Karaciğer Dokusunun 3D Hücre Kültürü Modelinde Histone Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Küresel Düzeyde Nicelleştirilmesi

19. yüzyılın sonlarından bu yana, hücre kültürü sistemleri, insan vücudunun dışındaki hücrelerin büyümesini ve gelişmesini incelemek için bir model olarak kullanılmıştır ^1,2. Kullanımları, dokuların ve organların hem sağlıklı hem de hastalıklı bağlamlarda nasıl çalıştığını incelemek için genişletilmiştir ^1,3. Süspansiyon hücreleri (örneğin, kan hücreleri) Petri kaplarında veya şişelerinde sorunsuz ve birbirinin yerine büyür, çünkü in vivo üç boyutlu (3B) yapılarda bir araya gelmezler. Katı organlardan türetilen hücreler iki boyutlu (2B) veya 3B kültür sistemlerinde büyüyebilir. 2D kültürde, hücreler düz bir yüzeye yapışan tek katmanlı bir tabakada yetiştirilir ^2,4. 2D hücre kültürü sistemleri, üstel büyüme ve hızlı bir iki katına çıkma süresi, tipik olarak 24 saat ila birkaç gün⁵ ile karakterize edilir. 3B sistemlerdeki hücreler, doku benzeri konglomeraları daha yakından modelleyen karmaşık hücre-hücre etkileşimleri oluşturmak için büyürler ve iki katına çıkma sürelerinin 1 aya veya daha uzun bir süreye ulaşabileceği dinamik bir dengeye ulaşma yetenekleri ile karakterize edilirler⁵.

Bu yazıda, azaltılmış yerçekimini simüle eden dönen hücre kültürü sistemlerinde 3D sferoidleri büyütmek için yenilikçi bir metodoloji^{sunulmaktadır 6}. Bu, NASA tarafından 1990'larda^tanıtılan bir hücre kültürü sisteminin basitleştirilmiş bir türevidir 7. Bu yaklaşım, eğirme şişeleri gibi mevcut yöntemlerde ortaya çıkan kesme kuvvetlerini en aza indirir ve küresel tekrarlanabilirliği^{arttırır 6}. Ek olarak, dönen biyoreaktör aktif besin difüzyonunu artırarak medya değişiminin pratik olmadığı asılı damla hücre kültürü gibi sistemlerde meydana gelen nekrotik oluşumu en aza indirir⁶. Bu şekilde, hücreler çoğunlukla bozulmadan büyür ve dokuda büyüyen hücrelerle ilişkili yapısal ve fizyolojik özelliklerin oluşmasına izin verir. Bu şekilde kültürlenen C3A hepatositleri (HepG2 / C3A) sadece ultrastrüktürel organellere sahip olmakla kalmadı, aynı zamanda in vivo^1,2 olarak gözlemlenen seviyelerle karşılaştırılabilir miktarda ATP, adenilat kinaz^, üre ve kolesterol üretti. Ek olarak, 2D ve .3D hücre kültürü sistemlerinde yetiştirilen hücreler farklı gen ekspresyon kalıpları sergiler⁸. 3D sferoidler olarak yetiştirilen C3A hepatositlerinin gen ekspresyon analizi, bu hücrelerin çok çeşitli karaciğere özgü proteinleri ve karaciğer fonksiyonunu düzenleyen anahtar yollarda yer alan genleri ifade ettiğini göstermiştir⁸. Önceki yayınlar, 2D kültürde üstel olarak büyüyen hücrelerin proteomları ile 3D sferoid kültürlerde dinamik dengedeki hücreler arasındaki farkları göstermiştir⁵. Bu farklılıklar, hücre^5'in yapısını, işlevini ve fizyolojisini etkileyen hücresel metabolizmayı içerir. 2D kültürde yetiştirilen hücrelerin proteomu hücre replikasyonunda yer alan proteinlerde daha zenginleştirilirken, 3D sferoidlerin proteomu karaciğer işlevselliğinde daha zenginleştirilmiştir⁵.

3D sferoidler olarak yetiştirilen hücrelerin daha yavaş replikasyon hızı, kromatin durumu ve modifikasyonları (örneğin histon kırpma⁹) ile ilişkili spesifik fenomenleri daha doğru bir şekilde modeller. Histon kırpma, histon N-terminal kuyruğunun bir kısmının proteolitik bölünmesine neden olan geri dönüşümsüz bir histon post-translasyonel modifikasyondur (PTM). Biyolojik işlevi hala tartışılırken^10,11,12,13, birincil hücrelerdeki ve karaciğer dokusundaki varlığının, sferoidler olarak yetiştirilen ^HepG2 / ^C3A hücreleri tarafından modellendiği^, ancak düz hücreler olarak modellenmediği açıktır⁹. Bu kritiktir, çünkü kromatin durumu ve modifikasyonları çoğunlukla genlere erişilebilirliği ve dolayısıyla ekspresyonlarını modüle ederek DNA okumasını düzenler¹⁴. Histon PTM'leri ya histonların monte edildiği nükleozomların net yükünü etkileyerek ya da dolaylı olarak kromatin yazarlarını, okuyucularını ve silgilerini işe alarak kromatin durumunu doğrudan etkiler¹⁴. Bugüne kadar yüzlerce histon PTM¹⁵ tanımlanmıştır ve kromatinin hücre tarafından DNA^16'yı yorumlamak için kullanılan bir "histon kodu" barındırdığı hipotezini güçlendirmiştir. Bununla birlikte, sayısız PTM kombinasyonunun tanımlanması¹⁵ ve histon PTM'lerin kombinasyonlarının sıklıkla izolasyonda bulunan PTM'lerden farklı biyolojik işlevlere sahip olduğunun keşfi (örneğin Fischle, et ^al.17), "histon kodunun" şifresini çözmek için daha fazla çalışmanın gerekli olduğunu vurgulamaktadır.

