Yöntem makalesi

İnsan Göbek Kordonu Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin Üretimi ve İskelet Kas Soyuna Farklılaşması

6.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63725

⸱

31 Ağustos 2022

 , 
1Translational Health Science and Technology Institute (THSTI), NCR Biotech Science Cluster

Bu makalede

Özet

Mezenkimal kök hücrelerin insan göbek kordonu dokusundan izolasyonu ve iskelet kası soyuna farklılaşması için bir protokol tanımladık.

Özet

Mezenkimal kök hücrelerin terapötik potansiyelini araştırmak, izolasyonun kolaylığına, farklılaşmaya yönelik potansiyele ve kaynağın güvenilirliğine ve sağlamlığına bağlıdır. Burada, mezenkimal kök hücrelerin insan göbek kordonu dokusundan (uMSC'ler) izolasyonu, immünofenotiplenmesi ve bu kültürlerin birkaç pasaj üzerinde yayılması için kademeli bir protokol tarif ediyoruz. Bu prosedürde, enzimatik sindirim olmadığı için uMSC'lerin yaşayabilirliği yüksektir. Ayrıca, göbek kordonu arterleri ve damar dahil olmak üzere kan damarlarının çıkarılması, endotel kökenli hücrelerin kirlenmemesini sağlar. Akış sitometrisi kullanılarak, izolasyon üzerine uMSC'ler CD45-CD34-'dür ve hematopoetik soydan hücrelerin yokluğunu gösterir. Önemli olarak, anahtar yüzey işaretleyicilerini, CD105, CD90 ve CD73'ü ifade ederler. Kültürlerin kurulmasından sonra, bu yazıda bu uMSC'lerde iskelet kası soyuna farklılaşmayı indüklemek için etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Diferansiye uMSC'lerde miyojenik progresyonun ayrıntılı bir analizi, uMSC'lerin farklılaşmanın ilk aşamalarında miyojenik progenitörler için bir belirteç olan Pax7'yi, ardından MyoD ve Myf5'in ekspresyonunu ve son olarak bir terminal farklılaşma belirteci olan miyozin ağır zincirini (MyHC) ekspresyonunu ifade ettiğini ortaya koymaktadır.

Giriş

İnsan göbek kordonunun, sağlam proliferasyon ve farklılaşma oranları, immünomodülatör özellikleri ve üç germ katmanının hepsinden hücre üretme yetenekleri nedeniyle şu anda rejeneratif tedaviler için araştırılmakta olan sağlam bir mezenkimal kök hücre rezervuarına sahip olduğu düşünülmektedir1. Göbek kordonu dokusu, göbek kordonu kanı, göbek damarı subendoteli ve Wharton'un jölesi (WJ) gibi kendi içinde üç belirsiz bölgeyi kapsayan çoklu bölmelerden oluşur - perivasküler bölge, intervasküler bölge ve alt amniyon veya kordon astarı (CL)2. uMSC'ler tüm bu farklı bölgelerden izole edilebilse ve anahtar MSC belirteçlerini geniş çapta ifade edebilse de, bu bölmelerin aynı uMSC popülasyonunu içerip içermediği veya farklılaşma potansiyellerinde farklılıklar gösterip göstermediği konusunda netlik yoktur3. Bu nedenle, uMSC'lerin izolasyonu için protokoller, izolasyon modlarında ve bölgelerinde daha büyük bir hassasiyet, farklılaşma potansiyellerinin sağlam karakterizasyonu ve son olarak, kablonun farklı bölmelerinden karşılaştırmalı bir analiz gerektirir.

Bu bağlamda, az sayıda çalışma, kordonun farklı kısımları arasındaki uMSC proliferatif ve farklılaştırıcı potansiyellerinde farklılıklar göstermiştir. Bunlardan CL ve WJ bölgelerinden izole edilen uMSC'ler arasındaki karşılaştırmalı analizler, CL kaynaklı uMSC'lerde daha büyük bir proliferatif potansiyel ortaya koymuştur 3,4. Ayrı bir çalışmada, WJ kaynaklı uMSC'ler, proliferasyon tahlillerinde perivasküler hücrelere (HUCPV) kıyasla daha iyi performans göstermiştir5. Kordon kanı kaynaklı uMSC'ler ile vasküler kontaminasyondan yoksun kordon dokusu kaynaklı uMSC'ler arasındaki farkların incelenmesinde, iki bölme arasında anahtar MSC belirteçlerinin diferansiyel ekspresyonunun yanı sıra kordon dokusundan türetilmiş uMSC'lerde proliferasyon oranlarının arttığı bildirilmiştir6.

