Yöntem makalesi

Kütle Spektrometrisinden Önce Sağlam Proteom Saflaştırması için Organik Solvent Bazlı Protein Yağışı

DOI:

10.3791/63503

⸱

7 Şubat 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, kütle spektrometrisinden önce proteom numunelerinin sağlam ve hızlı geri kazanımı ve saflaştırılması için kontrollü koşullar altında çözücü bazlı protein çökeltmesini açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle spektrometresi (MS) cihazlarındaki çoklu ilerlemeler kalitatif ve kantitatif proteom analizini geliştirmiş olsa da, MS'ten önce proteinleri izole etmek, zenginleştirmek ve işlemek için daha güvenilir ön uç yaklaşımları başarılı proteom karakterizasyonu için kritik öneme sahiptir. Düşük, tutarsız protein geri kazanımı ve yüzey aktif maddeler gibi artık safsızlıklar MS analizine zararlıdır. Protein çökeltmesi genellikle diğer numune hazırlama stratejilerine kıyasla güvenilmez, zaman alıcı ve teknik olarak gerçekleştirilmesi zor olarak kabul edilir. Bu endişeler, optimal protein çökeltme protokolleri kullanılarak aşılır. Aseton çökeltmesi için, spesifik tuzların, sıcaklık kontrolünün, çözücü bileşiminin ve çökeltme süresinin kombinasyonu kritik öneme sahipken, kloroform/metanolün/su çökeltmesinin verimliliği uygun pipetleme ve şişe manipülasyonuna bağlıdır. Alternatif olarak, bu çökeltme protokolleri tek kullanımlık bir spin kartuşu içinde kolaylaştırılmış ve yarı otomatiktir. Geleneksel formatta ve tek kullanımlık, iki aşamalı bir filtreleme ve ekstraksiyon kartuşu kullanılarak solvent bazlı protein çökeltmesinin beklenen sonuçları bu çalışmada gösterilmiştir. Bu, proteomik karışımların aşağıdan yukarıya LC-MS / MS analizi ile ayrıntılı karakterizasyonunu içerir. SDS tabanlı iş akışlarının üstün performansı, kontamine olmayan proteinlere göre de gösterilmiştir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle spektrometresi ile proteom analizi, modern MS cihazlarının gelişmiş hassasiyeti, çözünürlüğü, tarama hızı ve çok yönlülüğü nedeniyle giderek daha titiz hale gelmiştir. MS ilerlemeleri, daha fazla protein tanımlama verimliliğine ve daha hassas kantitasyona katkıda bulunur 1,2,3,4,5. Geliştirilmiş MS enstrümantasyonu ile araştırmacılar, iş akışının tüm aşamalarında minimum sürede yüksek saflıkta proteinlerin kantitatif geri kazanımını sağlayabilen, buna karşılık gelen tutarlı bir ön uç numune hazırlama stratejisi talep etmektedirler 6,7,8,9,10,11 . Biyolojik bir sistemin proteom durumunu doğru bir şekilde yansıtmak için, proteinler doğal numune matrisinden verimli ve tarafsız bir şekilde izole edilmelidir. Bu amaçla, sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi denatüre edici bir yüzey aktif madde de dahil olmak üzere, etkili protein ekstraksiyonu ve çözündürme sağlar12. Bununla birlikte, SDS, elektrosprey iyonizasyonuna güçlü bir şekilde müdahale eder ve uygun şekilde elimine edilmezse ciddi MS sinyal bastırmasına neden olur13.