Şu anda, histon PTM analizi, antikorları (örneğin, batı lekeleri, immünofloresan veya kromatin immünopresipitasyonunu takiben dizileme [ChIP-seq]) veya kütle spektrometrisi (MS) kullanan tekniklere dayanmaktadır. Antikor bazlı teknikler yüksek duyarlılığa sahiptir ve histon izlerinin genom çapında lokalizasyonu hakkında ayrıntılı bilgi sağlayabilir, ancak kombinasyonlarda bulunan nadir PTM'lerin veya PTM'lerin incelenmesinde sıklıkla sınırlıdır^18,19,20. MS, tek ve birlikte var olan protein modifikasyonlarının, özellikle histon proteinlerinin ^18,19,20 yüksek verimli ve tarafsız tanımlanması ve nicelleştirilmesi için daha uygundur. Bu nedenlerden dolayı, bu ve diğer birkaç laboratuvar, MS boru hattını histon peptitlerinin (aşağıdan yukarıya MS), bozulmamış histon kuyruklarının (orta-aşağı MS) ve tam uzunlukta histon proteinlerinin (yukarıdan aşağıya MS) analizi için optimize etmiştir ^21,22,23.

Aşağıda, HepG2 / C3A sferoidlerini büyütmek ve bunları nano-sıvı kromatografisi yoluyla histon peptid analizine (aşağıdan yukarıya MS) hazırlamak için bir iş akışı, çevrimiçi olarak tandem kütle spektrometresi (NLC-MS / MS) ile birleştirilmiştir. Bir 2D hücre kültürü yetiştirildi ve hücreler toplandı ve sferoidler oluşturmaya başlayacakları bir biyoreaktöre aktarıldı (Şekil 1). Kültürde 18 gün sonra, sferoidler, histon asetilasyon ve süksinilasyonun göreceli bolluğunu arttırmak için sodyum bütirat veya sodyum süksinat ile muamele edildi. Özellikle, 3D kültürler, düz kültür eşdeğerlerinin yanı sıra genotoksik bileşiklerle de tedavi edilebilir; Aslında, son yayınlar, 3D kültürdeki hücrelerin toksikoloji yanıtının, birincil dokulara 2D düz kültür^{24,25'tekilerden} daha benzer olduğunu vurgulamaktadır. Hücreler daha sonra belirtilen zaman noktalarında toplandı ve nükleer izolasyon yapıldı. Daha sonra, ilk olarak Garcia ve ^ark.26 tarafından geliştirilen bir protokole göre, tripsin sindiriminden önce ve sonra propiyonik anhidrit ile histonlar çıkarıldı ve türetildi. Bu prosedür, ters faz kromatografisi (C₁₈) ile çevrimiçi ayırma ve MS ile tespit için uygun boyutta peptitler üretir. Son olarak, histon peptitleri tanımlandı ve ölçüldü ve üretilen veriler daha eksiksiz bir biyolojik yorumlama için çeşitli şekillerde temsil edildi.

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

1. Hücre büyüme ortamı (HepG2 / C3A hücreleri için): Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (DMEM, 4.5 g / L glikoz içeren DMEM) fetal sığır serumu (FBS) (% 10 v / v), L-glutamin takviyesi (% 1 v / v) ve penisilin / streptomisin (% 0.5 v / v) ekleyin. Büyüme ortamı maksimum 2 hafta boyunca 4 ° C'de saklanır.
2. 200 mM sodyum bütirat (NaBut) çözeltisi: 10 mL hazırlamak için, 10 mL ddH 2 O'da 220.18 mg NaBut'u yeniden askıya alın_-20° C'de 1 mL alikot saklayın. Hücre işleminden önce, çözeltiyi 0,45 mm'lik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin ve 20 mM'lik bir çalışma konsantrasyonu için filtrelenmiş çözeltinin 1 mL'sini 9 mL hücre büyüme ortamına ekleyin.
3. 100 mM sodyum süksinat (NaSuc) çözeltisi: 10 mL hazırlamak için, 10 mL ddH 2 O. -₂₀°C'de 1 mL aliquots saklayın. Hücre işleminden önce, çözeltiyi 0,45 mm'lik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin ve 10 mM'lik bir çalışma konsantrasyonu için filtrelenmiş çözeltinin 1 mL'sini 9 mL hücre büyüme ortamına ekleyin.
4. Soğuk 0,2 M H₂S04: 1 L hazırlamak için, 990 mL HPLC sınıfı suya 10 mL konsantre_H2S04 ekleyin. 4 °C'de saklayın.
5. Soğuk aseton +% 0.1 hidroklorik asit (HCl): Asetona konsantre HCl (% 0.1 v / v) ekleyin. 4 °C'de saklayın.
6. 100 mM NH 4 HCO3 çözeltisi, pH 8.0: 1 L hazırlamak için, 1 L HPLC sınıfı suda 7.91 g NH₄HCO_3'ü yeniden askıya alın. 50 mL aliquots -20 °C'de saklayın.
7. % 0.1 Trifloroasetik asit (TFA) çözeltisi: HPLC sınıfı suya konsantre TFA (% 0.1 v / v) ekleyin. 4 °C'de saklayın.
8. % 60 asetonitril ve% 0.1 TFA çözeltisi: HPLC sınıfı suya HPLC sınıfı asetonitril (% 60 v / v) ekleyin. Ardından, bu çözeltiye konsantre TFA (% 0,1 v / v) ekleyin. 4 °C'de saklayın.
9. % 2 HPLC sınıfı asetonitril +% 0.1 formik asit: HPLC sınıfı suya HPLC sınıfı asetonitril (% 2 v / v) ekleyin. Daha sonra, bu çözeltiye konsantre formik asit (% 0.1 v / v) ekleyin.
10. %80 HPLC sınıfı asetonitril + %0,1 formik asit: HPLC sınıfı suya HPLC sınıfı asetonitril (%80 v/v) ekleyin. Daha sonra, bu çözeltiye konsantre formik asit (% 0.1 v / v) ekleyin.

