Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre

1.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63456

⸱

11 Şubat 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

Bu makalede

Özet

Mevcut protokol, yeniden kullanılabilir tek bir hücre kullanarak yinelemeli epigenomik analizler için tek hücreli bir yöntemi açıklamaktadır. Yeniden kullanılabilir tek hücre, aynı tek hücrede birden fazla epigenetik işaretin analizine ve sonuçların istatistiksel olarak doğrulanmasına izin verir.

Özet

Mevcut tek hücreli epigenom analizleri tek kullanım için tasarlanmıştır. Hücre tek bir kullanımdan sonra atılır, tek bir hücrede çoklu epigenetik işaretlerin analizini önler ve sinyali tek bir hücredeki deneysel arka plan gürültüsünden ayırt etmek için diğer hücrelerden veri gerektirir. Bu makalede, yinelemeli epigenomik analizler için aynı tek hücreyi yeniden kullanma yöntemi açıklanmaktadır.

Bu deneysel yöntemde, hücresel proteinler ilk önce protein ve DNA'ya çapraz bağlamak yerine bir poliakrilamid polimere bağlanır ve yapısal önyargıyı hafifletir. Bu kritik adım, aynı tek hücreyle tekrarlanan deneylere izin verir. Daha sonra, yakınlık ligasyonu için bir iskele dizisine sahip rastgele bir astar, genomik DNA'ya tavlanır ve genomik dizi, bir DNA polimeraz kullanılarak genişletilerek primer'e eklenir. Daha sonra, her biri farklı DNA probları ile etiketlenmiş bir epigenetik belirteç ve kontrol IgG'ye karşı bir antikor, aynı tek hücredeki ilgili hedeflere bağlanır.

Rastgele primer ve antikor arasında, rastgele primer ve antikor-DNA probunun iskele dizisine tamamlayıcı dizilere sahip bir bağlayıcı DNA eklenerek yakınlık ligasyonu indüklenir. Bu yaklaşım, antikor bilgisini ve yakındaki genom dizilerini, yakınlık ligasyonunun tek bir DNA ürününde bütünleştirir. Aynı tek hücreyle tekrarlanan deneylere olanak tanıyarak, bu yöntem nadir bir hücreden veri yoğunluğunda bir artışa ve aynı hücreden sadece IgG ve antikor verilerini kullanarak istatistiksel analize izin verir. Bu yöntemle hazırlanan yeniden kullanılabilir tek hücreler en az birkaç ay saklanabilir ve daha sonra epigenetik karakterizasyonu genişletmek ve veri yoğunluğunu artırmak için tekrar kullanılabilir. Bu yöntem araştırmacılara ve projelerine esneklik sağlar.

Giriş

Tek hücreli teknoloji, bireysel tek hücreli omik teknolojilerini entegre eden tek hücreli multiomik çağına giriyor1. Son zamanlarda, tek hücreli transkriptomikler, kromatin erişilebilirliğini (scNMT-seq2 ve SHARE-seq3) veya histon modifikasyonlarını (Paired-seq4 ve Paired-Tag5) tespit etmek için yöntemlerle birleştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, tek hücreli transkriptomik ve proteomik, kromatin erişilebilirliği ile entegre edilmiştir (DOGMA-seq6). Bu yöntemler, kromatin erişilebilirliğini veya histon modifikasyonlarını tespit etmek için transpozaz tabanlı etiketleme kullanır.

Transpozaz bazlı yaklaşımlar genomik DNA'yı parçalara ayırır ve genomik DNA fragmanının sonuna bir DNA barkodu ekler. Her parçalanmış genomik parça sadece iki DNA barkodunu (= bölünme bölgesi başına bir epigenetik işaret) kabul edebilir ve bölünme bölgesindeki genomik DNA kaybolur. Bu nedenle, bölünmeye dayalı yaklaşımlar, test edilen epigenetik işaretlerin sayısı ile sinyal yoğunluğu arasında bir dengeye sahiptir. Bu, aynı tek hücredeki çoklu epigenetik işaretlerin analizini engeller. Bu sorunun üstesinden gelmek için genomik DNA'yı parçalamayan tek hücreli bir epigenomik yöntem geliştirilmiştir 7,8.

Yukarıda bahsedilen bölünme kaynaklı soruna ek olarak, transpozaz tabanlı yaklaşımların başka sınırlamaları da vardır. Tek hücreli epigenom analizinde, histonların ve DNA ile ilişkili proteinlerin genom üzerindeki yerini bilmek çok önemlidir. Mevcut yaklaşımlarda bu, sabit olmayan tek hücreler kullanılarak ve protein-DNA ve protein-protein etkileşimlerinin tutulmasıyla gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu, histon modifikasyonlarının analizinde bile erişilebilir kromatin bölgelerine güçlü bir önyargı oluşturur 9. Histonların ve genomla ilişkili proteinlerin genom üzerindeki yeri, bir poliakrilamid iskelesi 7,8 kullanılarak protein-DNA ve protein-proteini çapraz bağlamadan korunabilir. Bu yaklaşım, protein-DNA ve protein-protein etkileşimlerine dayanan mevcut yaklaşımlarda gözlenen yapısal önyargıyı azaltır.

Transpozaz tabanlı yaklaşımlar, tek bir hücreden yalnızca bir kez sinyal alabilir. Bu nedenle, sinyallerin düşmesi nedeniyle tek bir hücrenin tam epigenomunu tanımlamak zordur. Yeniden kullanılabilir tek hücreler, aynı tek hücrede yinelemeli epigenomik analize izin vererek mevcut sınırlamaların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: yöntemin şematik bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.

figure-protocol-1
Şekil 1: Protokol iş akışının şematik gösterimi. Adım 7.2-13 şematik gösterimlerle açıklanmaktadır. Her satır protokoldeki bir adımı gösterir. Yeşil renkli bir hücresel protein, kristal bir yapıya (PDB: 6M4G) dayanarak üretilen bir insan nükleozomudur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

1. Tuzdan arındırma kolonlarının dengelenmesi

NOT: Tuzdan arındırma spin sütunları aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi dengelenir. Dengelenmiş tuzdan arındırma sütunları adım 2.1, 3.4 ve 4.6'da kullanılır.