uMSC'lerin öncelikle osteojenik, adipojenik ve kondrojenik soylar gibi mezoderm soyunun dokularına farklılaşma potansiyellerini inceleyen çeşitli çalışmalardan çok azı, miyojenik farklılaşma ve müteakip karakterizasyon için ayrıntılı protokollerin yanı sıra çeşitli kordon bölmeleri arasındaki karşılaştırmalı analizler sağlamıştır. Bu bağlamda sağlam bir kas farklılaşma protokolü geliştirdik ve kordon dokusu kaynaklı uMSC'lerin kordon kanı6'ya kıyasla daha üstün miyojenik farklılaşma yetenekleri gösterdiğini gözlemledik. Burada, uMSC'lerin vaskülatür ile ilişkili hücrelerden yoksun tüm kordon dokusundan izolasyonu, karakterizasyonu ve miyojenik soya farklılaşması için kademeli bir protokol detaylandırılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada göbek kordonu dokusunun kullanımı Kök Hücre Araştırmaları Kurumsal Komitesi (IC-SCR), Kurumsal Etik Komitesi, Translasyonel Sağlık Bilim ve Teknoloji Enstitüsü (IEC-THSTI), Sivil Hastane Kurumsal Etik Komitesi, Gurugram, Haryana ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi, THSTI tarafından onaylanmıştır. İnsan kordon dokusu örnekleri, doğum sırasında term doğumlardan toplandı. Deneklerden bilgilendirilmiş yazılı onam alınmıştır. Tüm yöntemler ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. MSC'lerin kordon dokusundan izolasyonu

  1. Doğum sırasında, tercihen plasentaya daha yakın olan en az 5 cm'lik kordonu kesin ve dış yüzeyi% 70 etanol ile süpürerek kordonu sterilize edin. Kordon dokusu parçasını, fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir 50 mL toplama tüpünden aynı şeyi içeren bir başkasına sırayla aktarın. Buz üzerinde deneğin adını taşıyan toplama tüpünü 1 saat içinde laboratuvara taşır.
    NOT: Daha büyük bir etüt için, numunelerin etüt boyunca izlenmesini sağlamak için numunelerin barkodlanması yararlı olabilir. Önemli olarak, insan dokularını işleyen tüm personele hepatit B aşısının tam rejimi sunulmalıdır.
  2. Laboratuvarda, kullanmadan önce otoklavlanmış aletleri ve pipetleri sterilize etmek için BSL-2 davlumbazda 25 dakika boyunca UV'yi açın.
  3. Kordon dokusu parçasını toplama tüpünden 5 g / L glikoz, 50 μg / mL gentamisin, 2.5 μg / mL amfoterisin B, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile zenginleştirilmiş PBS içeren 10cm2 doku kültürü ile muamele edilmiş bir kaba aktarın ( Şekil 1'de şematik).
  4. Bir neşter kullanarak, iki yarı silindirik parça elde etmek için kordon dokusunu uzunlamasına ekseni boyunca dikey olarak dilimleyin. Kordon burulması ve mukoid yüzey nedeniyle, diğer elde tutulan bir çift forseps ile dokuyu sabitleyin.
  5. Bu noktada, göbek damarlarını ve damarı gözlemleyin ve kan damarlarını yüzeyden bir yönde kazımak için bir neşter kullanarak çıkarın. Dokuyla ilişkili tüm artık kanı çıkarmak için kordon dokusunu PBS'de bir kez daha durulayın. Damarları çevreleyen WJ'deki hücrelerin bütünlüğünü korumak için kazımanın nazik olduğundan emin olun.
  6. Kordon dokusunun her bir yarısını 0,5cm3 büyüklüğünde parçalar halinde kesin ve parçaları ışık yüzeyi aşağı bakacak şekilde tabağın üzerine yerleştirin. Çanağı,% 5 CO 2 içeren 37 ° C nemlendirilmiş bir odada 10 dakika boyunca kısaca kuluçkayayatırın.
  7. Kuluçkadan sonra, kordon dokusu parçalarını içeren çanağı, L-glutamin, ribo- ve deoksiribonükleositler,% 15 fetal sığır serumu (ısıl inaktive değil) ve 50 μg / mL gentamisin-içermeyen MEM Alpha Modifikasyonu içeren 20 mL ortam ile doldurun. Doku eksplantlarının oryantasyonlarından çıkmasını önlemek için büyüme ortamını yanlar boyunca yavaşça ekleyin. Kuluçka sırasında doku eksplantları tarafından ıslatılacak bir fraksiyonu hesaba katmak için fazla ortam ekleyin.
  8. 3 günlük inkübasyondan sonra, kültürlere taze ortam ekleyin. Bulaşıkları tutarken kültürlerin şoklardan ve eksplantların hareketlerinden korunduğundan emin olun.
  9. 1 hafta sonra, steril forseps kullanarak doku parçalarını ayrı ayrı çıkarın ve bertaraf için uygun biyolojik tehlike torbaları kullanarak atın. Mevcut ortamı koruyun ve 10 mL taze büyüme ortamı ekleyin. Bireysel koloniler% 70'lik bir birleşime ulaşana kadar büyüme ortamını her 4 günde bir değiştirin.
    NOT: Hücrelerin çanak boyunca eşit olarak dağılmaması muhtemeldir, çünkü zamanla birleşmesi için izlenmesi gereken bireysel proliferatif koloniler olacaktır. Genel olarak, bir ay içinde, 10cm2'lik bir çanak, ayrı bir kaba bölünmek için yeterli hücre üretir.
  10. Tripsin / EDTA çözeltisi (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisinde [HBSS]'de% 1x% 0.25 tripsin ve% 0.02 EDTA) kullanarak yapışkan hücreleri toplayın. Hücre süspansiyonunu 470 × g'da 25 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve hücre peletini büyüme ortamında yeniden askıya alın.

