Method Article

FDR Kontrol Tabanlı Hedefsiz Metabolom Üzerinde Entegre Bir Tanımlama ve Niceleme İş Akışı

DOI:

10.3791/63625

⸱

September 20th, 2022

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Functional Protein Research of Guangdong Higher Education Institutes and MOE Key Laboratory of Tumor Molecular Biology, Institute of Life and Health Engineering, College of Life Science and Technology, Jinan University, 2Chi-Biotech Co. Ltd.

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

XY-Meta ve metaX'i birbirine entegre eden hedefsiz bir metabolomik iş akışı oluşturduk. Bu protokolde, açık erişim spektrumu referansından bir aldatmaca spektral kütüphanesi oluşturmak için XY-Meta'nın nasıl kullanılacağını gösterdik ve daha sonra FDR kontrolünü gerçekleştirdik ve metabolomik spektrumları tanımladıktan sonra metabolitleri ölçmek için metaX'i kullandık.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hedefsiz metabolomik teknikler son yıllarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, hızla artan verim ve numune sayısı, kütle spektrometresi spektrumlarının kalite kontrolü için zorluklar yaratan muazzam miktarda spektrum yaratmaktadır. Yanlış pozitifleri azaltmak için, yanlış keşif oranı (FDR) kalite kontrolü gereklidir. Son zamanlarda, XY-Meta adlı bir Target-Decoy stratejisine dayanan hedefsiz metabolom tanımlamasının FDR kontrolü için bir yazılım geliştirdik. Burada, XY-Meta ve metaX'i birbirine entegre eden eksiksiz bir analiz boru hattı gösterdik. Bu protokol, mevcut bir referans veritabanından bir aldatmaca veritabanı oluşturmak ve açık erişimli bir veri kümesinde büyük ölçekli metabolom tanımlaması için Target-Decoy stratejisini kullanarak FDR denetimi gerçekleştirmek için XY-meta'nın nasıl kullanılacağını gösterir. Diferansiyel analiz ve metabolitler ek açıklaması, metabolitlerin tepe noktaları tespiti ve kantitasyonu için metaX çalıştırıldıktan sonra gerçekleştirildi. Daha fazla araştırmacıya yardımcı olmak amacıyla, biyoinformatik becerilerine veya herhangi bir bilgisayar diline ihtiyaç duymadan bu analizler için kullanıcı dostu bir bulut tabanlı analiz platformu geliştirdik.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolitler biyolojik süreçlerde önemli roller oynar. Metabolitler genellikle enerji transferi, hormon düzenlemeleri, nörotransmiterlerin düzenlenmesi, hücresel iletişim ve protein post-translasyonel modifikasyonları gibi çeşitli süreçlerin düzenleyicileridir 1,2,3,4. Hedeflenmemiş metabolomik, çok sayıda metabolitin küresel bir görünümünü sağlar 5,6. Kütle spektrometresi ve kromatografi teknolojilerindeki ilerlemelerle birlikte, metabolom MS / MS spektrumlarının verimi son yıllarda hızla artmaktadır 7,8,9,10,11. Bu büyük veri kümelerinden metabolitleri tanımlamak için, MZmine 12, MS-FINDER 13, CFM-ID14, MetFrag15 ve SLAW 16 gibi çeşitli ek açıklama yazılımlarıgeliştirildi. Bununla birlikte, bu tanımlamalar genellikle birçok yanlış pozitif içerir. Nedenleri şunlardır: (1) MS / MS spektrumları, tepe eşleşmesini yanlış yönlendirebilecek rastgele gürültü içerir. (2) İzomerler ve parçalanma enerjilerindeki farklılıklar çoklu spektrum parmak izlerine neden olur ve böylece referans kütüphanesinin hacmini arttırır. (3) Referans kütüphanelerinin kalitesi farklılık gösterir. İyi bir referans spektral kütüphanesi oluşturmak için uygun bir standarda ihtiyaç vardır. Bu nedenle, fonksiyonel metabolom araştırması için hedeflenmemiş metabolomikler için sistematik bir yanlış keşif hızı (FDR) kontrolü gereklidir 7,8,9,17.