  1. Bir tuzdan arındırma kolonunun alt kapağını çıkarın (7 kDa kesme, 0,5 mL reçine boncuk hacmi, Malzeme Tablosuna bakın) ve tuzdan arındırma kolonunun üstündeki kapağı gevşetin.
  2. Kolonu 1,5 mL protein düşük bağlayıcı bir tüpe (bir toplama tüpü, Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin ve kolondaki depolama çözeltisini çıkarmak için oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüj.
    NOT: Boncuk yatağının üstünü düzleştirmek için bir salıncak rotor santrifüjü kullanın.
  3. 1,5 mL tüpteki akışı çıkarın ve reçine yatağının üzerine 300 μL 150 mM NaCl/100 mM fosfat tamponu, pH 8,0 (bakınız Tablo 1) ekleyin.
  4. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüj yapın ve toplama borusundaki akışı giderin.
  5. 1.3-1.4 arasındaki adımları üç kez daha yineleyin.
  6. Tamponu toplama tüpünden atın ve sütunu yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
  7. Adım 2.1, 3.4 ve 4.4'teki dengeli tuzdan arındırma sütununu kullanın.

2. Antikorların tampon değişimi

NOT: Anti-H3K27ac 10, anti-H3K27me3 10, anti-Med111 ve anti-Pol II10'dan gliserol, arginin ve sodyum azidi çıkarın (bkz. DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki tüm prosedürler temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 1 saat

  1. Antikor çözeltisini (100 μL, bakınız Tablo 2) 1. adımı takiben hazırlanan dengeli bir tuzdan arındırma kolonuna uygulayın.
  2. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüj yapın ve akışı toplama tüpünden 1,5 mL protein düşük bağlayıcı tüpe aktarın.
  3. IgG konsantrasyonunu 280 nm12'de absorbans kullanarak ölçün (bir mikrohacim spektrofotometresi kullanın).
  4. Antikor çözeltisini bir ultrafiltrasyon kasetine aktarın (moleküler ağırlık kesme 100 kDa, 0,5 mL, Malzeme Tablosuna bakın) ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj.
  5. 280 nm'deki absorbansı kullanarak IgG konsantrasyonunu ölçün.
  6. IgG konsantrasyonu 1 mg / mL'ye ulaşana kadar 2.4-2.5 adımlarını tekrarlayın.

3. Antikor aktivasyonu

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 2.5 saat

  1. 1 mg süksinimidil 6-hidrazinonikotinat aseton hidrazonu (S-HyNic, Malzeme Tablosuna bakınız) 100 μL susuz N, N-dimetilformamid (DMF, Malzeme Tablosuna bakınız) ile çözün.
    NOT: DMF, yanıcı bir organik çözücüdür ve cilt yoluyla emilen güçlü bir karaciğer toksinidir. Eldiven, güvenlik gözlüğü ve laboratuvar önlüğü giyin. Kurumsal güvenlik yönergelerine uyun. Kullanılan laboratuvar yazılımlarını kurumsal yönergelere göre atın.
  2. 100 μL antikor çözeltisine 0.6 μL S-HyNic/DMF ekleyin (150 mM NaCl/100 mM Sodyum fosfat içinde 1 mg/mL, pH8.0). Kullanılan antikorlar ve kontrol IgG için Tablo 2'ye bakınız.
  3. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin (ışıktan koruyun).
  4. Numuneyi toplamak için dengelenmiş tuzdan arındırma kolonunun tepesine 100 μL S-Hynic reaksiyonlu antikor uygulayın (bkz. adım 1) ve 4 °C'de 2 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüj yapın.
  5. Kullandıktan sonra tuzdan arındırma sütununu atın.
    NOT: HyNic gruplarının proteinler ve diğer biyomoleküller üzerindeki kararlılığı değişir. Hynic modifiye biyomoleküllerin derhal konjuge edilmesi önerilir.

4. DNA probunun aktivasyonu

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 2.5 saat

  1. Antikor veya kontrol IgG (Antikor Probu, Tablo 3) için amin modifiye edilmiş bir DNA probunun bir peletini 20 μL 150 mM NaCl / 100 mM Sodyum Fosfat tamponu, pH 8.0 ile çözün.
    NOT: Tüpün altında ince, şeffaf bir pelet/film olup olmadığına bakın. Tamponu doğrudan peletin üzerine uygulayın. Pelet görünmüyorsa, pelet ayrılmış ve duvara veya kapağa yapışmış olabilir. Bu durumda, tüpü santrifüj edin ve tüpün dibinde bir pelet arayın.
  2. 1 mg süksinimidil 4-formilbenzoat (S-4FB, Malzeme Tablosuna bakınız) 50 μL susuz DMF ile çözün ve çözünmüş Antikor Probuna 10 μL DMF ekleyin.
  3. Adım 4.2'de hazırlanan 4 μL S-4FB / DMF ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin (ışıktan koruyarak).
  4. Dengelenmiş tuzdan arındırma kolonunun üst kısmına 34 μL S-4FB reaksiyonlu Antikor Probu uygulayın (bkz. adım 1).
  5. Numune tamamen emildikten sonra jel yatağının üstüne 15 μL 150 mM NaCl/100 mM Sodyum fosfat tamponu, pH 8.0 uygulayın ve S-4FB modifiye Antikor Probunu toplamak için 4 °C'de 2 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüj yapın.
  6. Sonraki konjugasyon için akışı kullanın; absorbansı 260 nm'de ölçmek; ve Antikor Probunun iyileşme oranını hesaplayın.

5. S-HyNic-modifiye antikor ve S-4FB-modifiye Antikor Probunun konjugasyonu

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 2 saat

  1. S-Hynic modifiye antikoru ve S-4FB modifiye Antikor Probunu karıştırın ve karıştırmak için çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyin.
  2. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin (ışıktan koruyarak).
  3. Reaksiyonu söndürmek için, 478.8 μL Söndürme ve Depolama çözeltisi ekleyin (bkz. Tablo 1).
  4. Antikor Probu konjuge antikor çözeltisini bir ultrafiltrasyon kasetine aktarın (moleküler ağırlık kesme 100 kDa).
  5. 12.000 × g, 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj.
  6. Pipetleme ile kasetin içindeki çözeltinin hacmini kontrol edin.
  7. Ses seviyesi 100 μL'ye ulaşana kadar 5,5-5,6 arasındaki adımları tekrarlayın ve -20 °C'de saklayın.
    NOT: IgG konsantrasyonu, bir IgG standardı kullanılarak sandviç ELISA13,14,15 ile ölçülür.