Sonraki proteom analizi için, proteinlerin tek kullanımlık spin kartuşları14,15,16'da bulunan moleküler ağırlık kesme filtresinin üzerinde tutulması gibi çeşitli SDS tükenme stratejileri mevcuttur. Filtre destekli numune hazırlama yöntemi (FASP), SDS'yi 10 ppm'nin altında etkili bir şekilde tükettiği ve optimal MS'yi kolaylaştırdığı için tercih edilir. Bununla birlikte, FASP ile protein geri kazanımı değişkendir ve bu da diğer tekniklerin araştırılmasına neden olmuştur. Proteini (veya yüzey aktif maddeyi) seçici olarak yakalayan kromatografik yaklaşımlar, çeşitli uygun kartuşlara veya boncuk bazlı formatlara dönüşmüştür 17,18,19,20,21. Protein saflaştırmaya yönelik bu basit ve (ideal olarak) tutarlı stratejiler göz önüne alındığında, organik çözücülerle protein çökeltmesinin klasik yaklaşımı genellikle protein izolasyonuna umut verici bir yaklaşım olarak göz ardı edilir. Solvent çökeltmesinin SDS'yi kritik seviyelerin altına başarıyla tükettiği gösterilmiş olsa da, protein geri kazanımı bu yaklaşımın uzun süredir devam eden bir endişesi olmuştur. Birden fazla grup, protein konsantrasyonunun, moleküler ağırlığın ve hidrofobikliğin bir fonksiyonu olarak kabul edilemez derecede düşük yağış verimi ile bir protein geri kazanım önyargısı gözlemlemiştir22,23. Literatürde bildirilen yağış protokollerinin çeşitliliği nedeniyle standartlaştırılmış yağış koşulları geliştirilmiştir. 2013 yılında, Crowell ve ark. ilk olarak% 80 aseton24'teki proteinlerin çökeltme verimliliğine iyonik mukavemetin bağımlılığını bildirmiştir. İncelenen tüm proteinler için, 30 mM'ye kadar sodyum klorür ilavesinin, verimi en üst düzeye çıkarmak için gerekli olduğu gösterilmiştir (% 100'e kadar geri kazanım). Daha yakın zamanlarda, Nickerson ve ark., aseton yağışı sırasında daha yüksek iyonik mukavemetin (100 mM'ye kadar) yüksek sıcaklık (20 ° C) ile kombinasyonunun 2-5 dakika25'te neredeyse kantitatif iyileşme sağladığını göstermiştir. Düşük moleküler ağırlıklı (LMW) proteinlerin geri kazanımında hafif bir düşüş gözlendi. Bu nedenle, Baghalabadi ve ark. tarafından hazırlanan bir sonraki rapor, spesifik tuzları, özellikle çinko sülfatı, daha yüksek bir organik çözücü (% 97 aseton) ile birleştirerek LMW proteinlerinin ve peptitlerinin (≤5 kDa) başarılı bir şekilde geri kazanıldığını göstermiştir26.

Yağış protokolünün rafine edilmesi, MS bazlı proteomikler için daha güvenilir bir protein saflaştırma stratejisi sunarken, geleneksel çökeltmenin başarısı büyük ölçüde kullanıcı tekniğine dayanmaktadır. Bu çalışmanın birincil amacı, protein peletinin kirletici süpernatandan izolasyonunu kolaylaştıran sağlam bir çökeltme stratejisi sunmaktır. Gözenekli PTFE membran filtresi27 üzerinde agrega proteini izole ederek pipetlemeyi ortadan kaldırmak için tek kullanımlık bir filtreleme kartuşu geliştirilmiştir. Süpernatanttaki MS müdahale eden bileşenler, kısa, düşük hızlı bir santrifüjleme adımında etkili bir şekilde çıkarılır. Tek kullanımlık filtre kartuşu ayrıca, kütle spektrometrisinden önce, çözündürme ve isteğe bağlı protein sindiriminin ardından numunenin temizlenmesini kolaylaştıran değiştirilebilir bir SPE kartuşu sunar.

Modifiye aseton ve kloroform/metanol/su28 protokolleri de dahil olmak üzere bir dizi önerilen proteom çökeltme iş akışı, geleneksel (şişe bazlı) ve tek kullanımlık iki durumlu filtreleme ve ekstraksiyon kartuşunda yarı otomatik bir formatta sunulmaktadır. Elde edilen protein geri kazanımları ve SDS tükenme verimlilikleri, her protokolden beklenen sonucu göstermek için aşağıdan yukarıya LC-MS / MS proteom kapsamı ile birlikte vurgulanır. Her yaklaşımla ilişkili pratik faydalar ve dezavantajlar tartışılmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Malzeme hususları ve numune ön hazırlığı