Hem Ampirik Bayes yaklaşımı hem de Target-Decoy stratejisi genel olarak FDR kontrol problemini ele aldı. Kerstin Scheubert ve ark., parçalanma ağacı tabanlı yöntemden oluşturulan aldatmaca veritabanındaki Target-Decoy stratejisinin FDR kontrol9 için en iyi yöntem olduğunu göstermiştir. Xusheng Wang ve ark., kimyadaki sekizli kurala dayanan aldatıcı üretim için bir yöntem tasarladılar ve FDR tahmini17'nin hassasiyetini geliştirdiler. Daha iyi performans için tuzak veritabanı oluşturmak için spektral kütüphanegösterilmiştir 18. Burada, spektral kütüphane tabanlı yöntemi geliştirdik ve FDR tahmininin hassasiyetini daha da artırabilecek XY-Meta19 adlı bir yazılım geliştirdik. Target-Decoy şeması altında FDR kontrolü için bir aldatmaca kütüphanesi oluşturmak için mevcut referans spektral kütüphanesini kullanır. XY-Meta kendi spektrum eşleştirme ve kosinüs benzerlik algoritmalarını destekler. Geleneksel arama ve yinelemeli arama modlarına izin verir. FDR değerlendirmesi adımında, Target-Decoy birleştirilmiş modunu ve ayrılmış modu destekler. Daha iyi esneklik için, XY-Meta harici aldatmaca kütüphanelerini kabul eder.

Metabolitlerin pik tespiti ve nicelleştirilmesi de hedefsiz metabolom analizinin önemli bir adımıdır. Pik tespiti, metabolom tanımlaması için ana yöntemdir. Genel olarak, metabolitlerin pik tespitinin doğruluğu, kütle spektrometrisinin gürültü sinyalleri, metabolitlerin düşük bolluğu, kirleticiler ve metabolitlerin bozunma ürünleri gibi birçok faktörden etkilenmiştir20. Numune sayısı çok fazla olduğunda veya sıvı kromatografi sütunu hedefsiz metabolom deneylerinde değiştirildiğinde, metabolom kantitasyonu21,22,23 için büyük bir zorluk olan olağanüstü parti etkileri ortaya çıkabilir. Şu anda, XCMS 24, Workflow4Metabolomic25, iMet-Q26 ve metaX19 gibi yazılımlar, hedeflenmemiş metabolomun en yüksek tespitini ve niceliğini gerçekleştirebilir, ancak metaX'in boru hattının daha eksiksiz ve kullanımı daha kolay olmasını öneririz. Burada, XY-Meta kullanarak genel kullanıma açık bir veri kümesi msv000084112 için tanımlama ve FDR kontrolü sürecini ve metaX kullanarak metabolitlerin tepe noktası tespitini ve niceliğini gösteriyoruz. Bu iş akışı yalnızca iki grup gerektirir ve her grubun en az iki örneği olması gerekir. MS / MS spektrum verileri, kütle spektrometresi platformu, iyonizasyon modu, şarj modu ve numune türünden bağımsız olarak gereklidir ve numune tabanlı normalleştirmeyi ve tepe tabanlı normalleştirmeyi destekleyebilir. Bu örneği takiben, araştırmacılar metabolomik tanımlama ve nicelemeyi kullanımı kolay bir şekilde gerçekleştirebilirler. Bu işlem hattını kullanmak için R programlama yeteneği gerekir. Herhangi bir programlama bilgisi olmayan araştırmacıya yardımcı olmak için, metabolomik analiz için bir bulut analiz platformu da geliştirdik. Bu bulut analiz platformunu Ek Materyal 5'te gösterdik.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Metabolomik veri kümelerini analiz için hazırlama

NOT: Bu gösterimde, QC örneği olmayan metabolomik veri kümelerini kullanıyoruz. Servis talebi ve kontrol grupları için verilere ihtiyaç vardır. Gösterim için, GNPS veritabanı27'de genel bir veri kümesi kullanıyoruz.