2. 3D kültür sisteminin hazırlanması

NOT: Birincil veya ölümsüzleştirilmiş farklı hücreler farklı kültür özelliklerine sahiptir, bu nedenle sferoidlerin oluşumu hücre tipleri arasında farklılık gösterebilir. Bu protokol, biyoreaktörler ve yenilikçi bir 3D hücre kültürü sistemi kullanılarak HepG2 / C3A sferoid oluşumu için kurulmuştur.

1. Standart büyüme ortamını kullanarak, hücreleri% 80 birleşene kadar tek katmanlı olarak büyütün.
2. HBSS (75^cm2 şişe için 5 mL) ile hücreleri yıkayın ve HBSS'de seyreltilmiş 5 mL% 0.05 tripsin-EDTA içeren hücreleri% 5 CO 2 ile 37 ^oC'de 5 dakika boyunca inkübe edin (1:₂ seyreltme).
3. Mikroskop altında hücre ayrılmasını kontrol edin ve 3 mL fetal sığır serumu (FBS) veya büyüme ortamı (% 5-10 FBS içeren) ekleyerek tripsini nötralize edin.
4. Hücre sayısını sayın ve maksimum 1,5 mL hacimde 1 x 10⁶ hücre elde etmek için hücre süspansiyonunu seyreltin.
5. Ultra düşük ataşmanlı 24 delikli yuvarlak alt plakayı, kuyuları 0,5 mL büyüme ortamı ile yıkayarak dengeleyin. Hava kabarcıklarını kuyunun yüzeyinden çıkarmak için plakayı 3.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
6. Hücre süspansiyonunu plakaya aktarın ve 120 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
7. Plakayı 37 ^oC'de 24 saat boyunca küresel oluşum için% 5 CO₂ ile inkübe edin. Bu arada, nem odasını 25 mL steril su ve hücre odasını 9 mL büyüme ortamı ile doldurarak biyoreaktörü dengeleyin.
8. Klinostat inkübatöründe dönen biyoreaktörü,% 5 CO 2 ile 37 ^oC'de 24 saat boyunca_{inkübe edin}.

3. Biyoreaktörlerde sferoidlerin büyümesi

NOT: Sferoidlerin yapısını korumak için, 3D yapıların işlenmesinde geniş delik uçları kullanılır.

1. 1 mL genişliğinde delik uçlarıyla hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek sferoidleri ultra düşük bağlantı plakasından ayırın ve doku kültürü ile işlenmiş bir kaba aktarın.
2. Tabağı 0,5 mL önceden ısıtılmış büyüme ortamı ile yıkayın ve aynı kaba aktarın.
3. Sferoidlerin kalitesini mikroskopi ile değerlendirin ve yeterince oluşturulmuş sferoidleri seçin. Kaliteli sferoidler tek tip boyuta, kompaktlığa ve yuvarlaklığa sahiptir.
4. Sferoidleri, 5 mL taze büyüme ortamı ile doldurulmuş dengeli biyoreaktörlere aktarın. Sferoidleri aktardıktan sonra, biyoreaktörü taze büyüme ortamı ile tamamen doldurun.
5. Biyoreaktörü klinostat inkübatörüne yerleştirin ve dönme hızını 10-11 rpm'ye ayarlayın.
6. Her 2-3 günde bir, 10 mL eski medyayı kaldırıp 10 mL taze medya ile değiştirerek büyüme medyasını değiştirin.
7. Dönme hızını küresel büyümeye göre ayarlayın, sferoidler boyut ve sayı olarak büyüdükçe artar.
8. Kültürde 18 gün sonra, sferoidler tedavi ve / veya toplama için hazırdır.

4. Küresel tedavi ve toplama

NOT: Bu protokolde, HepG2 / C3A sferoidleri, sırasıyla asetilasyon ve süksinilasyon içeren histon işaretlerinin seviyelerini değerlendirmek için sodyum bütirat (NaBut) ve sodyum süksinat (NaSuc) ile muamele edilir.