  1. Sadece yüksek saflıkta çözücüler (aseton, kloroform, metanol) (>% 99,5) ve aşırı nem içermeyen kimyasallar kullanın.
  2. Suda sodyum klorür ve çinko sülfat çözeltileri (1 M) hazırlayın.
    NOT: Tuz çözeltileri, kirletici madde veya mikrobiyal büyüme içermedikleri sürece oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir.
  3. Yağışı indüklemek için gerekli numune hacmini ve çözücüleri korumak için yeterli olan en küçük polipropilen (PP) mikrosantrifüj şişesini kullanın.
  4. Çökeltilecek numunedeki SDS konsantrasyonunun %2'den (w/v) fazla olmadığından emin olun. SDS daha yüksekse, numuneyi suyla seyreltin.
  5. Optimum çökeltme verimliliği için 0,01 ila 10 g/L arasında bir protein konsantrasyonu sağlayın.
    NOT: Yağış için en uygun kütle 1-100 μg protein arasında değişmektedir.
  6. Kullanmadan önce tüm çözücülerin ve çözeltilerin partikül madde içermediğinden emin olun. Çözünmemiş partikülleri gidermek için bir filtreleme (<0,5 μm) veya santrifüjleme adımı (oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 10.000 x g) gerçekleştirin.
  7. Disülfit bağının azaltılması ve alkilasyon gerekiyorsa, protein çökelmesinden önce bu adımları uygulayın. Aşırı indirgeyici ve alkilleyici reaktifler çökeltme işlemi ile uzaklaştırılacaktır.
  8. Protokollerden birini seçip uygulayarak proteinleri çökeltin (adım 2, 3, 4 veya 5).

2. Aseton ile hızlı (şişe bazlı) protein çökeltmesi

  1. Pipet 90 μL (partikülsüz) protein veya proteom çözeltisi PP mikrosantrifüj tüpüne dönüşür. Ardından, 10 μL 1 M sulu NaCl ekleyin.
    NOT: Proteom ekstraktının iyonik mukavemeti zaten 100 mM'yi aşarsa, ek tuz gerekmez.
  2. Pipet 400 μL aseton numunenin içine alınır. Şişeyi kapatın ve çözücüleri birleştirmek için şişeye hafifçe dokunun. Güçlü karıştırma gerekli değildir.
    NOT: Protein, tuz ve aseton hacmi, her birinin göreceli oranı korunduğu sürece arttırılabilir.
  3. Şişenin oda sıcaklığında, rahatsız edilmeden, en az 2 dakika boyunca inkübe edilmesine izin verin.
    NOT: Düşük sıcaklıktakiler de dahil olmak üzere daha uzun inkübasyonlar (örneğin, geleneksel aseton çökeltmesi, dondurucuda gece boyunca çökeltme kullanır), genellikle toplam protein geri kazanımını iyileştirmeyen daha büyük (görünür) agrega protein partiküllerinin (Şekil 1A) oluşumuna neden olabilir.
  4. Kuluçkayı takiben, numuneleri şişenin oryantasyonunu not ederek bir santrifüje yerleştirin. Oda sıcaklığında 10.000 x g veya daha yüksek bir sıcaklıkta en az 2 dakika boyunca döndürün.
  5. Şişenin kapağını açın ve şişeyi yavaşça bir atık kabına çevirerek süpernatantı yavaşça boşaltın. Şişeden artık çözücü çekmek için ters çevrilmiş şişeyi bir kağıt havluya dokunun.
    DİKKAT: Atık çözücüler uygun protokollere göre tutulmalı ve atılmalıdır.
  6. SDS içeren numuneler için, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek 400 μL taze aseton dağıtın.
    NOT: Adım 2.6 isteğe bağlıdır.
    1. Numuneyi derhal santrifüj edin (oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 10.000 x g veya daha yüksek), şişeyi rotora ilk sıkma ile aynı yönde yerleştirin. Yıkama çözücüsünü adım 2.5'te açıklandığı gibi boşaltın.
  7. Numunenin kapak açıkken tamamen kurumasını bekleyin (~1 dakika). Şişeyi özetleyin ve pelet çözünürlüğü ile devam edin (adım 6).