  1. Web sayfası https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp gidin. Veri Kümelerine Gözat'a tıklayın.
  2. "msv000084112" anahtar sözcüğünü Başlık sütununda arayın. Ayrıntılar için veri kümesi kimlik numarasını tıklayın ve FTP kullanarak veri kümesini indirin.
  3. Ham verileri /msv000084112 klasörüne koyun.
    NOT: Bu veri kümesi, Q Exactive platformunda pozitif modda C18 RP-UHPLC kullanılarak elde edilmiştir. 33 sağlıklı insan örneği, 12 boş örnek, iki karıştırma örneği ve 82hasta örneği 28 (Ek Materyal 8) dahil olmak üzere idrar örnekleri verilerinin metabolizmasının karakterize edilmemiş bir hastalığı olan bir kohortu temsil eder. İş akışını göstermek için, iş akışını gerçekleştirmek için kontrol grubu olarak altı sağlıklı insan örneği (NH) ve vaka grubu olarak altı hastalık örneği (NT) rastgele seçtik.

2. Veri biçimi dönüştürme

NOT: Veri kümesi doğrudan kütle spektrometresinden oluşturulan ham veriyse, genellikle .raw, .wiff veya .cdf biçimindedir. mzXML ve mgf formatlarına dönüştürülmelidirler. Burada, format dönüştürmeyi yapmak için ProteoWizard29 paketindeki msconvert aracını kullanıyoruz.

  1. ProteoWizard'ı https://proteowizard.sourceforge.io/download.html indirin ve kurun.
  2. ProteoWizard kurulum yolu altında msconvert.exe kullanarak veri biçimini dönüştürün.
    1. Ham verileri mzXML biçimine dönüştürün ve /mzXML klasöründe saklayın:/msconvert.exe /raw/*.raw -o /raw/mzXML/ --filter "peakPicking true [1,2]" --filter "zeroSamples removeExtra" --mzML --zlib --mz64 --filter "msLevel 1-2" --filter "titleMaker ... ".
    2. Ham/mzXML verilerini mgf biçimine dönüştürün ve /mgf klasöründe depolayın:/msconvert.exe /msv000084112/*.raw -o /msv000084112/mgf/ --filter "peakPicking true [1,2]" --filter "zeroSamples removeExtra" --mgf --mz64 --filter "msLevel 1-2" --filter "titleMaker ... ".

3. Metabolitler için referans spektral kütüphanesini hazırlama

NOT: XY-meta, referans spektral kütüphanelerini yalnızca mgf formatında destekler.

  1. Web sayfası https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/libraries.jsp gidin. Öğeyi bulmak için "NIST" anahtar sözcüğünü arayın. Ayrıntılar için Görüntüle'ye tıklayın ve kitaplığı indirin.
    NOT: GNPS Halk Spektral Kütüphaneleri, tür, köken, tür ve koleksiyon modlarında düzenlenmiş birçok metabolit kütüphanesi topladı. Bu kütüphanelerin sadece küçük bir kısmı standart materyaller kullanılarak üretilse de, çoğu temel araştırma için genellikle yeterlidir.
  2. İndirilen GNPS-NIST14-MATCHES.mgf kitaplığını /database klasörüne yerleştirin.

4. Metabolitlerin tanımlanması ve FDR kontrolü

  1. XY-meta'yı indirin (Windows sürümü). /XY-Meta-Win/config/ klasörünün altındaki parameter.default parametre yapılandırma dosyasını bulun. İçeriğini Ek Materyal 1'e göre değiştirin.
    NOT: Çözeltide, metabolitler genellikle anyonlar veya katyonlar ile addüktörler oluşturur ve bu da ana iyonların kütlesel olarak kaymasına yol açar. Bu nedenle, adducts türlerini ayarlamak gerekir. /adduct klasöründe pozitif yük modu ve negatif yük modu altında iyon değişim sütunu ve ters analitik sütunlar için adduct listeleri sağladık. Kullanıcılar ayrıca araştırma projelerine göre kendi adduct listelerini düzenleyebilirler. Adduct listesi, sağlanan listeyle aynı biçimde olmalıdır.
  2. XY-Meta:XY-Meta-.exe -S /XY-Meta-Win/config/parameter.default -D /msv000084112/ pos_wt-1_a.mgf -R /database/GNPS-NIST14-MATCHES.mgf komutunu kullanarak metabolit tanımlama ve FDR denetimini gerçekleştirin.
    NOT: XY-Meta parametrelerde joker karakterleri desteklemez. Bu nedenle, her mgf dosyasını işlemek için tek bir komut kullanılmalıdır. Çok sayıda dosya için bir toplu iş dosyası önerilir.