1. Uygun çalışma konsantrasyonuna sahip büyüme ortamını bileşik olarak hazırlayın (örneğin, 20 mM NaBut veya 10 mM NaSuc). Biyoreaktördeki medyayı işlenmiş ortamla değiştirin.
   NOT: Bir kontrol koşulu oluşturmak için, tedaviyi eklemeden önce deneyler için yeterli sayıda sferoid toplayın veya tedavi edilmemiş sferoidler için bir biyoreaktör belirleyin.
2. Yeterli tedavi süresini takiben proteomik analiz için sferoidleri toplayın (örneğin; NaSuc tedavisi için 48 saat ila 1 hafta veya NaBut tedavisi için 48-72 saat).
   NOT: Bu protokol kullanılarak histon ekstraksiyonu için, yaklaşık 1 x 10⁶ hücre içeren altı ila sekiz sferoid toplandı.
   1. Üst porttan biyoreaktörden 3-5 mL ortam çıkarın.
   2. Ön portu açın ve sferoidleri çıkarmak ve mikro santrifüj tüplerine yerleştirmek için 1 mL genişliğinde bir delik ucu kullanın.
   3. Sferoidleri 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın ve ortamı atın.
      NOT: Biyoreaktördeki ortam değiştirilebilir ve biyoreaktör ek tedavi süresi veya iyileşme için inkübatöre iade edilebilir.
   4. FBS'yi çıkarmak için sferoidleri 200 μL HBSS ile yıkayın. 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
      NOT: Sferoidler işlenene kadar -80 ^oC'de saklanabilir.

5. Histon ekstraksiyonu

NOT: Histüllerde bulunan birçok bazik amino asit kalıntısı, fosforik asit omurgasına sahip DNA ile yakından etkileşime girmelerini sağlar. Histonlar çekirdekteki en temel proteinlerden bazıları olduğundan, buz gibi sülfürik asit (0.2 M_H2S04) ile ekstrakte edildiklerinde minimum kirlenme olur. Histon olmayan proteinler güçlü asit içinde çökelecektir. % 33'lük bir nihai konsantrasyona seyreltilmiş yüksek konsantrasyonlu trikloroasetik asit (TCA), daha sonra sülfürik asitten histonları çökeltmek için kullanılır. Tüm histon ekstraksiyonu için tüm numuneleri, tüpleri ve reaktifleri buz üzerinde tutun.

1. Hücre peletine (~10-20 μL) beş hacim (~100 μL) soğuk_0,2M H 2 SO₄ ekleyin ve peleti bozmak ve histonları serbest bırakmak için yukarı ve aşağı pipet ekleyin.
2. Tüpleri sabit dönüşte 4 saate kadar veya 4 ^oC'de sallayarak inkübe edin.
   NOT: 500 μL'den daha büyük bir hacme sahip yeniden askıya alınmış numuneler için, histonları çıkarmak için 2 saatlik bir inkübasyon yeterlidir (daha uzun inkübasyon, diğer temel nükleer proteinlerin ekstraksiyonu ile sonuçlanabilir). Hacmi 200 μL'den az olan yeniden askıya alınmış numunelerde, daha iyi bir verim için 4 saatlik bir inkübasyon gereklidir.
3. 4 °C'de 5 dakika boyunca 3.400 x g'de santrifüj. Süpernatantı yeni bir tüpte toplayın ve peleti daha sonra atın.
4. Soğuk konsantre TCA'yı son %25-%33 v/v (örneğin, 40-60 μL soğuk TCA: 120 μL süpernatant) oluşturacak şekilde ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.
5. Tüpleri sabit dönüşte en az 1 saat veya 4 ^oC'de çalkalayarak inkübe edin.
   NOT: Daha küçük başlangıç pelet boyutları için, gece boyunca inkübasyon önerilir.
6. 4 ^oC'de 5 dakika boyunca 3.400 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice aspire edin; tüpün veya peletin kenarlarına dokunmayın.
   NOT: Histonlar tüpün her iki tarafında ve dibinde birikir. Tüpün en altında oluşan beyaz çözünmez pelet çoğunlukla histon olmayan proteinler ve diğer biyomolekülleri içerir.
7. Tüpü (duvarlar ve pelet) soğuk aseton + %0,1 HCl ile cam Pasteur pipet (~500 μL/tüp) kullanarak yıkayın.
8. 4 ^oC'de 5 dakika boyunca 3.400 x g'de santrifüj yapın Tüpü çevirerek süpernatantı atın.
9. Tüpü (duvarlar ve pelet) cam bir Pasteur pipet (~500 μL/tüp) kullanarak %100 soğuk asetonla yıkayın. 4 o C'de 5 dakika boyunca 3.400 x g'de ^santrifüj.
10. Tüpü çevirerek süpernatantı atın ve kalan asetonu pipetle atın. Kapağı açın ve numuneyi tezgahta ~ 20 dakika boyunca hava ile kurulayın.
11. Propilasyona devam edin veya numuneleri kullanana kadar -80 ^oC'de saklayın.

6. Türevlendirmenin ilk turu

NOT: Histon proteinlerini sindirmek için tripsin kullanımı, geleneksel proteomik kurulumlar kullanılarak tanımlanması zor olan aşırı küçük peptitlere yol açar. Bu nedenle, propiyonik anhidrit, modifiye edilmemiş ve monometil lizin kalıntılarının ɛ-amino gruplarını kimyasal olarak türetmek için kullanılır. Bu, tripsin proteolizini C-terminal arginin kalıntıları ile sınırlar. 96 delikli plakalardaki numuneler için, reaktif toplama için çok kanallı pipetlerin ve rezervuarların kullanılması önerilir (Şekil 2A). Derivatizasyon, peptidlerin serbest N-terminini etiketlemek için sindirimden sonra peptid hidrofobikliğini ve dolayısıyla ters faz kromatografik retansiyonunu arttırmak için de gerçekleştirilir.