3. Düşük moleküler ağırlıklı (LMW) peptitlerin çökelmesi (ZnSO4 + aseton)

  1. 2 mL PP şişesine 54 μL proteom ekstraktı dağıtın ve ardından 6 μL 1 M ZnSO4 ekleyin.
    NOT: LMW peptitlerinin (≤5 kDa) optimum geri kazanımı, hacimce son %97'ye aseton eklenerek elde edilir. 2 mL'lik bir PP şişesi varsayarak, maksimum ilk numune hacmi 54 μL'dir.
  2. 1940 μL asetonu, hacimce son %97'ye ekleyin. Karıştırmak için hafifçe döndürün ve tezgahın üstünde en az 2 dakika boyunca rahatsız edilmeden durun.
  3. Santrifüj (oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 10.000 x g) ve şişeyi ters çevirerek ve ardından şişeyi bir kağıt havluya dokundurarak süpernatantı çıkarın.
  4. SDS içeren numuneler için, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek 400 μL taze aseton dağıtın.
    NOT: Adım 3.4 isteğe bağlıdır.
    1. Numuneyi adım 3.3'e göre derhal santrifüj edin ve şişeyi rotora ilk sıkma ile aynı yönde yerleştirin. Yıkama çözücüsünü adım 3.3'te açıklandığı gibi boşaltın.
  5. Elde edilen kuru peleti kısa vorteks veya sonikasyon (~ 5 dakika) ile sulu bir çözücü içinde yeniden çözündürün.

4. Kloroform / metanol / su (CMW) ile protein çökeltme

  1. 100 μL protein veya proteom çözeltisini bir PP şişesine dağıtın. 400 μL metanol ekleyin, ardından 100 μL kloroform ekleyin. Şişeyi ve girdabı karıştırmak için kısaca kapatın.
    NOT: CMW çökeltme için, dar tabanlı 1,5 mL şişeler tercih edilir (Şekil 2A).
    DİKKAT: Kloroform çözücü uygun bir havalandırma başlığında kullanılmalıdır. Kloroformla temas eden tüm çözücüler, bertaraf edildiğinde halojenli atık olarak muamele görmelidir.
  2. 300 μL suyu doğrudan şişenin merkezine hızlı bir şekilde dağıtın. Şişeyi kapatın. Numunenin tezgahta 1 dakika boyunca rahatsız edilmeden oturmasına izin verin.
    NOT: Çözüm hemen bulutlu beyaz görünecektir. Su ilavesini takiben şişeyi karıştırmaktan kaçının.
  3. PP şişesini bir santrifüje yerleştirin ve en az 5 dakika (oda sıcaklığında 10.000 x g veya daha yüksek) döndürün.
    NOT: Santrifüj edildikten sonra, iki görünür çözücü katmanı oluşacaktır (üst katman = metanol / su; alt = kloroform). Solvent arayüzünde katı bir protein peleti oluşur (Şekil 2A).
  4. Büyük (1 mL) bir mikropipet ucu kullanarak ve şişeyi ~45°'de tutarak, çözücünün ~700 μL'sini üst tabakadan eşit bir oranda çıkarın.
  5. Üst çözücü tabakasını ~45° eğimli şişeden çıkarmaya devam etmek için daha küçük (200 μL) bir mikropipet ucu kullanın. Pipet, üst çözücü tabakası şişede bir boncuk oluşturana kadar sürekli bir hareketle.
  6. Çözücüyü şişenin kenarından aşağı dağıtarak, peleti rahatsız etmeden numune şişesine 400 μL taze metanol ekleyin.
  7. Şişeyi kapatın. Solventleri bir araya getirmek için şişeyi hafifçe sallayarak çözücü katmanlarını birleştirin.
    NOT: Peletin bozulmasını önlemek önemlidir. Şişeyi vortekse etmeyin.
  8. Şişenin rotordaki oryantasyonuna dikkat ederek, en az 10 dakika (oda sıcaklığında 10.000 x g) santrifüj yapın. Protein peleti şişenin dibine yapışır (Şekil 2B).
  9. Şişeyi 45°'de, pelet aşağı bakacak şekilde devirin. Pipet ucunu şişenin üst kenarı boyunca yerleştirin ve süpernatantı 1 mL'lik bir mikropipet ucu ile yavaş ama sürekli bir hızda çıkarın. Şişede ~ 20 μL çözücü tutun.
  10. SDS içeren numuneler için protein peletini 400 μL taze metanolü yavaşça dağıtarak yıkayın. Şişeyi vortekse etmeyin.
    1. Doğrudan santrifüjleme ile devam edin (sıcaklıkta 2 dakika boyunca 10.000 x g), şişeyi rotora ilk spinle aynı yönde yerleştirin.
  11. Çözücüyü adım 4.9'a göre çıkarın. Artık çözücü buharlaşana kadar numunenin bir duman başlığı içinde hava ile kurumasına izin verin.
  12. 6. adımda önerilen çözünürlük prosedürlerine başvurun.

