Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Allantoik Sıvıdan Yüksek Titerli Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Üretimi

4.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63817

⸱

25 Mayıs 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathobiology, University of Guelph

Bu makalede

Özet

Burada, yüksek titreli rekombinant Newcastle hastalığı virüsünün üretimi, saflaştırılması ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak > 6 × 109 plak oluşturan birim / mL verir ve in vivo hayvan çalışmaları için uygun virüs miktarlarını sağlar. İn vivo güvenliği sağlamak için ek kalite kontrol testleri açıklanmaktadır.

Özet

Kuş ortoavulavirüs serotip-1 olarak da bilinen Newcastle hastalığı virüsü (NDV), hem onkolitik bir virüs hem de viral vektörlü bir aşı olarak geliştirilmiş negatif anlamlı, tek sarmallı bir RNA virüsüdür. NDV, iyi kurulmuş ters genetik sistemi, güçlü immünostimülatör özellikleri ve mükemmel güvenlik profili nedeniyle çekici bir terapötik ve profilaktik ajandır. Onkolitik bir virüs veya viral vektörlü bir aşı olarak uygulandığında, NDV, bağışıklık sisteminin hem doğuştan gelen hem de adaptif kollarını aktive eden sağlam bir antitümör veya antijene özgü bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır.

Bu arzu edilen özellikler göz önüne alındığında, NDV çok sayıda klinik çalışmada değerlendirilmiştir ve en iyi çalışılmış onkolitik virüslerden biridir. Şu anda, NDV'yi içeren iki kayıtlı klinik çalışma vardır: biri SARS-CoV-2 (NCT04871737) için rekombinant NDV vektörlü bir aşıyı değerlendirirken, ikincisi bir antiPD-L1 antikoru (NCT04613492) olan Durvalumab ile kombinasyon halinde Interlökin-12'yi kodlayan bir rekombinant NDV'yi değerlendirmektedir. Bu son derece umut verici viral vektörün daha da ilerlemesini kolaylaştırmak için, yüksek titreli, in vivo dereceli, rekombinant NDV (rNDV) üretmek için basitleştirilmiş yöntemlere ihtiyaç vardır.

Bu yazıda, belirtilen patojensiz (SPF) embriyonlanmış tavuk yumurtalarında rNDV'nin güçlendirilmesi ve rNDV'nin allantoik sıvıdan arındırılması için ayrıntılı bir prosedür açıklanmakta ve saflaştırma sırasında kaybı azaltmak için iyileştirmeler yapılmaktadır. Ayrıca, kirletici madde eksikliğini ve virüs bütünlüğünü doğrulamak için yapılması gereken önerilen kalite kontrol tahlillerinin açıklamaları da dahildir. Genel olarak, bu ayrıntılı prosedür, klinik öncesi çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek titreli, in vivo-grade, rekombinant, lentojenik ve mezojenik NDV'nin sentezini, saflaştırılmasını ve depolanmasını sağlar.

Giriş

Avian Orthoavulavirus-1 olarak da bilinen Newcastle Hastalığı Virüsü, hem onkolitik bir virüs hem de viral vektörlü bir aşı 1,2,3,4,5,6,7 olarak kullanılma potansiyeline sahip zarflı bir kuş paramiksovirüsüdür. Son zamanlarda, SARS-CoV-2'nin başak proteinini ifade etmek için tasarlanan NDV, fare ve hamster meydan okuma modelleri 7,8,9'da etkili bir burun içi aşı olarak karakterize edilmiştir. Bir kanser immünoterapisi olarak kullanıldığında, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin, özellikle doğal öldürücü hücrelerin, tip I interferon üretiminin ve antitümöre özgü T hücrelerinin10,11,12,13 üretilmesinin işe alınmasıyla sonuçlanır. Bu güçlü immünostimülatör özelliklere ek olarak, NDV güçlü bir güvenlik profiline ve iyi kurulmuş bir ters genetik sisteme sahiptir14,15. Bu arzu edilen özellikler, çok sayıda klinik öncesi ve insan klinik çalışmasında NDV'nin değerlendirilmesini sağlamıştır (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Bu son derece umut verici, bağışıklık uyarıcı viral vektörü daha da ilerletmek için, in vivo olarak güvenle uygulanabilen yüksek titreli, ultra saf NDV'nin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı yöntemlere ihtiyaç vardır.