5. Diferansiyel analiz

NOT: metaX açık kaynaklı bir R paketidir. Lütfen https://github.com/wenbostar/metaX'daki kılavuza göre yükleyin. Bu analiz için 8GB RAM gereklidir.

  1. Örneği ve karşılık gelen MS verilerini belirtmek için sampleList.txt dosyasını düzenleyin. Lütfen Ek Materyal 2'ye bakın.
    NOT: metaX, QC örneklerine sahip veri kümeleri için nicel analizi destekler. QC örneklerini kullanırken, lütfen QC örnekleri için class özelliğini NA olarak değiştirin.
  2. Kantitatif analiz sonuçlarını depolamak için /output klasörü oluşturun. MOCK ve WT gruplarını ölçmek üzere metaX kullanmak üzere komut dosyasını Ek Malzeme 3'te çalıştırmak için R'yi kullanın.
    NOT: Komut dosyasını Ek Malzeme 3'te çalıştırmadan önce, komut dosyasındaki yolları gerçek yerel yollarla değiştirin.

6. Nitel ve nicel sonuçların entegrasyonu

  1. Metabolit tanımlamalarını kullanarak nitel ve nicel analizdeki tepe noktalarına açıklama eklemek için Ek Malzeme 4'te R betiğini çalıştırın.
    NOT: Komut dosyasını Ek Malzeme 4'te çalıştırmadan önce, lütfen komut dosyasındaki yolları gerçek yerel yollarınızla değiştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

msv000084112'nin ham verileri msconvert.exe tarafından dönüştürüldü ve mgf dosyaları (Ek Malzeme S6) oluşturuldu.

XY-Meta, /database klasörü altında GNPS-NIST14-MATCHES_Decoy.mgf dosyası oluşturdu. Bu, orijinal referans spektral kütüphanesi GNPS-NIST14-MATCHES.mgf'den oluşturulan aldatmaca kütüphanesidir. Bu aldatmaca kütüphanesi yeniden kullanılabilir. Bu aldatma kitaplığını yeniden kullanırken, kullanıcı parametre.default dosyasında decoy_pattern 1 olarak ayarlamalı ve decoy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hedeflenmemiş metabolitlerin FDR kontrolü büyük bir zorluk olmuştur. Burada, FDR kontrolü ile büyük ölçekli hedefsiz metabolomik analizin (nitel ve kantitatif) eksiksiz bir boru hattını gösterdik. Bu, MS analizinde çok yaygın olan yanlış pozitifleri etkili bir şekilde azaltır.

Çalışmanız için uygun bir referans spektral kütüphanesi hazırlamak kilit bir noktadır. Başarılı ve hassas bir MS/MS tanımlaması sadece uygun eşleştirme algoritmalarını değil, aynı zamanda uygun referans spektral kütüphan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2018YFC0910200/2017YFA0505001) ve Guangdong Anahtar Ar-Ge Programı (2019B020226001) tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GNPSaçık kaynakn/ahttps://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp
XY-Metaaçık kaynakn/ahttps://github.com/DLI-ShenZhen/XY-Meta
metaXaçık kaynakn/a https://github.com/wenbostar/metaX
ProteoWizardÜcretsiz Indir3.0.22116.18c918b-x86_64https://proteowizard.sourceforge.io/download.html
CHI. İstemciÜcretsiz İndirmendp48-x86-x64-allos-enuhttp://www.chi-biotech.com/technology.html?ty=ypt