6. Çekirdek manyetik boncukların hazırlanması

NOT: Bu yöntemde, tek bir hücre iki katmanlı bir akrilamid boncuğuna gömülür (bkz. Şekil 2). Çekirdek manyetik bir poliakrilamid boncuktur. Dış tabaka tek başına poliakrilamid dir. Çekirdek manyetik boncuklar bu bölümde üretilir. Bu bölüm deneme için gerekli değildir. Süre: 3 saat

figure-protocol-2
Şekil 2: REpi-seq deneylerinde görünürlük ve kolay kullanım için iki katmanlı bir poliakrilamid boncuğun yapısı . (A) Santrifüjlemeden sonra adım 6.6'dan itibaren manyetik nanopartiküller. Manyetik nanopartiküller monomerik akrilamid ile modifiye edilir ve B'de gösterilen poliakrilamid manyetik boncuğuna entegre edilir. (B) Poliakrilamid manyetik boncuk ile yeniden kullanılabilir tek bir hücrenin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. 50 μL 1 M sodyum bikarbonat tamponu, pH 8.5 ve 450 μL% 40 akrilamid çözeltisini karıştırın.
    NOT: Akrilamid bir nörotoksindir. Eldiven, göz koruyucu ve laboratuvar önlüğü giyin. Kurumsal güvenlik yönergelerine uyun. Kullanılan laboratuvar yazılımlarını kurumsal yönergelere göre atın.
  2. Akrilamid / sodyum bikarbonat tamponunda 1 g NHS ester fonksiyonelleştirilmiş 30 nm demir oksit tozunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) askıya alın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Akrilamid boncuklar şeffaf olduğundan, boncukların konumunu görmek ve manipüle etmek zor olabilir. Demir oksitten yapılmış bir çekirdek boncuğun dahil edilmesi görünürlüğü arttırır ve manipülasyonu kolaylaştırır, çünkü boncukların konumu bir mıknatıs kullanılarak kontrol edilebilir. Bununla birlikte, kullanıcılar REpi-seq deneylerine aşina ise, çekirdek manyetik poliakrilamid boncuklarının kullanımı atlanabilir.
  3. Nanoboncuk süspansiyonunu 2 tüpe (1,5 mL) aktarın, 4 ° C'de 1 saat boyunca 21.300 × g'da santrifüj yapın (açılı bir rotor kullanın) ve süpernatanı çıkarın.
  4. Alt bulamacı 1 mL% 40 Akrilamid/Bis-akrilamid ile askıya alın (19:1, Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Bis-akrilamid bir nörotoksindir. Eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Kurumsal güvenlik yönergelerine uyun. Kullanılan laboratuvar yazılımlarını kurumsal yönergelere göre atın.
  5. 4 °C'de 1 saat boyunca 21.300 × g'da santrifüj (açılı rotor kullanın).
  6. 4 °C'de 30 dakika boyunca 5.000 × g'da santrifüj yapın (frensiz bir salıncak rotoru kullanın).
  7. Düşük hızlı aspirasyona sahip bir P1000 pipet kullanarak süpernatantı çıkarın.
  8. Ses seviyesini 400 μL @ Akrilamid/Bis-akrilamid olarak ayarlayın (19:1, Malzeme Tablosuna bakın).
  9. 25 μL% 10'luk amonyum persülfat çözeltisi ekleyin (bkz. Tablo 1).
    NOT: Amonyum persülfat güçlü bir oksitleyici ajandır. Amonyum persülfat içeren havadaki toz, temas ettiğinde gözü, burnu, boğazı, akciğeri ve cildi tahriş edebilir. Eldiven, güvenlik gözlüğü ve laboratuvar önlüğü giyin. Kurumsal güvenlik yönergelerine uyun. Kullanılan laboratuvar yazılımlarını kurumsal yönergelere göre atın.
  10. Çekirdek manyetik poliakrilamid boncukları üretmek için, akrilamid modifiye demir oksit süspansiyonunun 0.5 μL'sini bir PCR tüpüne aktarın.
  11. 50 μL% 4 N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin/mineral yağ (TEMED, bakınız Tablo 1) ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    NOT: TEMED yanıcı bir çözücüdür. Bir kaputun altında çalışın. Nefes almayın. Açık alevlerden, sıcak yüzeylerden ve tutuşma kaynaklarından uzak tutun. Eldiven, güvenlik gözlüğü ve laboratuvar önlüğü giyin. Kurumsal güvenlik yönergelerine uyun. Kullanılan laboratuvar yazılımlarını kurumsal yönergelere göre atın.

7. Hücresel proteinlerin amino grubunun monomer akrilamid ile değiştirilmesi

NOT: REpi-seq, fare ve insan hücrelerinin epigenomunu tek hücre seviyesinde analiz etmek için tasarlanmıştır. Bu yöntemi fare veya insan dışındaki türlerin hücrelerinde kullanırken her adım optimize edilmelidir.

  1. Hücrelerin toplanması
    NOT: Süre: 30 dk
    1. Bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu ve canlılığını ölçün ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: Bu adımdaki hücrelerin yaşayabilirliği, veri analizinde kaç hücrenin canlı hücre olduğunu etkiler.
    2. Hücre konsantrasyonunu% 10 fetal sığır serumu içeren kültür ortamı (*) ile 1 × 105 hücre / mL'ye ayarlayın.
      NOT: *Kültür ortamı, ilgilenilen hücreler için en uygun kültür ortamıdır.
    3. Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
    4. Hücre süspansiyonunu 240 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.
    5. 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin, hücreleri nazik pipetleme ile karıştırın ve hücre süspansiyonunu 240 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
    6. Supernatan'ı çıkarın.
      NOT: Yukarıdaki tüm adımlar, kontaminasyonu önlemek için laminer akışlı temiz bir davlumbazda gerçekleştirilmelidir.
  2. Hücresel proteinlerin amino grubunun monomerik akrilamid ile değiştirilmesi
    NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 1.5 saat
    1. Hücre peletine 1 mL Amino Grubu Modifikasyon çözeltisi (bakınız Tablo 1) ekleyin ve hücre peletini nazik pipetleme ile askıya alın.
    2. Tüpü buz üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin ve hücre süspansiyonunu 240 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
    3. Süpernatantı çıkarın ve DNA için bir interkalatör boya içeren 100 mL% 4 akrilamid / 1 mM EDTA / PBS içeren hücreleri yeniden askıya alın (bakınız Tablo 1, 1 hücre / μL).

