4 mL PBS'ye 100 μL Triton X-100, 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) ve 1.5 mL 1 M glisin ekleyerek 5 mL geçirgenlik tamponu hazırlayın. 4 °C'de 2 haftadan fazla olmamak üzere saklayın.
   7. 4.9 mL PBS'ye 100 μL Triton X-100, 0.5 mL DMSO ve 0.05 g sığır serum albümini (BSA) ekleyerek 5 mL bloke edici tampon hazırlayın. Blokaj tamponunu 1,5 mL tüplere boşaltın ve -20 ° C'de saklayın.
   8. 4.74 mL PBS'ye 10 μL polisorbat 20, 0.05 g BSA ve 250 μL DMSO ekleyerek 5 mL antikor inkübasyon tamponu hazırlayın. Antikor inkübasyon tamponunu 1.5 mL tüplere boşaltın ve -20 ° C'de saklayın.
      NOT: Burada açıklanan protokolde, sferoidler sadece 96 kuyucuklu bir plakanın iç 60 kuyucuğuna monte edilir, ancak plakanın 96 kuyucuğunun hepsinde hazırlanabilirler. Sadece iç 60 kuyucukta sferoidlerin hazırlanmasının nedeni, bazı yüksek sayısal açıklıklı objektif lenslerin, bazı plaka tiplerindeki 'etek' nedeniyle dış kuyuların tüm kuyusunu fiziksel olarak görüntüleyememesidir. Yukarıdaki hacimler, sferoidler içeren 60 kuyunun hazırlanması için yeterlidir.
2. Sferoidleri düzeltin ve geçirgenleştirin
   1. ECM bodrum malzemesi tabakasının bozulmamasını sağlamak için ortamı sferoidlerden dikkatlice çıkarın.
   2. Sferoidleri her seferinde 3 dakika boyunca 70 μL PBS ile iki kez yıkayın.
   3. Sferoidleri 37 ° C'de 1 saat boyunca 70 μL% 3 PFA ile sabitleyin.
   4. Sferoidleri her seferinde 3 dakika boyunca 70 μL PBS ile iki kez yıkayın.
   5. 37 °C'de 30 dakika boyunca 70 μL 0,5 M glisin çözeltisi ile söndürün.
   6. RT'de 30 dakika boyunca 70 μL geçirgenlik tamponu kullanarak sferoidleri geçirgenleştirin.
   7. Sferoidleri her seferinde 3 dakika boyunca 70 μL PBS ile iki kez yıkayın.
   8. Sferoidleri 37 ° C'de 1 saat boyunca 70 μL bloke tamponunda inkübe edin.
      NOT: Sferoidler sabitlendikten sonra, sonraki tüm işleme adımları 8 kanallı pipet veya varsa 96 delikli pipetleme kafası kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu, görüntülemeden önce küresel preparatın hızını arttırır.
3. Primer ve sekonder antikorları kullanan immünostain sferoidler
   1. Birincil antikoru antikor inkübasyon tamponunda uygun bir seyreltmeye seyreltin ve her bir oyuğa 70 μL ekleyin. Sferoidleri bir gecede birincil antikor ile inkübe edin.
      NOT: Seyreltme, kullanılan spesifik antikora bağlıdır. Burada gösterilen örnekte, lizozomlar 1:500'lük bir seyreltme kullanılarak fare anti-LAMP1 antikorları ile immünoboyalıdır.
   2. Ertesi gün, sferoidleri her seferinde 3 dakika boyunca 70 μL PBS ile 5 kez yıkayın.
   3. Sekonder antikoru 1:500 seyreltmede, floresan konjuge falloidini 1:500'de ve Hoechst 33342'yi (1 mg ^mL-1 stoktan) antikor inkübasyon tamponunda 1:5000'de seyreltin ve her bir oyuğa 70 μL ekleyin. Gece boyunca kuluçkaya yatırın.
      NOT: Antikor seyreltmesi, kullanılan spesifik antikora bağlıdır. Yüksek fotostabilite ve yüksek parlaklık gösteren yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikorlar önerilir.
   4. Ertesi gün, sferoidleri her seferinde 3 dakika boyunca 70 μL PBS ile 5 kez yıkayın.
      NOT: Plakalar, sferoidler PBS ile kaplı kaldığı sürece, görüntülemeden önce RT'de iki haftaya kadar saklanabilir.