NDV bir kuş paramiksovirüsü olduğundan, embriyonlanmış tavuk yumurtasında en sık çoğaltılır. NDV'yi yaymak için hücre bazlı sistemler mevcut olsa da, çoğu embriyonlanmış tavuk yumurtasında elde edilene benzer titreler üretememiştir18. Bununla birlikte, yumurta bazlı üretimin uzun olması ve kolayca ölçeklendirilememesi, büyük miktarlarda SPF tavuk yumurtası tedarik edilmesinin sorunlu olabileceği ve yumurta alerjenleri ile kontaminasyon potansiyelinin bulunması da dahil olmak üzere yumurtalarda NDV üretmenin bazı dezavantajları vardır13,18,19,20 . Son zamanlarda, bir grup, serumsuz ortamda süspansiyonda yetiştirilen Vero hücrelerinin, NDV'nin saflaştırma21'den önce yumurtalarda elde edilenlerle karşılaştırılabilir titrelere replikasyonunu destekleyebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu, virüsü Vero hücrelerine adapte etmek için virüsün seri geçişini gerektiriyordu ve NDV'yi süspansiyon Vero hücrelerinden arındırmak için bir yöntemin optimizasyonu hala gereklidir21.

Daha önce de vurgulandığı gibi, yüksek titreli, in vivo dereceli virüsü arındırmak için kullanılan yöntemler, soru22'deki virüse bağlı olarak değişir. Rekombinant NDV'nin üretimi için iyi kurulmuş bir ters genetik sistemi mevcuttur. Bir cDNA klonu, yardımcı plazmidler ve T7 RNA polimerazı eksprese eden bir yardımcı virüsün kullanımını içeren bu süreç, daha önceayrıntılı olarak 15,23 olarak tanımlanmıştır. Bu protokol lentojenik veya mezojenik NDV'ye uygulanabilir. Bu protokolde tanımlanan virüs, viral P ve M genleri arasına yerleştirilen denizanası Aequorea victoria'dan gelen yeşil floresan proteinini (GFP) bireysel bir transkripsiyon birimi olarak kodlayan rekombinant bir mezojenik NDV'dir, çünkü bu daha önce yabancı transgen yerleştirme24 için en uygun yer olarak tanımlanmıştır.

Kapalı yöntemler, NDV'nin saflaştırılmasını, 100 ila 500 nm arasında değişen boyutuna ve yoğunluğuna15 göre özetlemektedir. Bu, yumurtaların alındığı andan itibaren son bir titreye sahip olmaya kadar yaklaşık 3 hafta içinde in vivo dereceli, yüksek titreli NDV stoklarının üretilmesine izin vermiştir. Teğetsel akış filtrasyonu, derinlik filtrasyonu ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme gibi yumurta bazlı virüslerin büyük ölçekli üretiminde sıklıkla kullanılan teknikler tanımlanmıştır ve bu yöntemlerin daha büyük ölçekli üretime çevrilmesini sağlar. NDV'nin saflaştırılması için daha önce tarif edilen teknikler, virüs stabilize edici bir tamponun dahil edilmesi, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme sırasında iyodiksantal kullanımı ve in vivo-grade kalite15'i sağlamak için çeşitli kalite kontrol önlemlerinin tanımlanması ile geliştirilmiştir. Bu, 0,8 ila 1,0 L allantoik sıvıdan 3 × 1010 PFU / mL'ye kadar ulaşan titrelere ulaşan in vivo dereceli NDV'nin saflaştırılmasına izin vermiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanların kullanımını içeren tüm çalışmalar, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'ne uygun olarak Guelph Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm çalışmalar, mezojenik NDV'nin Risk Grubu 2 Patojeni olduğu Kanada'daki bir Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL2) laboratuvarında gerçekleştirilir. NDV'nin amplifikasyonu ve saflaştırılmasında yer alan tüm adımlar, güvenlik ve sterilite amacıyla bir Tip IIA biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.