8. Yeniden kullanılabilir tek hücrelerin hazırlanması

  1. Yeniden kullanılabilir tek hücrelerin hazırlanması (manuel versiyon)
    NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Zaman: 9 saat/96 hücre
    1. DNA için bir interkalatör boya içeren hücre süspansiyonunun 1 mL'sini (1 hücre/μL) ve 199 mL'lik 1 mM EDTA/PBS'yi karıştırın (bakınız Tablo 1).
    2. Hücre süspansiyonunun 200 μL'sini düz tabanlı 96 delikli plakaların her bir kuyucuğuna aktarın (toplam 10 plaka, Malzeme Tablosuna bakınız).
    3. Kapağı 96 delikli plakanın üzerine yerleştirin ve tek bir hücre içeren kuyucukları tanımlamak için bir tarama mikroskobu kullanarak 10 plakayı tarayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
    4. Tek bir hücre içeren kuyucuğun içeriğini bir PCR tüpüne aktarın.
      1. Plakayı (operatöre doğru) eğin ve tek hücre kuyunun alt kenarına batana kadar birkaç dakika bekleyin.
      2. Pipet ucunu alt köşeye yerleştirin ve tek hücreyi ve tamponu (aspire 210 μL/kuyu = 200 μL tampon + 10 μL hava) bir PCR tüpüne aktarın.
        NOT: P200 düşük tutma özelliğine sahip bir ipucu kullandığınızdan emin olun.
      3. Aktarımı onaylamak için bir floresan mikroskobu kullanarak kuyucuğu kontrol edin.
      4. Tek bir hücre hala kuyuda ise, DNA için bir interkalatör boya içeren 1 mM EDTA / PBS'nin 200 μL / kuyusunu ekleyin.
      5. Ardından, aktarımı tekrarlayın.
    5. PCR tüpünü frensiz bir dönüş rotoru kullanarak 4 °C'de 5 dakika boyunca 240 × g'da santrifüjleyin.
      NOT: Frenleme, tüpte dönen bir su akışına neden olur ve bu da tek hücrenin çökelmesini bozar. Frensiz sallanan bir rotorla santrifüj yaparken, tek hücre her zaman tüpün dibine batar. Bununla birlikte, açılı bir rotor kullanılırsa, tek hücre PCR tüpünün yan duvarına yapışır ve kaybolabilir.
    6. Süpernatantın 195 μL'sini çok yavaş bir pipetleme hızıyla çıkarın.
    7. 195 μL/tüp Akrilamid/Bis-akrilamid/APS çözeltisi ekleyin (bkz. Tablo 1).
    8. PCR tüpünü frensiz bir dönüş rotoru kullanarak 4 °C'de 5 dakika boyunca 240 × g'da santrifüjleyin.
    9. Süpernatantın 195 μL'sini çok yavaş pipetleme hızıyla çıkarın.
    10. Alt 3 μL'yi% 4 TEMED / mineral yağ ve manyetik bir poliakrilamid boncuk (adım 6'da üretilen) içeren PCR tüpüne aktarın.
      NOT: P10 düşük tutma özelliğine sahip bir ipucu kullandığınızdan emin olun. Hücreyi manyetik poliakrilamid boncuğun yakınında dağıtın. Mineral yağda, tek hücreyi içeren sıvı, manyetik poliakrilamid boncuğun yüzeyine yüzey gerilimi ile yapışır.
    11. Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
      NOT: Bu işlem iki katmanlı bir akrilamid jel boncuk üretir. Çekirdek manyetik bir jel boncuktur. Dış tabaka, tek bir hücre içeren poliakrilamid jeldir. Tek hücre, jelin dış tabakasına gömülüdür. Güvenli durma noktası: Yeniden kullanılabilir tek hücreler P gliserol/1 mM EDTA/%0,05 Tween /0,5 BSA/TBS tamponu ile yıkandıktan sonra, yeniden kullanılabilir tekli hücreler -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
  2. Yeniden kullanılabilir tek hücrelerin hazırlanması (yarı otomatik versiyon)
    NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Zaman: 3 saat/96 hücre
    1. DNA için bir interkalatör boya içeren 1 mL hücre süspansiyonu (1 hücre/μL) ve 199 mL 1 mM EDTA/PBS'yi karıştırın (bkz. Tablo 1).
    2. Hücre süspansiyonunun 200 μL'sini 4 nL'lik bir nanowell plakasının her bir kuyucuğuna aktarın (Şekil 3'e ve Malzeme Tablosuna bakın) ve 4 nL nanowell plakasını otomatik bir tek hücreli toplama robotuna yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
    3. Otomatik tek hücreli toplama robotuna varış plakası olarak 96 delikli bir PCR plakası yerleştirin. Her bir kuyucuğun 200 μL/kuyu Akrilamid / Bis-akrilamid / APS çözeltisi içerdiğinden emin olun (bkz. Tablo 1).
    4. Tek bir hücreyi 4 nL'lik bir nano kuyudan 96 delikli PCR plakasının bir kuyucuğuna aktarın (bkz.
    5. 96 delikli PCR plakasının üzerine bir kapak yerleştirin ve frensiz bir salıncak rotoru kullanarak 96 delikli plakayı 240 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
    6. 96 delikli PCR plakasını otomatik bir sıvı taşıma robotunun güvertesine yerleştirin ( Malzeme Tablosu, Şekil 4 ve Ek Kod 1'e bakınız).
    7. Ek Kod 1'i sürükleyip sıvı taşıma robotunun yazılım penceresine (Malzeme Tablosuna bakın) bırakın.
    8. Programı otomatik sıvı taşıma robotunda çalıştırın (bkz. Ek Video S2 ve Ek Video S3).
      1. Süpernatantın 195 μL'sini çok yavaş bir pipetleme hızıyla çıkarın.
      2. 50 μL %4 TEMED/mineral yağ ekleyin.
        NOT: 8.2.8.1-8.2.8.2 adımları manuel pipetleme ile gerçekleştirilebilir.
    9. Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin (Şekil 5). Güvenli durma noktası: Yeniden kullanılabilir tek hücreleri P gliserol/1 mM EDTA/%0,05 Tween /0,5 BSA/TBS tamponu ile yıkadıktan sonra, yeniden kullanılabilir tek hücreleri -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.