5. Tek kullanımlık bir filtrasyon kartuşu kullanarak protein çökeltme

NOT: Adım 2-5'te açıklanan her çözücü bazlı çökeltme protokolü, iki aşamalı bir filtreleme ve ekstraksiyon kartuşunda gerçekleştirilebilir (bkz.

  1. Fiş üst filtreleme kartuşuna takılıyken (Şekil 3A), çıkarılan proteom, tuz ve çözücünün istenen hacmini aşağıdaki üç seçenekten birinde belirtildiği gibi dağıtın.
    1. (Seçenek 1) Aseton ile protein çökeltmesi için, 90 μL protein veya proteom çözeltisini, 10 μL 1 M sulu NaCl ve 400 μL asetonu birleştirin. Tezgahın üstünde en az 2 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: Konsantre protein örnekleri (1 g / L) için görünür bir çökelti gelişecektir (Şekil 3B).
    2. (Seçenek 2) LMW peptid çökeltmesi için, numunenin 15 μL'sini, 1.5 μL'lik 1 M ZnSO4'ü ve 485 μL asetonunu birleştirin. Tezgahın üstünde en az 2 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: Sulu numunedeki 90 mM'lik bir tuz konsantrasyonu, adım 3'te önerilen 100 mM'ye göre geri kazanımı etkilemeyecektir.
    3. (Seçenek 3) CMW çökeltmesi için 50 μL proteom ekstresi, 200 μL metanol ve 50 μL kloroform ekleyin. Şişeyi kapatın ve birleştirmek için kısaca vorteks.
      1. 150 μL suyu doğrudan şişenin merkezine hızlı bir şekilde dağıtın. Tezgahın üstünde 1 dakika kuluçkaya yatırın.
  2. Oda sıcaklığında 2.500 x g'da 2 dakika boyunca santrifüj, fiş hala filtrasyon kartuşuna takılıyken.
  3. Kartuşu ters çevirin ve ardından fişi kartuş tabanından söküp çıkarın.
  4. Filtrasyon kartuşunu temiz bir şişeye yerleştirin ve santrifüje geri dönün. Oda sıcaklığında 500 x g'da 3 dakika döndürün. Akış çözücüsünü alt şişeden atın.
    NOT: Üst filtrasyon kartuşunda herhangi bir çözücü kalırsa, santrifüje geri dönün ve ek bir sıkma işlemi gerçekleştirin.
  5. Filtrasyon kartuşuna 400 μL aseton ekleyerek protein peletini yıkayın (CMW çökeltmesi için, adım 5.1.3, 400 μL metanol ekleyin).
  6. Oda sıcaklığında 500 x g'da 3 dakika boyunca veya üst kartuşta çözücü kalmayana kadar santrifüj yapın.
  7. Yağış peletini adım 6'da açıklandığı gibi yeniden çözündürün.

6. Protein peletinin çözündürülmesi

  1. Aşağıda açıklanan çözünürlük protokollerinden hemen önce 2-5 μL izopropanolü doğrudan membrana dağıtarak filtrasyon kartuşunun tabanındaki membranı ıslatın.
  2. Aşağıdaki çözümleme yöntemlerinden birini izleyin.
    1. (Seçenek 1) Filtreleme kartuşuna %≥2 SDS içeren en az 20 μL sulu tampon ekleyin. Cap ve vorteksi kuvvetlice (~1 dk.) Alternatif olarak, protein peletini dağıtmak için >10 dakika) sonikat yapın.
      1. Numuneyi 95 °C'de 5 dakika ısıtın). Isıtmadan sonra karıştırma adımını tekrarlayın.
        NOT: Laemmli jel yükleme tamponu, protein peletini yeniden çözündürebilir. Bununla birlikte, SDS içeren örnekler tripsin sindirimi ve ters fazlı LC ve MS ile uyumlu değildir.
    2. (Seçenek 2) Suda% 80 (v / v) formik asit çözeltisi hazırlayın. Asit çözeltisini (-20 ° C) ve çökeltilmiş protein içeren filtrasyon kartuşunu önceden soğutun.
      1. Kartuşa 50 μL soğuk formik asit dağıtın; 30 s için kapak ve vorteks. 10 dakika boyunca dondurucuya (-20 °C) geri dönün.
      2. Kartuşu 30 saniye boyunca tekrar vorteksleyin. Ardından, soğutma ve karıştırma döngüsünü bir kez daha tekrarlayın (10 dakika, -20 °C, 30 s girdap).
      3. Son 500 μL'ye su ekleyerek formik asidi% 8'e seyreltin.
        NOT: Soğuk formik asit protokolü sonraki tripsin sindirimi ile uyumlu değildir, ancak LC-MS ile uyumludur.
    3. (Seçenek 3) Filtrasyon kartuşuna suda 50 μL taze hazırlanmış 8 M üre ekleyin. 30 dakika boyunca sonikate.
      1. Kartuşun tezgah üstünde 1 saat boyunca (gece boyunca inkübe edilmesine izin verin).
      2. 8 M üreyi su veya uygun tamponla en az 5 kat seyreltin.
        NOT: Seyreltildikten sonra, üre çözünürlük protokolü, sonraki tripsin sindirimi ve LC-MS ile uyumludur.