2. uMSCS'nin immünofenotiplenmesi ve yayılması

  1. Yapışkan hücreler% 50-60 birleşimine ulaştığında ve iyi yayıldığında immünofenotiplemeye geçin. MSC işaretleyici analizini tam akıcı kültürler üzerinde yapmayın, çünkü bu anahtar MSC belirteçlerinin aşağı regülasyonuna neden olma eğilimindedir.
  2. Tripsinizasyondan sonra, FACS tüplerinde 1 × 106 hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu dağıtın (1 × 105 hücre / tüp) ve uygun florofora bağlı antikorlarla (hepsi 1:50 seyreltme) kombinasyon halinde boyanın: lekelenmemiş; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (ortak florofor); Her florofor için izotip kontrolleri. Daha fazla analiz için akış sitometresine en az 10.000 toplam olay sayısı kaydedin.
    NOT: Hücreler her yüzey işaretçisi için ayrı ayrı analiz edildiğinden, hücre alt kümeleri üzerinde geçit gerekli değildir.
  3. Yukarıdaki belirteçlere ek olarak, bireysel kordon dokusu örneklerinden oluşturulan uMSC hatlarında pozitif ve negatif yüzey belirteçlerinin varlığını doğrulamaktadır (Tablo 1).
  4. Etiketli hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin ve CD105 + CD90 + ve CD105 + CD73 + hücrelerinin yüzdesini belirleyin. CD105+ ve CD34−CD45− hücrelerini ayrı ayrı analiz edin.

3. uMSC'lerin iskelet kasına farklılaşması

  1. PBS'de %0.01 kollajen ve 20 μg/mL laminin içeren doku kültürü plakalarını kaplayın. Bu plakaları oda sıcaklığında en az 4 saat kaplayın.
  2. Büyüme ortamında 10.000 hücre/cm2 yoğunlukta plaka uMSC'ler.
  3. Hücreler% 70 birleştiğinde, büyüme ortamını aspire edin ve kültürleri PBS ile 2 kat durulayın. uMSC'lere DMEM +% 5 at serumu + 0.1 μM deksametazon + 50 μM hidrokortizondan oluşan miyojenik farklılaşma ortamı (M1) ekleyin. Miyojenik progresyonun kinetiğinin belirlenmesi için, kültürlere her gün M1 ortamı ekleyin.
  4. Miyojenik progresyonun kinetiğini belirlemek için, sırasıyla 2 gün, 4-5 gün, 6-7 gün ve 10-14 günde Pax7, MyoD, Myogenin ve MyHC ekspresyonu için uMSC'leri analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