figure-protocol-3
Şekil 3: Otomatik tek hücreli toplama ve adım 8.2'de 96 delikli bir PCR plakasına aktarma . (A) Tek bir hücre toplama sistemine genel bakış. Tek bir hücre toplama robotu, kontaminasyonu önlemek için laminer akışlı temiz bir davlumbazdadır. (B) Kuyunun içinde 4 nL nano kuyucuklu 24 delikli bir plaka. (C) 24 delikli plakadan bir kuyucuktaki hücre dağılımı. Yeşil noktalar, her 4 nL nano kuyuda tek bir hücre olarak tanımlanan hücrelerdir. Macenta noktalar, çiftler veya hücre katları olarak tanımlanan hücrelerdir. (D) 24 delikli plakadaki kuyunun parlak alan görüntüsü. Yeşil bir kare, tek bir hücre içeren 4 nL'lik bir nanowell'dir. Bir macenta kare, birden fazla hücre içeren 4 nL'lik bir nanowell'dir. (E) Bazı 4 nL nanowelllerin büyütülmüş alanı. Parlak noktalar 4 nL nanowelllerde tek hücrelerdir. Tek hücre toplama sistemi, DAPI boyamalı hücrelerin parlak alan ve floresan görüntülerini elde ederek tek bir hücre içeren nanokuyucukları tanımlar. Tanımlanan tek hücreler, 4 nL nanowell'den 96 delikli bir PCR plakasının bir kuyusuna aktarılır. Ölçek çubukları = 2 mm (C, D), 100 μm (E). Kısaltma = DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-4
Şekil 4: Bir sıvı taşıma robotu kullanarak yeniden kullanılabilir tek hücreler üretmek . (A) Sıvı taşıma robotunun bir güvertesi. Güvertede pipet ucu rafları için 11 yuva (P300 ipucu: Yuva 1-3, P20 uç: Yuva 5-6), 2 mL derin kuyucuklu 96 delikli plaka (Yuva 4), kuyucuk başına tek bir hücre içeren iki adet 96 delikli PCR plakası (Yuva 7 ve 10) ve sıvı atıklar için iki adet düz tabanlı 96 delikli plaka (Yuva 8 ve 11) bulunur. (B) Laboratuvar gereçlerini yerleştirdikten sonraki güverte. (C) Adım 8.8.1'de robotik pipetlemenin şematik gösterimi. Program, 96 delikli PCR plakasının altından tek bir hücreyi aspire etmeden süpernatantı çıkarır. (D) Ek Kod 1 kullanılarak oluşturulan yeniden kullanılabilir tek hücreler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

9. Rastgele astar tavlama ve uzatma

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Aşağıdaki adımlardaki yıldız işaretleri (*) tüp içinde yeniden kullanılabilir tek bir hücre içeren poliakrilamid boncukların konumunu kontrol etmek için manyetik bir ayırıcının kullanılabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, manyetik ayırıcının kullanılması zorunlu değildir. Pipet ucundan tüpün duvarı boyunca yavaşça aşağı doğru hareket ettirilerek, boncuklar yıkama veya tampon değişimi için yukarı itilir. Süre: 9 saat

  1. Mineral yağı pipetleme(*) ile çıkarın ve 200 μL 1x TP Mg(-) tampon ile 5 kez yıkayın (*) (10x TP Mg(-) tamponunu ultra saf su ile 1x tampona seyreltin, bkz.
  2. Süpernatantı (*) çıkarın ve 15 μL Tavlama tamponu ekleyin (bkz. Tablo 1).
  3. Buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
    NOT: Bu inkübasyonun amacı, plazma ve nükleer membranları geçirgen hale getirmek ve rastgele astarı hücre çekirdeğine vermektir.
  4. PCR tüplerini bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve 3 dakika boyunca 94 ° C'de ısıtın.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi, poliakrilamid boncuğun hacmi de dahil olmak üzere yaklaşık 20 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 °C'dir.
  5. Tüpleri buz soğutmalı metal bir bloğa aktarın ve 2 dakika boyunca inkübe edin.
  6. 4 μL MgSO4/NaCl/dNTP karışımı ekleyin ( bakınız Tablo 1) ve orta hızda bir vorteks karıştırıcı ile karıştırın.
  7. 1 μL Bst polimeraz, büyük parça ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve orta hızda bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın.
  8. Bir çalkalayıcıda 4 saat inkübe edin (4 ° C'de 600 rpm).
    NOT: Bu inkübasyonun amacı, Bst polimerazı hücre çekirdeğine vermektir.
  9. PCR tüpünü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programlardan birini çalıştırın.
    1. 4 saatlik bir program çalıştırın: 30 dakika boyunca 10 °C, 30 dakika için 20 °C ve 180 dakika için 25 °C.
    2. Alternatif olarak, bir gecelik program çalıştırın: 4 saat için 4 °C, 2 saat için 10 °C, 2 saat için 20 °C, 4 saat için 25 °C ve 4 °C'de tutun.
      NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi, poliakrilamid boncuğun hacmi de dahil olmak üzere yaklaşık 25 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 ° C'dir. Güvenli durma noktası: Yeniden kullanılabilir tek hücreleri 4 ° C'de saklayarak deneyi burada 1 güne kadar durdurun.

10. Antikor bağlama

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 1.5 saat

  1. 1,625 μL NaCl/EDTA/BSA çözeltisi ekleyin ( bkz. Tablo 1) ve düşük hızda vorteks yaparak karıştırın.
    NOT: Bu adım, 1) EDTA ile Mg 2 + şelasyonunu kolaylaştırmayı,2 ) genişletilmiş 1. st rastgele primerin 300 mM NaCl ile bağlanmasını stabilize etmeyi ve 3) sonraki reaksiyonda sığır serum albümini (BSA) kullanarak antikorların spesifik olmayan bağlanmasını engellemeyi amaçlamaktadır.
  2. Buz üzerinde 1 saat inkübe edin ve antikorun her birine 0.1 μg / mL ekleyin ve Antikor Probu ile konjuge edilmiş IgG'yi kontrol edin (5. adımda hazırlanır).
  3. Bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe sallayarak gece boyunca buz üzerinde inkübe edin.

11. Antikor probunun yakınlık ligasyonu ve proksimal olarak genişletilmiş rastgele astar

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Aşağıdaki adımlardaki yıldız işaretleri (*) tüp içinde yeniden kullanılabilir tek bir hücre içeren poliakrilamid boncukların konumunu kontrol etmek için manyetik bir ayırıcının nerede kullanılabileceğini gösterir. Bununla birlikte, manyetik ayırıcının kullanılması zorunlu değildir. Pipet ucundan tüpün duvarı boyunca yavaşça aşağı doğru hareket ettirilerek, boncuklar yıkama veya tampon değişimi için yukarı itilebilir. Süre: 6 saat

  1. Buz üzerinde 200 μL 1x TPM-T tamponu (her yıkamada 20 dakikalık inkübasyon) ile iki kez yıkayın (*) 10x TPM-T tamponunu (Tris-HCl / Potasyum klorür / Magnezyum sülfat / Triton X-100) ultra saf su ile 1x'e seyreltin).
  2. Süpernatantı (*) çıkarın ve (*) bir kez 1x T4 DNA ligaz tamponu ile yıkayın (bkz.
  3. Süpernatantı (*) çıkarın ve 19 μL Ligasyon Adaptörü Çözeltisi ekleyin (bkz. Tablo 1).
  4. 25 ° C'de 1 saat inkübe edin.
  5. 1 μL T4 DNA ligaz ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve tüpü bir vorteks karıştırıcı üzerinde orta hızda karıştırın.
  6. Tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: yakınlık ligasyon programı, 16 ° C'de 4 saat ve 25 ° C'de 30 dakika.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi, poliakrilamid boncuğun hacmi de dahil olmak üzere yaklaşık 25 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı oda sıcaklığıdır.
  7. 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(+) tamponu ile iki kez kısaca yıkayın (*) (bakınız Tablo 1; 10x stok tamponundan 1x tampon hazırlayın) ve hücreyi gece boyunca 4 °C'de saklayın. Güvenli durma noktası: Yeniden kullanılabilir tek hücreleri 4 °C'de depolayarak deneyi burada 1 güne kadar durdurun.

