Method Article

Karaciğer Dokusunun 3D Hücre Kültürü Modelinde Histone Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Küresel Düzeyde Nicelleştirilmesi

DOI:

10.3791/63606

⸱

May 5th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, üç boyutlu bir hücre kültürü sisteminin, kromatin modifikasyonlarını fizyolojik bir durumda modellemek, tedavi etmek ve analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini özetlemektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli hücrelerinin düz kültürleri, hücre fizyolojisini anlamak için yaygın olarak kullanılan in vitro bir yaklaşımdır, ancak bu sistem doğal olmayan hızlı hücre replikasyonu nedeniyle katı dokuların modellenmesinde sınırlıdır. Bu, olgun kromatini modellerken özellikle zordur, çünkü hızlı çoğalan hücreler sıklıkla DNA replikasyonuna katılır ve heterojen bir poliploid popülasyona sahiptir. Aşağıda, üç boyutlu (3B) bir hücre kültürü sistemi kullanarak sessiz kromatin modifikasyonlarının modellenmesi, işlenmesi ve analiz edilmesi için bir iş akışı sunulmaktadır. Bu protokolü kullanarak, hepatosellüler karsinom hücre hatları, aktif besin difüzyonu ve düşük kesme kuvvetleri sağlayan bir inkübatörde tekrarlanabilir 3D sferoidler olarak yetiştirilir. Sodyum bütirat ve sodyum süksinat ile tedavi, sırasıyla histon asetilasyon ve süksinilasyonda bir artışa neden oldu. Histon asetilasyon ve süksinilasyon seviyelerindeki artışlar daha açık kromatin durumu ile ilişkilidir. Sferoidler daha sonra hücre çekirdeklerinin izolasyonu için toplanır ve histon proteinleri translasyonel modifikasyonlarının analizi için ekstrakte edilir. Histon analizi, tandem kütle spektrometrisi ile çevrimiçi olarak birleştirilmiş sıvı kromatografisi ve ardından şirket içi hesaplamalı bir boru hattı ile gerçekleştirilir. Son olarak, kombinatoryal histon işaretlerinin sıklığını ve oluşumunu araştırmak için veri gösterimi örnekleri gösterilmiştir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

19. yüzyılın sonlarından bu yana, hücre kültürü sistemleri, insan vücudunun dışındaki hücrelerin büyümesini ve gelişmesini incelemek için bir model olarak kullanılmıştır 1,2. Kullanımları, dokuların ve organların hem sağlıklı hem de hastalıklı bağlamlarda nasıl çalıştığını incelemek için genişletilmiştir 1,3. Süspansiyon hücreleri (örneğin, kan hücreleri) Petri kaplarında veya şişelerinde sorunsuz ve birbirinin yerine büyür, çünkü in vivo üç boyutlu (3B) yapılarda bir araya gelmezler. Katı organlardan türetilen hücreler iki boyutlu ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

  1. Hücre büyüme ortamı (HepG2 / C3A hücreleri için): Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (DMEM, 4.5 g / L glikoz içeren DMEM) fetal sığır serumu (FBS) (% 10 v / v), L-glutamin takviyesi (% 1 v / v) ve penisilin / streptomisin (% 0.5 v / v) ekleyin. Büyüme ortamı maksimum 2 hafta boyunca 4 ° C'de saklanır.
  2. 200 mM sodyum bütirat (NaBut) çözeltisi: 10 mL hazırlamak için, 10 mL ddH 2 O'da 220.18 mg NaBut'u yeniden askıya alın-20° C'de 1 mL alikot saklayın. Hücre işleminden önce, çözeltiyi 0,45 mm'lik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin ve 20 mM'lik bir çalışma konsantrasyon....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, HepG2 / C3A sferoidleri, her ikisi de histon PTM'lerin küresel seviyelerini etkileyen 20 mM NaBut ve 10 mM NaSuc ile tedavi edildi (Şekil 3A). Histon PTM'leri daha sonra MS / MS edinimi yoluyla tek kalıntı seviyesinde tanımlanmış ve ölçülmüştür (Şekil 3B).