1. Numuneleri 100 mM amonyum bikarbonatta (pH 8.0) %15-%20 asetonitril içeren 20 μL içinde yeniden askıya alın. 15 s için vorteks ve sonra 30 s için 1.000 x g'de aşağı doğru döndürün.
2. Sekiz veya daha fazla numune varsa, her bir yeniden askıya alınmış numuneyi 96 delikli bir plakaya aktarın.
   NOT: Numuneler 96 delikli bir plakaya aktarılmamışsa, 6.3-6.7, 7.1-7.5 ve 8.1-8.5 numaralı adımlarda tek kanallı pipet kullanılabilir.
3. Kaputun altında, çok kanallı bir pipet kullanarak 2 μL propiyonik anhidrit ekleyin. 5 kat yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın.
4. Çok kanallı pipet kullanarak hızlı bir şekilde 10 μL amonyum hidroksit ekleyin. 5 kat yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın.
   NOT: Propiyonik asit, propiyonik anhidrit ile peptitlerden serbest aminler arasındaki reaksiyonun bir ürünüdür ve numune pH'ını azaltabilir. pH 8, numuneye 1:5 (v/v) oranında amonyum hidroksit eklenerek yeniden oluşturulabilir.
5. pH test kağıdını kullanarak pH'ın 8 olduğundan emin olun. pH 8 <, 1 μL amonyum hidroksit ekleyerek ayarlayın. pH 8 >, 1 μL formik veya asetik asit ekleyerek ayarlayın. pH 10 >, diğer amino asit kalıntılarının daha yüksek pKa ile etiketlenmesi mümkündür.
6. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
7. 6.3-6.6 arasındaki adımları yineleyin. Çift tur histon propiyonilasyonu, neredeyse tam reaksiyon verimliliği sağlar.
8. Tüm kuyucuklar tamamen kuruyana kadar (~ 9 saat) hızlı vakumda kuru plaka.
9. Tripsin sindirimine devam edin veya numuneleri kullanana kadar -80 ^oC'de saklayın.

7. Histon sindirimi

NOT: Histonlar, arginin ve lizin kalıntılarının karboksil tarafında kesen tripsin kullanılarak peptitlere sindirilir. Bununla birlikte, propiyonilasyon lizin kalıntılarını değiştirdiğinden, sadece arginin kalıntıları parçalanır (Şekil 2B).

1. Tripsin çözeltisi hazırlayın (50 mM NH 4 HCO₃, pH 8.0'da 25ng / μL). Her numuneye 20 μL tripsin (500 ng) ekleyin.
   1. 50 mM NH 4 HCO 3 çözeltisi hazırlamakiçin, 100 mM NH₄HCO₃ çözeltisi 1:1 v / v'yi HPLC sınıfı su ile seyreltin.
2. pH test kağıdını kullanarak pH'ın 8 olduğundan emin olun. pH 8 <, 1 μL amonyum hidroksit ekleyerek ayarlayın. pH 8 >, 1 μL formik veya asetik asit ekleyerek ayarlayın.
3. Gece boyunca oda sıcaklığında sindirin veya 6-8 saat boyunca 37 ^oC'de inkübe edin.
4. Mümkünse, ~ 3 saatlik sindirimden sonra pH'ı kontrol edin, çünkü azalmış olabilir. pH 8 <, 1 μL amonyum hidroksit ekleyerek ayarlayın.
5. Ek 5 μL 50 ng / μL tripsin çözeltisi (250 ng) ekleyin ve sindirime devam edin.
6. İkinci propilasyon turuna geçin veya numuneleri kullanana kadar -80 ^oC'de saklayın.

8. Peptit N-terminin türevleştirilmesi

NOT: Histon peptidlerin N-terminüslerinde propiyonilasyonu, propiyonil grubu peptid hidrofobikliğini arttırdığından, ters fazlı sıvı kromatografisi (örneğin, histon H3'ün 3-8 amino asitleri) ile en kısa peptitlerin tutulmasını arttırır.

1. Kaputun altında, çok kanallı pipeti kullanarak 2 μL propiyonik anhidrit ekleyin. 5 kat yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın.
2. Çok kanallı pipeti kullanarak hızlı bir şekilde 10 μL amonyum hidroksit ekleyin. 5 kat yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın.
   NOT: Propiyonik asit, propiyonik anhidrit ile peptitlerden serbest aminler arasındaki reaksiyonun bir ürünüdür ve numune pH'ını azaltabilir. pH 8, numuneye 1:5 (v/v) oranında amonyum hidroksit eklenerek yeniden oluşturulabilir.
3. pH test kağıdını kullanarak pH'ın 8 olduğundan emin olun. pH 8 <, 1 μL amonyum hidroksit ekleyerek ayarlayın. pH 8 >, 1 μL formik veya asetik asit ekleyerek ayarlayın. pH 10 >, diğer amino asit kalıntılarının daha yüksek pKa ile etiketlenmesi mümkündür.
4. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
5. 8.1-8.4 arasındaki adımları yineleyin. Çift tur histon propiyonilasyonu, neredeyse tam reaksiyon verimliliği sağlar.
6. Tüm kuyucuklar tamamen kuruyana kadar (~ 9 saat) hızlı vakumda kuru plaka.
7. Tuzdan arındırma adımına geçin veya numuneleri kullanana kadar -80 ^oC'de saklayın.