12. 1. rastgele astarın tam uzantısı

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 4.5 saat

  1. 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(-) tamponu ile iki kez yıkayın (bakınız Tablo 1, 10x stok tamponundan 1x tampon hazırlayın), süpernatanı çıkarın ve 20 μL Bst/dNTP/MgSO4 karışımı ekleyin (bkz. Tablo 1).
  2. Orta hızda bir vorteks karıştırıcı ile karıştırın ve yörüngesel bir çalkalayıcıda (6 ° C ve 500 rpm'de) 4 saat boyunca inkübe edin.
  3. Tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: tam uzatma programı: 1 saat için 10 °C, 1 saat için 20 °C, 1 saat için 30 °C, 1 saat için 40 °C, 1 saat için 50 °C, 1 saat için 65 °C, 10 dakika boyunca 94 °C ve 4 °C'de tutun.
    NOT: Güvenli durma noktası: Yeniden kullanılabilir tek hücreler 4 °C'de saklanarak deney burada 1 güne kadar durdurulabilir.

13. Çoklu deplasman amplifikasyonu

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 2,5 saat (13.1-13.2 arası adımlar) + 15 dakika (13.3-13.4 arası adımlar) + 1 gün (13.5-13.10 arası adımlar)

  1. 0,4 μL 100 μM 2nd rastgele astar ekleyin (bakınız Tablo 3) ve orta hızda bir vorteks karıştırıcı ile karıştırın.
  2. Bir yörüngesel çalkalayıcıda 6 ° C'de 2 saat ve 500 rpm'de inkübe edin ve tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve 3 dakika boyunca 94 ° C'de ısıtın.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi, poliakrilamid boncuğun hacmi de dahil olmak üzere yaklaşık 25.4 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 °C'dir.
  3. Tüpleri buz soğutmalı metal bir bloğa yerleştirin ve 1 μL / tüp Bst DNA polimeraz ekleyin.
  4. Vorteksi yavaş hızda, tüpleri bir termal çevrimleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın:
    4 saat boyunca 4 °C, 30 dakika için 10 °C, 30 dakika için 20 °C, 30 dakika için 30 °C, 30 dakika için 40 °C, 30 dakika için 50 °C, 60 dakika için 65 °C, 3 dakika boyunca 94 °C ve 4 °C'de tutun.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi, poliakrilamid boncuğun hacmi de dahil olmak üzere yaklaşık 26.4 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 ° C'dir. Güvenli durma noktası: Yeniden kullanılabilir tek hücreleri 4 ° C'de saklayarak deneyi burada 1 güne kadar durdurun.
  5. Süpernatantı (yaklaşık 20 μL) toplayın ve bir PCR tüpüne aktarın.
  6. Toplanan süpernatantı -80 ° C'de saklayın.
  7. Yeniden kullanılabilir tek hücreyi içeren bir PCR tüpüne 20 μL/tüp %0,05 Tween 20/0,1x TE tamponu ekleyin (bakınız Tablo 1) ve yeniden kullanılabilir tek hücreyi bir gecede 4 °C'de inkübe edin. Güvenli durma noktası: Kuluçka süresini uzatarak deneyi burada birkaç günlüğüne durdurun.
  8. Süpernatantı toplayın ve süpernatantı adım 13.5'te toplanan örnekle birleştirin.
  9. 13.7-13.8 arasındaki adımları bir kez daha yineleyin. Yeniden kullanılabilir tek hücreyi P gliserol/5 mM EDTA/%0,5 BSA/%0,05 Tween20/TBS tamponunda bekletin ve yörüngesel çalkalayıcıda (4 °C, 600 rpm) 30 dakika boyunca inkübe edin. Yeniden kullanılabilir tek hücreyi bir sonraki deneye kadar -20 ° C'de saklayın.
  10. 40 μL Exo-master karışımı ekleyin (bakınız Tablo 1) ve tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: i) 5 dakika boyunca 95 °C, ii) 30 s için 95 °C, iii) 60 °C 30 s, iv) 30 s için 72 °C, v) ii-iv adımlarını 19 kez tekrarlayın, vi) 5 dakika boyunca 72 °C, vii) 4 °C'de tutun.
    NOT: Tüp boyutu 0,2 mL'dir. Çözeltinin hacmi, poliakrilamid boncuğun hacmi de dahil olmak üzere yaklaşık 45 μL'dir. Termal döngü kapağının sıcaklığı 105 ° C'dir. Güvenli durma noktası: Deney, numune -80 ° C'de saklanarak en az birkaç gün boyunca burada durdurulabilir.

14. Fenol-kloroform saflaştırma ve polietilen glikol çökeltme

NOT: DNaz kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedür temiz bir başlık altında gerçekleştirilir. Süre: 1.5 saat

  1. Ürünü 0.5 mL DNA düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın ve 100 μL Fenol: Kloroform: İzoamil Alkol ekleyin.
    NOT: Fenol: Kloroform: İzoamil Alkol tahrişe neden olur ve muhtemelen temas yoluyla yanar. Eldiven, güvenlik gözlüğü ve laboratuvar önlüğü giyin. Sadece yeterli havalandırma ile kullanın veya uygun bir solunum cihazı kullanın. Kurumsal güvenlik yönergelerine uyun. Kullanılan laboratuvar yazılımlarını kurumsal yönergelere göre atın.
  2. Elle 30 sn çalkalayın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj yapın.
  3. Sulu fazı (80 μL) 0.5 mL DNA düşük bağlayıcı bir tüpe toplayın ve 40.84 μL / tüp Doğrusal akrilamid / MgCl2 karışımı ekleyin (bakınız Tablo 1).
  4. 47,06 μL/tüp P (w/v) PEG8000 (RNase içermeyen) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
  5. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 240 × g'da santrifüj yapın.












Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

K562 tek hücreleri, adım 8'de açıklanan protokol kullanılarak oluşturulmuştur (bkz. Şekil 5). Tek hücreler poliakrilamid boncuğun dış tabakasına gömüldü. Hücre DNA'sı, DNA boyaması için bir interkalatör boya kullanılarak boyandı ve görselleştirildi.

figure-results-1
Şekil 5: Oluşturulan yeniden kullanılabilir tek hücreler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makalede, yeniden kullanılabilir tek hücreler7 kullanılarak yakın zamanda bildirilen tek hücreli multiepigenomik analiz için adım adım protokol açıklanmaktadır. Sonraki paragraflarda, protokoldeki potansiyel sınırlamaları vurgulayarak kritik noktaları tartışıyoruz.

Protokol boyunca kritik noktalardan biri (7.2-13. adımlardan itibaren) DNaz kontaminasyonunu önlemektir. Tek bir hücre, genomik DNA'nın sadece iki kopyasına sahiptir. Bu nedenle, genomik DNA'ya zarar verm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Ohnuki ve Tosato, "Yeniden kullanılabilir tek bir hücre hazırlama yöntemleri ve tek bir hücrenin epigenomunu, transkriptomunu ve genomunu analiz etme yöntemleri" (EP3619307 ve US20200102604) başlıklı bir patentin ortak mucitleridir. Patent başvurusu kısmen mevcut makalede açıklanan teknolojiyle ilgili ön sonuçlara dayanarak yapılmıştır. Bu patent başvurusunda açıklanan ve iddia edilen buluş veya icatlar, mucitler ABD Hükümeti'nin tam zamanlı çalışanlarıyken yapılmıştır. Bu nedenle, 45 Federal Düzenlemeler Yasası Bölüm 7 uyarınca, bu patent başvurusuna ilişkin tüm haklar, unvanlar ve menfaatler yasa gereği ABD Hükümetine devredilmiştir veya verilmelidir. ABD Hükümeti, aldığı telif haklarının bir kısmını 15 ABD Kodu § 3710c uyarınca çalışan mucitlerine aktarır.