uMSC'lerin kordon dokusundan izole edilmesinin başarısı, tam kordon kanından elde edilen zayıf başarı oranlarının aksine% >95'tir. uMSC'lerin başarılı bir şekilde izole edilmesi üzerine, FACS analizi tüm hücrelerin CD34-CD45-CD105 + CD90 + olduğunu ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, karşılaştırmalı analizde, kordon kanından izole edilen uMSC'ler, hücrelerin bir kısmının CD34 + CD45 + CD105 + (~% 15) gösterdiği heterojen popülasyonları gösterir.<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kritik adımlar
Bu protokoldeki kritik bir adım, tüm yayılma süresi boyunca, doğum anından steril kültürlerin bakımına kadar aseptik koşullar altında dokunun toplanmasıdır. Kordon toplama sırasında, kordonun sterilize edilmemiş herhangi bir yüzeye temas etmemesi ve antibiyotik takviyeli PBS içeren tüplerde toplanmadan önce% 70 etanol ile harici olarak temizlenmesi esastır. uMSC izolasyonu için kordon toplanması ve dokunun işlenmesi arasındaki süreyi sınırlamak önemlidir. Dokunun toplandığı yerden labor...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Sayın Ojas Tikoo'ya film çekimi ve video prodüksiyonu konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Gurugram Sivil Hastanesi'ndeki GARBH-Ini (İleri Araştırma ve Doğum Sonuçları Disiplinlerarası Grup-DBT Hindistan) personelinden, hemşirelerinden ve kıdemli araştırma görevlilerinden ve Dr. Pallavi Kshetrapal'dan lojistik konusunda yardım için alınan yardımı da kabul ediyoruz. Bu çalışma, Hindistan Biyoteknoloji Bölümü'nden Suchitra Gopinath'a verilen hibelerle desteklenmiştir (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Amfoterisin BSigma AldrichA2411
Antibiyotik çözeltisi 100x Sıvı, endotoksin test edildi (% 0.9 normal salin içinde 10.000 U Penisilin ve 10 mg Streptomisin / mL)HiMediaA001A-50mL
Anti-GAPDH antikoruSigma AldrichG8795
Anti-MyHC antikoru (My32)Novus BiologicalsNBP2-50401AF647
Anti-MyoD antikoru (5.8A)Novus BiologicalsNB100-56511
Anti-Miyojenin antikoru (Klon F5D)Novus BiologicalsNBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antikoruDSHBDSHB-C1-576
APC Fare anti-insan CD90 klonu 5E10BD Biosciences559869
Kollajen Tip 1MerckC8919
D (+) GlikozSigma AldrichG7021
DeksametazonSIGMAD4902
FACSCanto II veya FACSAria IIIBD Biosciences
Fetal Sığır Serumu, nitelikli BrezilyaGIBCO10270106ısıyla etkisiz hale getirilmemelidir
FITC Fare anti-insan CD106 klonu 51-10C9BD Biosciences551146
FITC Mouse anti-insan CD14 klonu M5E2BD Biosciences557153
FITC Mouse anti-insan CD31 klonu WM59BD Biosciences557508
FITC Mouse anti-insan CD34 klonu 581BD Biosciences555821
FITC Mouse anti-insan CD45 klonu HI30BD Biosciences555482
FITC Fare anti-insan CD49D klonu 9F10BD Biosciences560840
FITC Fare anti-insan CD90 klonu 5E10BD Biosciences555595
FITC Mouse anti-insan HLA-A, B, C klonu G46-2.6BD Biosciences557348
FITC Mouse anti-insan IgG klonu G18-145BD Biosciences555786
FlowJo yazılımıBD Biosciences
GentamisinSigma AldrichG1264
At serumuHiMediaRM1239
HidrokortizonMerckH4001
LamininMerckL2020
MEM Alfa L-glutamin, ribo- ve deoksiribonükleozitler olmadanHidroklon SH30568. FS uMSC'ler için bazal ortam
PE Fare anti-insan CD105 klonu 266BD Biosciences560839
PE Fare anti-insan CD44 klonu 515BD Biosciences550989
PE Fare anti-insan CD49E klonu llA1BD Biosciences555617
PE Fare anti-insan IgG klonu G18-145BD Biosciences555787
PE-Cy7 Fare anti-insan CD73 KLON AD2BD Biosciences561258
Fosfat tamponlu salin (PBS), pH = 7.4HiMediaM1866
Tripsin / EDTA çözeltisi (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisinde (HBSS) 1x %0.25 Tripsin ve %0.02 EDTA)HiMediaTCL049-100mL
modifikasyon

Kaynaklar

  1. Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
  2. Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  3. Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
  4. Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
  5. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  6. Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).
  7. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  8. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
  9. Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
  10. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726(2013).
  11. Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
  12. Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

skelet Kas DiferansiyasyonuMiyojenik DiferansiyasyonAk SitometrisiH cre Y zey MarkerlarCD105 CD90CD73 EkspresyonuMiyozin A r ZinciriMiyojenik Projenit rler

İlgili makaleler