Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

Arun Upadhyay; Robert J. Vassar; Jeffrey N. Savas

doi:10.3791/63816

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

3.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63816

⸱

28 Nisan 2022

Arun Upadhyay¹ , Robert J. Vassar¹ , Jeffrey N. Savas¹

¹Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Bu makalede

Özet

Kütle spektrometrisine dayalı proteomik analiz ile bu biyokimyasal saflaştırma yöntemi, Alzheimer hastalığını önleme hedeflerinin belirlenmesini hızlandırabilecek amiloid fibril çekirdeklerinin sağlam karakterizasyonunu kolaylaştırır.

Özet

Proteinli fibriller inklüzyonlar çoklu nörodejeneratif hastalıkların anahtar patolojik özellikleridir. Alzheimer hastalığının (AD) erken evrelerinde, amiloid-beta peptitleri, hücre dışı boşlukta, yavaş yavaş büyüyen ve büyük amiloid plaklara olgunlaşan tohumlar gibi davranan protofibriller oluşturur. Bu temel anlayışa rağmen, beyindeki amiloid fibril yapısı, bileşimi ve biriktirme kalıpları hakkındaki mevcut bilgiler sınırlıdır. En büyük engellerden biri, yüksek oranda saflaştırılmış amiloid fibrillerinin beyin ekstraktlarından izole edilememesi olmuştur. Afinite saflaştırma ve lazer yakalama mikrodiseksiyon tabanlı yaklaşımlar daha önce amiloidleri izole etmek için kullanılmıştır, ancak geri kazanılabilecek az miktarda malzeme ile sınırlıdır. Bu yeni, sağlam protokol, sodyum dodesil sülfat (SDS) çözünürlüğü kullanılarak sodyum dodesil sülfat (SDS) çözünürlüğü kullanılarak amiloid plak çekirdeklerinin biyokimyasal saflaştırılmasını açıklar ve sakkaroz yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme ve ultrasonikasyon ile AD hastalarından ve AD model beyin dokularından oldukça saf fibriller verir. Saflaştırılmış malzemenin kütle spektrometresi (MS) tabanlı aşağıdan yukarıya proteomik analizi, amiloid fibrillerin neredeyse tüm birincil protein bileşenlerini tanımlamak için sağlam bir stratejiyi temsil eder. Amiloid koronadaki proteinlerin önceki proteomik çalışmaları, beklenmedik derecede büyük ve işlevsel olarak çeşitli protein koleksiyonunu ortaya çıkarmıştır. Özellikle, saflaştırma stratejisini rafine ettikten sonra, birlikte saflaştırıcı proteinlerin sayısı, izole SDS çözünmeyen malzemenin yüksek saflığını gösteren 10 kattan fazla azaltılmıştır. Negatif boyama ve immüno-altın elektron mikroskopisi, bu preparatların saflığının doğrulanmasına izin verdi. Bu proteinlerin amiloid kapanımlarına birikmesine katkıda bulunan mekansal ve biyolojik özellikleri anlamak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Birlikte ele alındığında, bu analitik strateji amiloid biyolojisinin anlaşılmasını arttırmak için iyi konumlandırılmıştır.

Giriş

Amiloid, bazıları patolojik değişikliklere yol açan çeşitli protein panellerinde bulunan son derece kararlı bir supramoleküler düzenlemedir¹. Hücre içi veya hücre dışı amiloid agregaların birikmesi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda gözlenir². Amiloid agregaları heterojendir ve çok sayıda protein ve lipit ile zenginleştirilmiştir³. Son yıllarda, amiloid proteomuna olan ilgi, temel ve translasyonel sinirbilimciler arasında önemli bir ilgi yaratmıştır. Amiloid agregalarını fare ve ölüm sonrası insan beyin dokularından çıkarmak ve saflaştırmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Lazer yakalam....