Topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS), biyofiziksel ve biyosensing alanlarında bir grup biyomoleküler yapının mekanik olarak açılması ve gerçek zamanlı olarak algılanması için sağlam bir tekniktir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kesme Kuvvetleri ile Topluluk Kuvveti Spektroskopisi
Bu makalede
Özet
Özet
Floresan ve mekanokimyasal prensiplere dayanan tek moleküllü teknikler biyolojik algılamada üstün duyarlılık sağlar. Bununla birlikte, yüksek verim yeteneklerinin eksikliği nedeniyle, bu tekniklerin uygulanması biyofizikte sınırlıdır. Topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS), bireysel moleküllerin mekanokimyasal çalışmalarını moleküler toplulukların çalışmalarına dönüştürerek büyük bir moleküler yapı kümesinin araştırılmasında yüksek verim göstermiştir. Bu protokolde, DNA ikincil yapıları (i-motifler), bir homojenizatör ucunun rotoru ile statoru arasındaki kesme akışında 77796 / s'ye kadar kesme hızlarında açılmıştır. Akış hızlarının ve moleküler boyutların i-motifin yaşadığı kesme kuvvetleri üzerindeki etkileri gösterilmiştir. EFS tekniği ayrıca DNA i-motifleri ve ligandlar arasındaki bağlanma afinitesini de ortaya çıkardı. Ayrıca, kesme kuvveti (yani, mekano-tıklama kimyası) ile harekete geçirilebilen bir tıklama kimyası reaksiyonu gösterdik. Bu sonuçlar, moleküler yapıların konformasyonunu kontrol etmek için kesme kuvveti kullanmanın etkinliğini ortaya koymaktadır.
Giriş
Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi1'de (SMFS), bireysel moleküler yapıların mekanik özellikleri, atomik kuvvet mikroskobu, optik cımbız ve manyetik cımbız 2,3,4 gibi sofistike aletlerle incelenmiştir. Kuvvet üreten/algılayan kurulumlardaki moleküllerin aynı yönlülük gereksinimi veya manyetik cımbızdaki küçük görüş alanı ve minyatür santrifüj kuvvet mikroskobu (MCF)5,6,7,8 ile sınırlı olarak, SMFS kullanılarak aynı anda yalnızca sınırlı sayıda molek....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm tamponlar ve kimyasal reaktifler Tablo Malzemeleri'nde listelenmiştir.
1. Kesme kuvveti mikroskobunun hazırlanması
NOT: Kesme kuvveti mikroskobu, bir reaksiyon ünitesi (homojenizatör) ve bir algılama ünitesi (floresan mikroskobu) olmak üzere iki bölümden oluşur. Göz merceğinin büyütülmesi 10x'tir ve objektif lensin (hava) büyütmesi 4x'tir.
- Homojenizatörü ve mikroskobu bir montaj tablasına monte edin. Gözlük takın ve floresan mikroskobu açın ve ardından uygun bir dalga boyundaki uyarma ışık demetinin (burada 488 nm kullanıldı) homojeniza....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1, EFS'deki topluluk moleküllerinin mekanik açılımını ve gerçek zamanlı algılanmasını özetlemektedir. Şekil 1B'de, i-motif DNA'nın floresan yoğunluğunun, pH 5.5 MES tamponunda 9.724 s-1 ila 97.245 s-1 arasında değişen kesme hızı ile arttığı gözlenmiştir. Bir kontrol olarak, aynı i-motif DNA'sı pH 7.4 MES tamponunda 63.209 s-1 oranında kesildiğinde floresan yoğunluğu artmadı. Bunun nedeni, i-motifin pH 7.4
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede açıklanan protokol, bir grup biyomoleküler yapının kesme kuvveti ile açılmasının gerçek zamanlı olarak araştırılmasına izin verir. Burada sunulan sonuçlar, DNA i-motif yapılarının kesme kuvveti ile açılabileceğinin altını çizmektedir. Ligand'a bağlı i-motifin açılması ve kesme kuvveti ile harekete geçirilmiş tıklama reaksiyonları, bu topluluk kuvveti spektroskopisi yöntemi için kavram kanıtı uygulamalarıydı.
Şekil 1'de cihaz kurulumu gösterilmektedir. .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu araştırma çalışması, Ulusal Bilim Vakfı [CBET-1904921] ve Ulusal Sağlık Enstitüleri [NIH R01CA236350] tarafından H. M. tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Askorbik asit | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azid | Click Kimya Araçları | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ||
| Dispersiyon ucu | İsviçre | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Boya | IDT/ | 5Cy5/ | |
| Floresan mikroskobu | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homojenizatör | İsviçre | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biyoteknoloji | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Söndürücü | IDT | / 3IAbRQSp / | |
| TBTA | Tokyo Kimya Endüstrisi | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
Kaynaklar
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