4. Görüntü toplama ve sferoidlerin analizi

1. Görüntü alma
   1. Sferoidler içeren 96 delikli plakayı konfokal yüksek içerikli bir tarama mikroskobuna yerleştirin.
   2. Kullanılan floroforları uyarmak için uygun lazerleri seçin.
   3. Çapraz konuşmayı önlemek için kanalları sırayla edinin.
   4. Uygun hedefleri kullanarak küreselleri görüntüleyin.
      NOT: Varsa suya daldırma hedeflerinin kullanılması önerilir. Örneğin, 20x/1,0 NA objektif, ~77 görüş alanında bir kuyunun tamamını görüntüleyebilir. 63x/1.15 NA hedefi, yaklaşık 826 görüş alanında tüm kuyuyu görüntüleyebilir.
   5. Görüntü ~ 30-40 dilim, küresel derinliğe bağlı olarak, her dilim bir öncekinden 1,5 μm aralıklarla alınır.
2. Görüntü analizi
   1. Sferoidlerin morfolojik analizi için 4.2.2-4.2.6 adımlarını izleyin.
   2. Floresan konjuge falloidin boyamasına dayanarak sferoidleri segmentlere ayırın.
   3. Çekirdekleri Hoechst 33342 boyamasına göre segmentlere ayırın.
   4. Her hücrenin sitoplazmasını, hücre sitoplazmasında bulunan artık Hoechst 33342 boyası ile segmentlere ayırın.
   5. Sferoidlerin hacim, yüzey alanı, sferisite ve sferoid başına çekirdek sayısı dahil olmak üzere farklı morfolojik özelliklerini hesaplayın.
      NOT: Bu bilgiler, tercih edilen görüntü analiz yazılımında yerleşik olarak bulunan çeşitli algoritmalar kullanılarak ayıklanır.
   6. 75.000 μm3'ten küçük ve 900.000 ^μm3'ten büyük sferoidleri kaldırmak için görüntüleri daha fazla ^işleyin.
      NOT: Bu değerler, çoklu sferoidlerin füzyonu sonucu ortaya çıkmış olabilecek çok küçük hücre düzeneklerinin ve büyük düzeneklerin çıkarılmasına izin vermek için önerilerdir. Sferoidler bu adımda farklı boyut sınıflarına da ayrılabilir.
   7. Sferoidler içindeki tek hücreleri analiz etmek için 4.2.8-4.2.12 arasındaki adımları izleyin.
   8. Floresan konjuge falloidin boyamasına dayanarak sferoidleri segmentlere ayırın.
   9. Çekirdekleri Hoechst 33342 boyamasına göre segmentlere ayırın.
   10. Her hücrenin sitoplazmasını, hücre sitoplazmasında bulunan artık Hoechst 33342 boyası ile segmentlere ayırın.
   11. Sekonder antikor boyamasına göre lizozomları segmentlere ayırın.
   12. Hücre başına lizozom sayısı, hücre hacmi ve hücre yüzey alanı dahil olmak üzere her bir sferoid içindeki hücrelerin farklı morfolojik özelliklerini hesaplayın.
       NOT: Bu bilgiler, tercih edilen görüntü analiz yazılımında yerleşik olarak bulunan çeşitli algoritmalar kullanılarak ayıklanır.

Sonuçlar

Bu protokolde, çeşitli tümör dokularını temsil etmek için farklı hücre tiplerini kullanarak, sferoidler şeklinde 3D hücre kültürü montajları üretmek için sağlam bir yöntem detaylandırılmıştır. Bu yöntem, kuyu başına yüzlerce sferoid üretilmesine izin verir, bu da hücre bazlı tahlillerin yüksek içerikli bir şekilde yapılmasını sağlar (Şekil 1). Bu yaklaşım daha önce HT-29 ^{sferoidlerinde16} nanopartikül alımını ve HepG2 sferoidlerinde17 nanopartikül kaynaklı toksisiteyi ...

Tartışma

Burada açıklanan yaklaşım, HCS ve HCA için uygun bir şekilde kuyu başına birkaç yüz sferoid üretmek için bir platformu detaylandırmaktadır. Kuyu başına sadece bir sferoid oluşumuna izin veren düz tabanlı ve yuvarlak tabanlı ULA plakalarının kullanımı gibi diğer popüler yöntemlerle ^{karşılaştırıldığında18,19,} bu yöntem yüksek çözünürlüklü bilgilerin çok sayıda sferoidden bir tarama formatında çıkarılmasına olanak sağlar. Özellikle, bu yöntem, çeşitli tümör tiplerin...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 0.05 Tripsin-EDTA (1x), fenol kırmızısı	Gibco	25300054
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma Aldrich	A6003
Kalsiyum klorür	Fisher Scientific	10050070
CellCarrier-96 Ultra Mikroplakalar, doku kültürü ile tedavi edilmiş, siyah, 96 oyuklu	kapaklı Perkin Elmer	6055302	Bu plakalar Fenoplakalar
olarak yeniden adlandırılmıştırDimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Fetal Sığır Serumu (FBS), nitelikli, AB onaylı, Güney Amerika menşeli, ısıyla inaktive	edilmiş Gibco	10500064
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Keçi anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029
L-Glutamin çözeltisi, 200 mM	Gibco	25030024
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	14533
Magnezyum klorür	Fisher Scientific	10647032
Matrigel Bazal Membran Matrisi, Fenol Kırmızısı içermez, LDEV içermez, 10 mL	Corning	356237	Bu Matrigel formülasyonu, BD Biosciences'ta aynı katalog numarasıyla da bulunabilir
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış Matrigel	BD Biosciences	356231	Bu Matrigel formülasyonu, Corning
McCoy'un 5A ortamı	Gibco'da	aynı
McCoy'un L glutamin ve sodyum bikarbonat içeren 5A ortamında, fenol kırmızısı	Hidroklon	10358633
Minimum Esansiyel Ortam (MEM)		21090022
Minimum Esansiyel Ortam (MEM), glutamin içermez, fenol kırmızısı	içermez Gibco	51200046
Fare monoklonal anti-LAMP1 antikoru (konsantre)	Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası	H4A3-a
Neubauer sayım odası	Hirschmann	8100203
Nunclon kapaklı doku kültürü kabı, polistiren, 92 mm x 17 mm	ThermoFisher Scientific	150350
Opera Phoenix HCS Sistemi ve Harmony HCA yazılımı	Perkin Elmer	HCSHH14000000
Paraformaldehit (PFA)	Sigma Aldrich	P6148
Phalloidin Alexa Fluor 568	Invitrogen	A12380
Fosfat Tamponlu Salin (PBS) tabletleri	Sigma Aldrich	P4417
Polisorbat 20	Sigma Aldrich	P5927
RPMI 1640 Orta, GlutaMAX Takviyesi	Gibco	61870010
RPMI 1640 Orta, glutaminsiz, fenol kırmızısı içermez	Gibco	11835063
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
Stericup steril vakum filtre üniteleri	Millipore	SCGVU05RE