9. Tuzdan arındırma ve numune temizleme

NOT: Numunede bulunan tuzlar kütle spektrometresi analizine müdahale eder. Tuzlar ayrıca elektrosprey sırasında iyonize edilir ve peptitlerden gelen sinyalleri bastırabilir. Tuzlar, peptidler üzerinde iyonik addüktler oluşturabilir, bu da addüklenen peptidin farklı bir kütleye sahip olmasına neden olur. Bu, peptidin sinyal yoğunluğunu azaltır ve uygun tanımlama ve nicelleştirmeyi önler. Tuzdan arındırma kurulumu Şekil 2C'de gösterilmiştir.

1. HLB reçinesini (% 100 asetonitrilde 50 mg / mL) manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırmaya başlayın.
2. Akışı toplamak için 96 delikli polipropilen filtre plakasının altına yerleştirilmiş 96 delikli bir toplama plakası olduğundan emin olun.
3. Filtre plakasına kuyucuk başına 70 μL HLB süspansiyon ekleyin. Sıçramayı önlemek için vakumu yavaşça açın. Akış akışını atın.
4. Reçineyi 100 μL% 0.1 TFA ile yıkayın. Sıçramayı önlemek için vakumu yavaşça açın. Akış akışını atın.
5. Her numuneyi% 0.1 TFA'nın 100 μL'sinde yeniden askıya alın. pH'ı kontrol edin; ~2-3 olmalıdır.
6. Her numuneyi her bir kuyucuğa yükleyin. Sıçramayı önlemek için vakumu yavaşça açın. Akış akışını atın.
7. 100 μL% 0.1 TFA ile yıkayın. Sıçramayı önlemek için vakumu yavaşça açın. Akış akışını atın.
8. Toplama plakasını 96 delikli yeni bir toplama plakasıyla değiştirin.
9. Kuyu başına 60 μL %60 asetonitril/%0,1 TFA ekleyin. Sıçramayı önlemek için vakumu yavaşça açın. Akışı toplayın ve hızlı bir vakumda kurutun.
10. LC-MS/MS'ye geçin veya numuneleri kullanana kadar -80 ^oC'de saklayın.

10. Kütle spektrometresi ile birleştirilmiş sıvı kromatografisi ile histon peptid analizi

1. Mobil fazları yüksek performanslı sıvı kromatografisinde (HPLC) çalışacak şekilde hazırlayın. Mobil Faz A (MPA): % 2 HPLC sınıfı asetonitril +% 0.1 formik asit. Mobil Faz B (MPB): %80 HPLC sınıfı asetonitril + %0.1 formik asit.
2. HPLC yöntemini aşağıdaki gibi programlayın: (1) 30 dakika boyunca% 4 -% 34 MPB; (2) 5 dakika boyunca% 34 -% 90 MPB; ve (3) 5 dakika boyunca izokratik% 90 MPB. Aşağıdaki önerilen sütun özelliklerini kullanın: C₁₈ 3 μm ambalaj malzemesi, 75 μm iç çap, 20-25 cm uzunluk. 75 μm iç çapa sahip nano sütunlar için akış hızını 250-300 nL/dk olarak ayarlayın.
   1. HPLC'nin numune yüklemeden önce kolon dengesini otomatikleştirmek üzere programlanmaması durumunda, (4) 1 dakika boyunca %90-%4 MPB ve 10 dakika boyunca (5) izokratik %4 MPB ekleyin.
3. MS edinme yöntemini programlayın.
   1. Cihazın her görev döngüsünün başında bir tam MS taraması gerçekleştirdiğinden emin olun. Sinyal ekstraksiyonu sırasında kullanılabilecek kütle doğruluğu nedeniyle yüksek çözünürlüklü enstrümantasyon (örneğin, orbitrap veya uçuş zamanı analizörleri) önerilir. Bununla birlikte, düşük çözünürlüklü enstrümantasyon daha önce tarif edildiği gibi^{de kullanılabilir 27,28}.
   2. Tam MS taramasını, her biri 300-1100 m/z m/z aralığını kapsayan 50 m/z yalıtım genişliğine sahip 16 MS/MS tarama olayının izlediğinden emin olun. Örneğin, ilk tarama sinyalleri 300-350 m / z'de, ikincisi 350-400 m / z'de vb. İzole etmelidir. Mümkünse, MS / MS taramalarını da yüksek çözünürlükte alın, ancak tam MS taramasına kıyasla daha düşük çözünürlük yeterlidir (bozulmamış iyonlara kıyasla daha küçük parça iyonu kütleleri nedeniyle).
   3. HPLC yöntemi, ~ 3-40 s tepe genişliklerine sahip kromatografik sinyaller üretecektir; Doğru sinyal ölçümünü sağlamak için, kütle spektrometresinin kromatografik tepe başına en az 10 görev döngüsü gerçekleştirdiğinden emin olun (yani, 3 s veya daha hızlı bir görev döngüsü).
   4. Tuzak tarzı bir kütle analizörü (orbitrap, iyon tuzağı) kullanıyorsanız, iyon enjeksiyon süresi sınırının <200 ms olarak ayarlandığından emin olun; diğer analizörler için (kuadrupol, uçuş süresi), daha hızlı tarama süreleri nedeniyle bu bir sorun değildir. ön test gerekebilir.
      NOT: Histon peptid analizi için MS yöntemleri hakkında daha fazla ayrıntı aşağıdaki referanslarda bulunabilir^27,28,29.
4. Numuneyi 10 μL MPA'da yeniden askıya alın, bu da ~ 1 μg / μL sindirilmiş histon örneğine karşılık gelir. Partideki tüm numuneler benzer seyreltmeler ve hacimler kullanılarak yükleniyorsa, kesin yükleme miktarı kritik değildir (ayrıca değerlendirilmesi önemsiz değildir).
5. HPLC sütununa 1 μL numune yükleyin.
6. Adım 10.1-10.3'te programlanmış LC-MS/MS yöntemini çalıştırın.