Numuneler replikalarda çalıştırıldığında, numuneler arasında bir PTM'nin katlama değişimi zenginleştirmesini ve gözlemin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histon PTM'lerin analizi, tipik proteomik analiz boru hattından temel olarak farklıdır. Çoğu histon PTM'nin hala esrarengiz biyolojik fonksiyonları vardır; Sonuç olarak, Gen Ontolojisi veya yol veritabanları gibi ek açıklamalar kullanılamaz. Histon modifikasyonlarını, katalizörlerinden sorumlu enzim veya bu PTM'leri bağlayan alanları içeren proteinlerle ilişkilendiren çeşitli kaynaklar mevcuttur (örneğin, HISTome36). Ayrıca, küresel histon PTM seviyeleri düzenlendiğinde kromatinin genel durumu hak.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sidoli laboratuvarı, Lösemi Araştırma Vakfı (Hollis Brownstein Yeni Araştırmacı Araştırma Bursu), AFAR (Sagol Network GerOmics ödülü), Deerfield (Xseed ödülü), Relay Therapeutics, Merck ve NIH Direktör Ofisi'ni (1S10OD030286-01) minnetle kabul eder.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisiGibco25300054
0.5-20 &mikro; L pipet uçlarıMARKA13-889-172 (Fisher Scientific)
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleriBio-Rad2239480
10 & mikro; L çok kanallı pipetMARKABR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL şırıngaHenke Sass Wolf14-817-31 (Fisher Scientific)Luer kilit ucu, 12 mL
10, 20, 200 ve 1000 & mikro; L tek kanallı pipetlerEppendorf14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 & mikro; L pipet uçlarıRainin30389164
18 G şırınga iğnesiAir-Tite14-817-100 (Fisher Scientific)3" uzunluk, 0,05" çap
200 & mikro; L çok kanallı pipetCorning4082
2-200 & mikro; L pipet uçlarıMARKAZ740118 (Millipore Sigma)
24 kuyulu ultra düşük bağlantılı mikroplakaCorning07-200-602
75 cm2  U-şekilli hücre kültürü şişesiCorning461464Uİşlenmemiş, havalandırma kapaklı
96 kuyulu etekli plakaAxygenPCR-96-FS-C (Corning)
AsetonFisher ScientificA949-1Aseton soğuk kullanılmalıdır
Amonyum bikarbonat (NH4HCO3)Sigma-AldrichA6141-25G
Amonyum hidroksit çözümFisher ScientificAC423300250
Hücre kültürü sınıfı suCorning25-055-CV
ClinoReactorCelVivo10004-123D hücre kültürü için biyoreaktör
ClinoStarCelVivoN/AClinostat CO2 3D hücre kültürü için inkübatör
ClinoStar için kontrol ünitesiCelVivoN/ATablet ayarlar
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)Corning17-205-CV1X çözeltisi 4.5 g/L glikoz ve sodyum piruvat içeren, L-glutamin ve fenol kırmızısı
içermeyen Fetal sığır serumu (FBS)Corning35-010-CV
Formik asitThermo Scientific28905
Çeker ocakMottN/AModel 7121000
Cam Pastör pipetiFisher Scientific13-678-8B9", pamuk tıkalı, borosilikat cam, steril olmayan
Glutagro takviyesiCorning25-015-CI200 mM L-ananil-L-glutamin
Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Corning21-022-CVKalsiyum, magnezyum ve fenol içermeyen 1X çözelti
kırmızı HPLC sınıfı asetonitrilFisher ScientificA955-4
HPLC sınıfı suFisher ScientificW6-1
Hidroklorik asit (HCl)Fisher ScientificA481-212
BuzN/AN/A
MEM esansiyel olmayan amino asitlerCorning25-025-CI100X çözeltisi
Oasis HLB reçineSuları18600754930&mikro ile Hidrofilik-Lipofilik-Dengeli (HLB) Reçine; m parçacık boyutu
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid kütle spektrometresiThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQYüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi
Oro-Flex I polipropilen filtre plakasıOrochemOF110096 kuyulu polipropilen filtre plakası w / 10 &; mikro; M PE frit
Penisilin-StreptomisinCorning30-002-CI100X çözelti
pH kağıdıHydrion Z111848(Sigma-Aldrich)0-13 pH test kağıdı
Pipet tabancasıEppendorfZ666467 (Millipore Sigma)
Polimikro kılcalMolex50-110-7740 (Fisher Scientific)Polimid kaplamalı esnek erimiş silika kılcal boru, 75 &; M Kimlik x 363 ve mikro; M OD
Polistiren 10 mL serolojik pipetler, sterilFisher Scientific1367549
Propiyonik anhidritSigma-Aldrich240311-50G
Soğutmalı santrifüjThermo Scientific75-217-420
Reprosil-Pur reçineMSWILR13. AQ.0003120 & Aring; gözenek boyutu, C18-AQ fazı, 3 & mikro; M boncuk boyutu
RotatorClay Adams25477 (Amerikan Laboratuvar Ticareti)Nutator Karıştırıcı 1105
Sıralama sınıfı modifiye tripsinPromegaV5111
Sodyum bütiratThermo ScientificA11079
Sodyum süksinat dibazikSigma-Aldrich14160-100G
SpeedVac vakum yoğunlaştırıcı (1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri)Savant20249 (Amerikan Laboratuvar Ticareti)
SpeedVac vakum yoğunlaştırıcı (96 kuyulu)Thermo Scientific15308325Savant SPD1010
Steril başlıkThermo Scientific1375Sınıf II, Tip A2
Sülfürik asit (H2SO4)Fisher Scientific02-004-375Baker Analiz ACS reaktifi
Doku kültürü ile tedavi edilmiş 100 mm x 20 mm çanakFisher Scientific08-772-23
Trikloroasetik asit (TCA)Thermo ScientificAC421451000% 100 w / v yeniden askıya alın
Fisher ScientificPI28904Sıralama derecesi
Vakum manifoldu 96 kuyuluKırlangıçMAVM0960R
VorteksSigma-AldrichZ258415
Su banyosuFisher ScientificFSGPD10
Geniş çaplı pipet uçları 1000 & mikro; LAxygen14-222-703 (Fisher Scientific)
Geniş çaplı pipet uçları 200 & mikro; LAxygen14-222-730 (Fisher Bilimsel)
HPLC dereceli su Trifloroasetik asit (TFA) içinde

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing lin....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone ModificationsPost Translational Modifications3D Cell CultureHepatic SpheroidsChromatin StateLiquid Chromatography Mass SpectrometryHistone AcetylationHistone SuccinylationSpheroid FormationNuclei Isolation

Related Articles