Teşekkürler

Dr. David Sanchez-Martin ve Christopher B. Buck'a projenin kavramsallaştırma aşamasındaki yorumları için teşekkür ederiz. Ayrıca, ön deneylerde yardım için Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institutes, National Institute of Health'e ve hesaplamalı analizde tavsiye için Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH'ye teşekkür ederiz. Yöntemde kullanılan DNA polimerazlarının optimizasyonuna yardımcı olduğu için Bayan Anna Word'e teşekkür ederiz. Bu çalışmada NIHHPC Biowulf kümesinin (http://hpc.nih.gov) hesaplama kaynakları kullanılmıştır. Bu proje, Kanser Araştırmaları Merkezi'nin Intramural Programı, Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, NCI Direktörünün İnovasyon Ödülü (#397172) ve Ulusal Kanser Enstitüsü'nden HHSN261200800001E Sözleşme No'lu Federal fonlar tarafından desteklenmektedir. Dr. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy ve Hücresel Onkoloji Laboratuvarı'nın tüm üyelerine verimli yorumları için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x CutSmart tamponuNew England BioLabsB600410x Sindirim tamponu
200 geçirmez etanolWarner-Graham Company200 kanıtEtanol
5-Hidroksimetilsitozin (5-hmC) Monoklonal Antikor [HMC/4D9]EpigentekA-1018-100Anti-5hmC
Akridin Portakal / Propidyum İyodür LekeLogoları BiosystemsF23001Hücre sayacı
Akrilamid çözeltisi, H2O içinde %40, moleküler biyoloji içinMilliporeSigma01697-500ML%40 akrilamid çözeltisi
Hepsi Bir Arada Floresan Mikroskobu BZ-X710KeyenceBZ-X710Tarama mikroskobu
Amicon Ultra-0.5 Santrifüj Filtre ÜnitesiMilliporeSigmaUFC510024Ultrafiltrasyon kaseti
Moleküler biyolojiiçin amonyum persülfatMilliporeSigmaA3678-100GAmonyum persülfat tozu
Susuz DMFVektör laboratuvarlarıS-4001-005Susuz N,N-dimetilformamid (DMF)
Anti-RNA polimeraz II CTD tekrarı YSPTSPS (fosfo S5) antikoru [4H8]Abcamab5408Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (fosfo T1457) antikoruAbcamab60950Anti-Med1
BciVINew England BioLabsR0596LBciVI Sığır
Serum Albümin çözeltisi, H2O içinde 20 mg / mL, düşük biyolojik yük, proteaz içermeyen, moleküler biyoloji içinMilliporeSigmaB8667-5ML%20 BSA (Tablo 7)
Bst DNA Polimeraz, Büyük ParçaNew England BioLabsM0275LBst DNA polimeraz
BT10 Serisi 10 & mikro; l Bariyer UcuNEPTUNEBT10P10 düşük tutma ucu
CellCelectorOtomatik Laboratuvar ÇözümleriYokOtomatik tek hücreli toplama robotu
CellCelector 4 nl tek hücre klonlama için nanokuyu plakaları, Plaka S200-100 100K, 24 kuyu, ULAOtomatik Laboratuvar ÇözümleriCC00794 nL nanokuyu plakası
KloroformMilliporeSigmaKloroform
Corning Costar 96 Kuyulu, Hücre Kültürü ile Tedavi Edilmiş, Düz Tabanlı MikroplakaCorning3596Düz Tabanlı 96 Kuyulu Plakalar
Derin Havalandırma (ekzo-) DNA PolimerazNew England BioLabsM0259LExo- DNA polimeraz
DNA LoBind Tüpleri, 0,5 mLEppendorf301080350,5 mL DNA düşük bağlayıcı tüp
DNA Oligo, 1. rastgele primerEntegre DNA TeknolojileriN/ A, bakınız Tablo 31. rastgele primer
DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 01Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 32. rastgele primer
DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 02Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 32. rastgele primer
DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 03Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 32. rastgele primer
DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 04Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 32. rastgele primer
DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 05Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 32. rastgele primer
DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 06Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 32. rastgele primer
DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 07Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 32. rastgele primer
DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 08Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 32. rastgele primer
DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 09Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 32. rastgele primer
DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 10Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 32. rastgele primer
DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre#11Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 32. rastgele primer
DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre#12Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 32. rastgele primer
DNA Oligo, 2. sentez primeriEntegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 32. sentez primeri
DNA Oligo, Ligasyon AdaptörüEntegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 3Ligasyon Adaptörü
DNA Oligo, Ters Transkripsiyon primeriEntegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 3Ters Transkripsiyon primeri
DNaz I (RNaz içermez)New England BioLabsM0303LDNaz I (RNaz içermez, 4 U).
DNase I Reaksiyon TamponuNew England BioLabsB0303S10x DNase I tamponu (NEB)
dNTP Karışımı (her biri 10 mM)Thermo FisherR019210 mM dNTP'ler
Fetal Sığır Serumu, ABD menşeli, Isı ile inaktive edilmişMilliporeSigmaF4135-500MLFetal sığır serumu
HiScribe T7 Yüksek Verimli RNA Sentez KitiNew England BioLabsE2040SIn-vitro-transkripsiyon ana karışımı
Histon H3K27ac antikoruAktif motif39133Anti-H3K27ac
Histon H3K27me3 antikoruAktif motif39155Anti-H3K27me3
IgG tavşan serumundanMillipore SigmaI5006-10MGKontrol IgG
Demir oksit (II, III) manyetik nanotoz, 30 nm ort. parça boyutu (TEM), NHS ester işlevselleştirilmişMilliporeSigma747467-1GNHS ester işlevselleştirilmiş 30 nm demir oksit tozu
K-562Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)CCL-243hücreleri
Lineer Akrilamid (5 mg / mL)Thermo FisherAM9520Lineer Akrilamid
LUNA-FL Çift Floresan Hücre SayacıLogoları BiosystemsL20001Hücre sayacı
LUNA Hücre Sayma Slaytları, 50 SlaytLogolar BiyosistemlerL12001Hücre sayacı
Mineral yağ, BioReagent, moleküler biyoloji için, hafif yağMilliporeSigmaM5904-500MLMineral yağ
N, N, N & prime;, N & prime; -Moleküler biyoloji için tetrametiletilendiaminMilliporeSigmaT7024-100MLN, N, N & prime;, N & prime;-Tetrametiletilendiamin
NaCl (5 M), RNaz içermeyenThermo FisherAM9760G5M NaCl
NanoDrop LiteTermo Balıkçı2516  Mikrohacim spektrofotometresi
NEST 2 mL 96 Kuyulu Derin Kuyu Plakası, V AltAçtronlarN/A2 mL derin kuyu 96 oyuklu plaka
Eteksiz 96 oyuklu PCR plakasıGenesee Scientific27-40596 oyuklu PCR plakası
NuSive GTG AgaroseLonza50081Agaroz
OmniPur Akrilamid: Bis-akrilamid 19:1, %40 ÇözeltiMilliporeSigma1300-500ML%40 Akrilamid/Bis-akrilamid
OT-2 laboratuvar robotuOpentronsOT2Otomatik sıvı taşıma robotu
Paraformaldehit, EM Sınıfı, Saflaştırılmış, %20 Sulu ÇözeltiElektron Mikroskobu Bilimleri15713%20 Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4Thermo Fisher7001104410x PBS
PIPETMAN Classic P1000GILSONF123602A P1000 pipet
Protein LoBind Tüpleri, 1,5 mLEppendorf9250000901,5 mL Protein düşük bağlayıcı tüp
QIAgen Jel Ekstraksiyon kitiQiagen28706A P1000 pipet
Quant-iT PicoGreen dsDNA TestiThermo FisherP11495  dsDNA'ya özgü interkalatör boyası
Hızlı Ligasyon kitiNew England BioLabsM2200LT4 DNA ligaz (NEB)
RNaseOUT Rekombinant Ribonükleaz İnhibitörüThermo Fisher10777019RNAse inhibitörü
S-4FB Çapraz bağlayıcı (DMF-çözünür)Vektör laboratuvarlarıS-1004-105Süksinimidil 4-formilbenzoat (S-4FB)
S-HyNicVektör laboratuvarlarıS-1002-105Süksinimidil 6-hidrazinikotinat aseton hidrazon (S-HyNic)
Sodyum Asetat, 3 M, pH 5.2, Moleküler Biyoloji SınıfıMilliporeSigma567422-100ML3M Sodyum asetat (pH 5.2)
Sodyum bikarbonat, 1M tampon soln., pH 8.5Alfa AesarJ604081M sodyum bikarbonat tamponu, pH 8.5
Moleküler biyoloji için sodyum fosfat dibazikMilliporeSigmaS3264-250GMoleküler biyoloji için Na2HPO4
Sodyum fosfat monobazikMilliporeSigmaS3139-250GNaH2PO4
SuperScript IV ters transkriptazThermo Fisher18090050Ters transkriptaz
SYBR Altın Nükleik Asit Jel Lekesi (DMSO'da 10.000x Konsantre)Thermo FisherS11494için bir interkalatör boyası
DNA Ligaz Reaksiyon TamponuNew England BioLabsB0202S10x T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu
ThermoPol Reaksiyon Tampon PaketiNew England BioLabsB9004S10x TPM-T tamponu (Tris-HCl/Pottasium klorür/Magnezyum sülfat/Triton X-100)
TRIzol LS reaktifiThermo Fisher10296-028Guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu
TruSeq Nano DNA kütüphanesi hazırlık kitiIllumina20015965Bir DNA kütüphanesi hazırlama kiti (ayrıca üreticinin talimatına bakınız)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 3Antikor için amin modifiyeli bir DNA probu
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 3Antikor
için amin modifiyeli bir DNA probuUltramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 3Antikor Ultramer DNA Oligo için amin ile modifiye edilmiş bir DNA probu
, Anti-Med1_Ab#004Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 3Antikor Ultramer
DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 3Antikor için amin modifiyeli bir DNA probu
Ultramer DNA Oligo, Kontrol IgG_Ab#001Entegre DNA TeknolojileriN/A, bakınız Tablo 3Kontrol için amin modifiyeli bir DNA probu
IgG UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher155750200.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNaz İçermeyen Damıtılmış SuThermo Fisher10977023Ultra saf su
Zeba Splin Tuz Giderme Kolonları, 7K MWCO, 0.5 mLThermo Fisher89882Tuzdan arındırma sütunu
DNA T4

Kaynaklar

  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781(2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İteratif Epigenomik AnalizTek Hücre EpigenomuYakınlık LigasyonuPoliakrilamid GömmeAntikor DNA SondasıHiston ModifikasyonlarıÇoklu Yer Değiştirme AmplifikasyonuKapiler ElektroforezMultiomik Analiz
Yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.