7. Protein sindirimi

  1. Aşağıdan yukarıya MS analizi için, aşağıda belirtilen iki yöntemden birini kullanarak yeniden çözünür proteinleri enzimatik sindirime tabi tutun.
    1. (Seçenek 1) Formik asit çözünürlüğü için, adım 6.2.2.1'de %80 formik asidin başlangıç hacmini 25 μL'ye düşürün. Adım 6.2.2.3'te, formik asidi% 5'e (v / v) seyreltmek için 375 μL su kullanın.
    2. Pepsini kartuşa yaklaşık 50:1 protein-enzim oranında dağıtın. Filtrasyon kartuşuna takılı bir fişle, numuneyi gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  2. (Seçenek 2) Ürede çözündürme için, adım 6.2.3.2'de 100 mM Tris veya amonyum bikarbonat dahil edilerek 8 ila 8.3 arasında bir pH sağlayın.
    1. Yaklaşık 50: 1'lik bir protein-enzim kütle oranında tripsin ekleyin. Karbuğa takılı bir fiş ile, numuneyi gece boyunca 37 ° C'de ılık su banyosunda inkübe edin.
    2. Çözeltiyi% 10 TFA ile sonuncu% 1'e asitleştirerek sindirimi sonlandırın.
  3. Pepsin veya tripsin sindirilmiş proteini, fişi filtrenin tabanından çıkararak ve temiz bir şişede (2 dakika, 5000 x g, oda sıcaklığı) bulunan kartuşu santrifüj ederek geri kazanın.

8. SPE temizliği

NOT: Çürütme veya çözücü değişimini takiben ilave numune tuzdan arındırma işlemi için, numune açıklandığı gibi ters fazlı temizlemeye tabi tutulabilir.