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Misra, B. B., Fahrmann, J. F., Grapov, D. Review of emerging metabolomic tools and resources: 2015-2016. Electrophoresis. 38 (18), 2257-2274 (2017).
  2. Idle, J. R., Gonzalez, F. J. Metabolomics. Cell Metabolism. 6 (5), 348-351 (2007).
  3. Fiehn, O. Metabolomics — the link between genotypes and phenotypes. Functional Genomics. Town, C. , Springer. Netherlands. Dordrecht. 155-171 (2002).
  4. Functional Genomics. Town, C. , Springer. Netherlands. Dordrecht. (2002).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Vinayavekhin, N., Saghatelian, A. Untargeted metabolomics. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 30, Unit 30.1 1-24 (2010).
  7. Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
  8. Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nature Methods. 14 (1), 57-60 (2017).
  9. Scheubert, K., et al. Significance estimation for large scale metabolomics annotations by spectral matching. Nature Communications. 8 (1), 1494(2017).
  10. Schrimpe-Rutledge, A. C., Codreanu, S. G., Sherrod, S. D., McLean, J. A. Untargeted metabolomics strategies-challenges and emerging directions. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (12), 1897-1905 (2016).
  11. Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), (2018).
  12. Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), Oxford, England. 634-636 (2006).
  13. Tsugawa, H., et al. Hydrogen rearrangement rules: computational MS/MS fragmentation and structure elucidation using MS-FINDER software. Analytical chemistry. 88 (16), 7946-7958 (2016).
  14. Wang, F., et al. CFM-ID 4.0: More accurate ESI-MS/MS spectral prediction and compound identification. Analytical Chemistry. 93 (34), 11692-11700 (2021).
  15. Ruttkies, C., Schymanski, E. L., Wolf, S., Hollender, J., Neumann, S. MetFrag relaunched: incorporating strategies beyond in silico fragmentation. Journal of Cheminformatics. 8, 3(2016).
  16. Delabriere, A., Warmer, P., Brennsteiner, V., Zamboni, N. SLAW: A scalable and self-optimizing processing workflow for untargeted LC-MS. Analytical chemistry. 93 (45), 15024-15032 (2021).
  17. Wang, X., et al. Target-decoy-based false discovery rate estimation for large-scale metabolite identification. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2328-2334 (2018).
  18. Li, D., et al. XY-Meta: a high-efficiency search engine for large-scale metabolome annotation with accurate FDR estimation. Analytical Chemistry. 92 (8), 5701-5707 (2020).
  19. Wen, B., Mei, Z., Zeng, C., Liu, S. metaX: a flexible and comprehensive software for processing metabolomics data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 183(2017).
  20. Aberg, K. M., Torgrip, R. J. O., Kolmert, J., Schuppe-Koistinen, I., Lindberg, J. Feature detection and alignment of hyphenated chromatographic-mass spectrometric data. Extraction of pure ion chromatograms using Kalman tracking. Journal of Chromatography. A. 1192 (1), 139-146 (2008).
  21. Liu, Q., et al. Addressing the batch effect issue for LC/MS metabolomics data in data preprocessing. Scientific Reports. 10 (1), 13856(2020).
  22. Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
  23. Fei, F., Bowdish, D. M. E., McCarry, B. E. Comprehensive and simultaneous coverage of lipid and polar metabolites for endogenous cellular metabolomics using HILIC-TOF-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (15), 3723-3733 (2014).
  24. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
  25. Giacomoni, F., et al. Workflow4Metabolomics: a collaborative research infrastructure for computational metabolomics. Bioinformatics. 31 (9), Oxford, England. 1493-1495 (2015).
  26. Chang, H. -Y., et al. iMet-Q: A user-friendly tool for label-free metabolomics quantitation using dynamic peak-width determination. PloS One. 11 (1), 0146112(2016).
  27. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  28. Schmid, R., et al. Ion identity molecular networking for mass spectrometry-based metabolomics in the GNPS environment. Nature Communications. 12 (1), 3832(2021).
  29. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), Oxford, England. 2534-2536 (2008).
  30. Johnson, S. R., Lange, B. M. Open-access metabolomics databases for natural product research: present capabilities and future potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 22(2015).
  31. Horai, H., et al. MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences. Journal of Mass Spectrometry: JMS. 45 (7), 703-714 (2010).
  32. Rawlinson, C., et al. Hierarchical clustering of MS/MS spectra from the firefly metabolome identifies new lucibufagin compounds. Scientific Reports. 10 (1), 6043(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Untargeted MetabolomicsFDR ControlTarget Decoy StrategyMetabolite IdentificationMass SpectrometrySpectral LibraryMetabolite QuantificationPrincipal Component AnalysisDifferential Metabolite AnalysisQuality Control

Related Articles