11. Veri analizi

1. MS ham veri dosyalarını, en yoğun alan entegrasyonunu gerçekleştirmek için tasarlanmış yazılıma aktarın.
   NOT: EpiProfile^30,31 mevcut çalışmada kullanılmıştır ve bilinen histon peptitlerinin güvenilir pik alan ekstraksiyonu için optimize edildiğinden genellikle tavsiye edilir. Bununla birlikte, Skyline ^32,33 gibi ekstrakte edilmiş iyon kromatografisi için serbestçe kullanılabilen diğer yazılımlar uygundur.
2. Belirli (değiştirilmemiş) bir peptidin nispi bolluğunu, tek bir peptidin alanının, tüm modifiye formlarında peptidin toplam alanına bölünmesiyle hesaplayın. EpiProfile^30,31 gibi yazılımlar zaten sinyal ekstraksiyonu için peptit kütüphaneleri içermektedir. Aksi takdirde, manuel olarak veya rutin proteomik boru hatlarını kullanarak peptid tanımlama yoluyla ilgilenilen peptidlerden oluşan bir kütüphane oluşturun.

Bu protokolde, HepG2 / C3A sferoidleri, her ikisi de histon PTM'lerin küresel seviyelerini etkileyen 20 mM NaBut ve 10 mM NaSuc ile tedavi edildi (Şekil 3A). Histon PTM'leri daha sonra MS / MS edinimi yoluyla tek kalıntı seviyesinde tanımlanmış ve ölçülmüştür (Şekil 3B).

Numuneler replikalarda çalıştırıldığında, numuneler arasında bir PTM'nin katlama değişimi zenginleştirmesini ve gözlemin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için istatistiksel analiz yapılabilir. Gösterilen veriler, asetilasyonlarla modifiye edilmiş peptitlerin, NaBut ve kontrol ile muamele edilen sferoidlerde zenginleştirildiğini göstermektedir (Şekil 3C), NaSuc ile muamele edilen örnekler, lizin süksinilasyonu ile modifiye edilmiş histon peptidlerinin daha yüksek bir göreceli bolluğuna sahiptir (Şekil 3D). Bu hesaplamalar ayrı bir yayında detaylandırıldığı gibi bir elektronik tablo programında yapılmıştır34. Belirli bir histon modifikasyonunun genel bir artışı, analiz edilen modifikasyon bölgeleri hakkında ayrıntılı bilgi korunurken bile, belirli bir modifikasyonun daha yüksek bir küresel bolluğunu gözlemlemenin daha sezgisel hale geldiği radar grafiklerinde daha iyi temsil edilebilir (Şekil 3E, F).

Bu protokol, sık sık modifiye edilmiş K9, S10 ve K14 kalıntılarını içeren histon H3 amino asit kalıntıları 9-17'den bir peptit üretir. Gösterilen veriler, NaBut ile tedavinin H3K14ac seviyelerini arttırdığını, ancak yalnızca H3K9me2 ile birlikte modifiye edilmiş histonlarda ve H3K9me3 ile değil (Şekil 4A) olduğunu göstermektedir. İki modifikasyon arasındaki birlikte var olma frekansı, düğümlerin bireysel modifikasyonları temsil ettiği, konektör çizgilerinin kalınlığının iki PTM arasındaki birlikte var olma frekansını temsil ettiği bir halka grafiği olarak daha sezgisel olarak temsil edilebilir (Şekil 4B). Bazen, birlikte yaşama sıklığı etkilenmez, ancak çubuk grafikler olarak temsil edilen veriler yanıltıcı olabilir. Örneğin, Şekil 4A'da gösterilen veriler, H3K9me2K14ac kombinasyonunun NaBut tedavisinde kontrolden daha bol olduğunu göstermektedir. Bu doğrudur, ancak verilen bu kombinasyon tedaviden bağımsız olarak en sık görülenidir. Şekil 4B , H3K9me2K14ac ve H3K9me3K14ac'nin tedaviden (çizgi kalınlığı) bağımsız olarak en sık kombinatoryal modeller olduğunu, ancak H3K14ac'nin (düğüm) küresel seviyelerinin deneyde gerçekten değişen şey olduğunu açıkça göstermektedir.