  1. Bir SPE kartuşunu (bakınız Malzeme Tablosu) 300 μL metanol (2 dk, 400 x g) ve ardından 300 μL %5 asetonitril/%0,1 TFA (2 dk, 400 x g) geçirerek astarlayın.
  2. Astarlanmış SPE kartuşunu, yeniden çözünür veya sindirilmiş protein içeren filtreleme kartuşunun tabanına bağlayın.
  3. Proteini SPE kartuşundan döndürün (oda sıcaklığında 5 dakika, 800 x g). Çözücü üst kartuşta kalırsa, kartuşu santrifüje geri koyun ve sıkma işlemini tekrarlayın.
    NOT: Numunenin SPE kartuşundan ikinci kez geçirilmesi kurtarmayı iyileştirebilir.
  4. Karbuğa 300 μL %5 asetonitril/%0,1 TFA su ekleyin. Yıkamak için SPE kartuşundan geçirin (2 dk, 2000 x g). Akış akışını atın.
  5. LMW proteinleri veya sindirilmiş peptitler için, numuneyi 300 μL% 50 asetonitril / % 0.1 TFA (5 dakika, 2500 x g) akıtarak süzün.
  6. Bozulmamış proteinler için, 300 μL% 75 asetonitril / % 0.1 TFA kullanarak ek bir elüsyon adımı ile adım 8.5'i izleyin. Elde edilen iki özü birleştirin.
    NOT: Adım 8.6 isteğe bağlıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 4 , proteinlerin aseton kullanılarak tek kullanımlık bir filtre kartuşunda şişe bazlı veya kartuş tarafından kolaylaştırılmış çökeltilmesini takiben beklenen SDS tükenmesini özetlemektedir. Aseton cinsinden geleneksel gece inkübasyonu (-20 ° C), oda sıcaklığında (adım 2) hızlı aseton çökeltme protokolü ve CMW çökeltmesi (adım 4) ile karşılaştırılır. Kalıntı SDS, metilen mavisi aktif maddeler (MBAS) testi29 ile ölçülmüştür. Kısaca, 100 μL numune 100 μL MBAS reakt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optimal MS karakterizasyonu, artık SDS 10 ppm'nin altında tükendiğinde elde edilir. FASP ve boncuk üzerinde sindirim gibi alternatif yaklaşımlar, değişken geri kazanım31,32,33 ile kantitatif SDS tükenmesi sunarken, yağışın birincil amacı saflığı ve verimi aynı anda en üst düzeye çıkarmaktır. Bu, protein peletini rahatsız etmeden süpernatantın (SDS içeren) etkili bir şekilde izole edilmesine bağlıdır. Şişe bazlı çökeltme ile, süp...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doucette laboratuvarı, bu çalışmada kullanılan ProTrap XG'yi tasarladı ve patentini aldı. AAD ayrıca numune hazırlama kartuşunu ticarileştiren Proteoform Scientific'in kurucu ortağıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, MS verilerinin elde edilmesine katkılarından dolayı Hasta Çocuklar Hastanesi'ndeki (Toronto, Kanada) Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Kanada) ve SPARC BioCentre'a (Moleküler Analiz) teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AsetonFisher ScientificAC177170010≤ 0,002 % aldehit
AsetonitrilFisher ScientificA998-4HPLC derecesi
Amonyum BikarbonatMillipore SigmaA6141-1KGkatı
Beta merkaptoetanolMillipore SigmaM3148-25MLMoleküler biyoloji derecesi
Bromofenol mavisiMillipore SigmaB8026-5GBromofenol mavi sodyum tuzu
KloroformFisher ScientificC298-400Kloroform
Formik AsitHoneywell56302LC-MS için eluent ekleme
Fusion Lumos Kütle SpektrometresiThermoFisher ScientificStandart protein karışımının analizi için
GliserolMillipore Sigma356352-1L-MMoleküler biyoloji için ise %99 >
İzopropanolFisher ScientificA4641HPLC derecesi
MetanolFisher ScientificA452SK-4HPLC derecesi
MikrosantrifüjFisher Scientific75-400-10221.000 XG'ye kadar
Mikrosantrifüj Tüpü (1.5 mL)Fisher Scientific05-408-130Konik taban
Mikrosantrifüj Tüpü                (2 mL)Fisher Scientific02-681-321yuvarlak taban
Mikropipet İpuçları                (0.1-10 μ L)Fisher Scientific21-197-28Evrensel pipet ucu, steril olmayan
Mikropipet İpuçları                (1-200 μ L)Fisher Scientific07-200-302Evrensel pipet ucu, steril olmayan
Mikropipet İpuçları              (200-1000 μ L)Fisher Scientific07-200-303Evrensel pipet ucu, steril olmayan
MikropipetlerFisher Scientific13-710-903Micropipet Trio paketi
PepsinMillipore SigmaP0525000Liyofilize toz,                    >3200 birim/ mg
ProTrap XGProteoform BilimselPXG-0002Kutu başına 50 tam birim
Sodyum KlorürMillipore SigmaS9888-1KGACS reaktifi, >99 %
Sodyum Dodesil SülfatThermoFisher Scientific28312Toz katı
timsTOF Pro Kütle SpektrometresiBrukerKaraciğer proteom ekstraktının analizi için
Trifluoroasetik AsitThermoFisher ScientificL06374. AP99%
TrisFisher ScientificBP152-500Moleküler biyoloji derecesi
TripsinMillipore Sigma9002-07-7Sığır pankreasından, TPCK ile tedavi edilen
UreaBio-Rad1610731katı
Su (deionize)Sartorius Arium Mini Su Arıtma Sistemi76307-662Tip 1 ultrasaf (18.2 MΩ cm)
Çinko SülfatMillipore Sigma307491-100Gkatı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318(2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856(2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524(2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051(2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757(2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768(1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983(2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Organik Solvent kt rmesiAseton kt rmesiKloroform Metanol kt rmesiSpin KartuSDS Uzakla t rmaBottom Up ProteomikProtein Geri Kazan m

İlgili makaleler