Bu protokol, K5, K8, K12 ve K16 pozisyonlarında (çoğunlukla asetilasyonlarla) değiştirilebilir kalıntıları içeren histon H4 kalıntıları 4-17'den bir peptit üretir. Kontrol ve NaBut tedavisini karşılaştırırken, verileri örneğin kelime bulutları olarak temsil ederek asetilasyon kombinasyonlarında bir artış gözlemlemek mümkündür (Şekil 4C). Bu gösterim, histon H4'ün modifiye edilmemiş versiyonunun kontrol örneğinde en bol miktarda bulunduğunu açıkça vurgularken, NaBut ile tedavi edilen sferoidler ikili, üçlü ve dörtlü asetillenmiş histon H4 proteoformlarında zenginleştirilmiştir. Bununla birlikte, kelime bulutları tam değerleri görüntülemede sınırlıdır; Bir histon kodunun göreceli bolluğu, metnin boyutuna göre kıvrılmamalıdır, bu da yanlış tahmin edilebilir. Bu nedenle, Venn diyagramları veya UpSetR gösterimi35 gibi daha modern eşdeğerler, birlikte var olan histon PTM'lerin tam niceliğini göstermek için kullanılabilir (Şekil 4D, E). Gösterilen veriler, histon H4 üzerindeki asetilasyonların seçilmiş kombinasyonlarının NaBut tedavisinde kontrole kıyasla nispeten daha bol olduğunu bir kez daha vurgulamaktadır.

Şekil 1: 3D sferoidlerin histon peptid analizi için iş akışı. HepG2 / C3A hücreleri ilk olarak% 80 akıcılığa ulaşana kadar 2D kültürde yetiştirilir. Hücreler daha sonra dengeli bir biyoreaktöre aktarılır ve sferoidler oluşturmak için 10-11 rpm'de dönecekleri klinostat inkübatörünün içine yerleştirilir. 18 gün sonra, sferoidler 20 mM NaBut veya 10 mM NaSuc ile muamele edilir ve karşılık gelen zaman noktalarından sonra hasat edilir. Çekirdekler hücrelerden izole edilir ve 0.2M H2S04 ile histon ekstraksiyonu gerçekleştirilir. Histon türevlendirmesi daha sonra tripsin sindiriminden önce ve sonra propiyonik anhidrit ile gerçekleştirilir ve elde edilen kısa peptitlerin sıvı kromatografisi ile tutulmasını sağlar. Numunelerin tuzu alınır ve daha sonra adım 10'da belirtilen LC-MS/MS yöntemi kullanılarak çalıştırılır ve elde edilen veriler adım 11'de açıklandığı gibi analiz edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Propiyonilasyon ve tuzdan arındırma adımları için kurulum . (A) Propiyonilasyon bir duman davlumbazında gerçekleştirilir ve tüm bileşenler, adımların hızlı bir şekilde art arda gerçekleştirilebilmesi için düzenlenir. (B) Histon H3.1 kuyruğunda ilk propilasyon turu, tripsin sindirimi ve ikinci tur propiyonilasyonun şeması. (C) Tuz azaltma, tezgahta 96 delikli bir vakum manifoldu ve 96 delikli bir polipropilen filtre plakası kullanılarak gerçekleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bireysel histon modifikasyonlarının gösterimi. (A) Kontrol ve tedavi edilen (20 mM NaBut veya 10 mM NaSuc) HepG2/C3A sferoidlerindeki yaygın global histon modifikasyonlarının göreceli bolluğunu gösteren çubuk grafik. (B) Kontrol altındaki ve tedavi edilen (20 mM NaBut veya 10 mM NaSuc) HepG2 / C3A sferoidlerinin 9-17 histon H3 peptid (KSTGGKAPR) kalıntıları üzerinde meydana gelen tek histon PTM'lerin bolluğunu gösteren çubuk grafik. (C,D) 20 mM NaBut (C) veya 10 mM NaSuc (D) ile tedaviyi takiben histon peptid PTM'lerin kıvrım değişimini ve diferansiyel ekspresyonunun önemini gösteren volkan grafikleri. Vurgulanan mavi ve yeşil noktalar sırasıyla asetillenmiş ve süksinillenmiş kalıntıları temsil eder. (E,F) Kontrole kıyasla sırasıyla 20 mM NaBut veya 10 mM NaSuc ile tedaviyi takiben tek histon peptid asetilasyon (E) veya süksinilasyon (F) bolluğunu gösteren radar grafikleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Birlikte var olan histon modifikasyonlarının gösterimi . (A) Kontrol altındaki ve tedavi edilen (20 mM NaBut veya 10 mM NaSuc) HepG2/C3A sferoidlerinin 9-17 numaralı histon H3 (KSTGGKAPR) kalıntıları üzerinde meydana gelen kombinatoryal histon PTM'lerin bolluğunu gösteren çubuk grafik. (B) Kontrol altındaki histon H3 (KSTGGKAPR) kalıntıları üzerindeki kombinatoryal histon PTM'ler arasındaki ilişkiyi gösteren halka grafikleri ve tedavi edilen (20 mM NaBut) HepG2/C3A sferoidleri. Düğüm renginin yoğunluğu, tedavi grubundaki tek bir PTM'nin bolluğuna karşılık gelirken, çizgi kalınlığı PTM'nin birlikte oluşma sıklığına karşılık gelir. (C) Kombinatoryal histon PTM'lerin sıklığını gösteren kelime bulutları, kontrol altındaki histon H4 kalıntıları üzerinde ve tedavi edilen (20 mM NaBut) HepG2/C3A sferoidleri. Metnin boyutu, belirtilen kombinatoryal PTM'nin bolluğuna karşılık gelir. (D,E) Kontrolde histon H4 peptid kalıntıları 4-17 ve 20 mM NaBut ile işlenmiş numuneler üzerinde birlikte var olan modifikasyonların sıklığını temsil eden Venn diyagramı. Veriler ShinyApp UpSetR35 kullanılarak görüntülenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Bu protokol kullanılarak tespit edilen peptitlerin listesi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.