1. Belirtilen patojensiz embriyonlanmış tavuk yumurtası kullanılarak NDV'nin amplifikasyonu

  1. SPF embriyonlanmış tavuk yumurtasının aşılanması
    NOT: Tipik olarak, sekiz düzine SPF embriyonlanmış tavuk yumurtası, bir in vivo dereceli NDV partisi oluşturmak için kullanılır. Nakliye sırasındaki hasarı ve canlılıktaki değişkenliği hesaba katmak için bir veya iki düzine ekstra yumurta sipariş edin. Embriyonlanmış tavuk yumurtası biyolojik materyaldir ve kurumsal kılavuzlara göre ele alınmalıdır. Ancak embriyolar yumurtadan çıkmadığı için kurumsal Hayvan Bakım Komitesi onayı gerekli değildir.
    1. SPF embriyone tavuk yumurtası aldıktan sonra, 37 ° C'de bir yumurta inkübatöründe inkübe edin, 9 gün boyunca% 60 nem. Kuluçka makinesinin yumurtaları her saat otomatik olarak sallayacak/döndürecek şekilde ayarlandığından emin olun.
      NOT: Yumurtalar oda sıcaklığında 24 saate kadar veya 4 °C'de 72 saate kadar saklanabilir; Bununla birlikte, bu embriyo canlılığını azaltabilir.
    2. 8-11 günlük inkübasyondan sonra (ideal olarak 9. günde), embriyo canlılığını belirlemek için yumurtaları mumlayın. Uygulanabilir embriyoların göstergeleri olarak ağ benzeri vaskülatür (Şekil 1A) ve embriyo hareketini arayın. Bu özelliklere sahip olmayan yumurtaları atın (Şekil 1B).
    3. Canlı yumurtalarda, hava kesesi ile embriyo arasındaki arayüzü kurşun kalemle 'X' ile işaretleyin (Şekil 1A). Bu enjeksiyon bölgesinin vaskülatürün delinmesine neden olmayacağından emin olun. İnokulum hazırlanırken işaretli yumurtaları inkübatöre geri koyun.
    4. Tüm SPF embriyonlanmış tavuk yumurtalarını enjekte etmek için gereken virüs miktarını hesaplayın. Her yumurtanın 100 μL'lik bir hacimde 100 PFU virüs aldığından emin olun; Virüsü fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 × 103 PFU / mL konsantrasyonuna kadar seyreltin. Virüs uygulamasındaki yanlışlıkları hesaba katmak için inokulumun ekstra% 20'sini hazırlayın.
    5. Antistatik bir mendil kullanarak, işaretli yumurtaların üst kısımlarını% 70 etanol içinde seyreltilmiş% 10'luk bir iyot çözeltisi ile temizleyin. Çözeltinin kuruması için yaklaşık 1-2 dakika bekleyin.
    6. Bir çift steril keskin cımbız kullanarak kabuğu dikkatlice delin. Cımbızları yumurtalar arasındaki% 70 etanol içinde sterilize edin.
    7. 1 mL'lik bir şırınga ve 25 G'lik bir iğne kullanarak, 1.1.4 adımında hazırlanan inokulumun 100 μL'sini koryoallantoik boşluğa enjekte edin (Şekil 1C). İğne ile yumurtaya yaklaşık 90° açıyla yaklaşın. İğneyi koryoallantoik membranın hemen üstüne yerleştirin.
    8. Aşılamayı takiben, delinme bölgesini örtmek ve yumurtaları inkübatöre geri döndürmek için oje kullanın. Sallanma ayarının aşılamadan 24 saat sonrasına kadar AÇIK olduğundan emin olun.
    9. Aşılamadan 24 saat sonra yumurta canlılığını kontrol edin. Vaskülatürü olmayan ölü yumurtaları koryoallantoik membranda ve embriyo hareketinde atın (Şekil 1B).
      NOT: Bu yumurtalar NDV'den değil, aşılama işlemi nedeniyle ölmüştür.
    10. Yumurtaları inkübatöre geri döndürün, allantoik sıvının yumurta proteinleri ile kirlenmesini önlemek için rocker KAPALI konuma gelir.
    11. Ölü yumurtaları tanımlamak için yumurtaları her 12-24 saatte bir 1.1.9 adımında açıklandığı gibi kontrol edin. Otolizi en aza indirmek için aşılamadan 24 saat sonra ölen yumurtaları 4 ° C'ye taşıyın. Allantoik sıvıyı soğuduktan 2-12 saat sonra hasat edin.
    12. Yumurtaları en az 72 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
      NOT: NDV'nin mezojenik bir suşunu yayıyorsanız, optimum inkübasyon süresi 60-72 saattir, çünkü uzun inkübasyon süreleri allantoik sıvının netliğinin azalması nedeniyle saflaştırma işlemini bozabilir. Bu konu, lentojenik NDV suşlarını çoğaltırken, embriyoyu öldürmek için çok daha uzun sürdükleri için önemli değildir.
    13. Uygun kuluçka döneminden sonra, allantoik sıvıyı toplamadan önce kalan yumurtaları 2-12 saat boyunca 4 ° C'ye taşıyın.
  2. NDV içeren allantoik sıvının toplanması
    1. Soğutulmuş yumurtaları biyogüvenlik kabinine taşıyın. Yumurtaların üst kısımlarını% 70 etanol ile temizleyin.
    2. Hava kesesinin bulunduğu yumurtanın apikal tarafını kırmak için steril cımbız ve cerrahi makas kullanın.
    3. Korioallantoik membranı ortaya çıkarmak için kabuğu çıkarın (Şekil 1D).
    4. Membranı dikkatlice delin ve allantoik boşluğu açığa çıkarmak için tekrar soyun (Şekil 1E). Yumurta sarısı kesesinin yanlışlıkla delinmediğinden ve bunun yumurtayı bozacağından emin olun.
    5. Embriyoyu yakalamak ve embriyonik kesesi açmak için künt forseps kullanın.
      NOT: Embriyonik kese içindeki sıvı da NDV içerir.
    6. Embriyoyu forseps ile bastırın ve 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak allantoik sıvıyı toplayın.
    7. Allantoik sıvıyı buz üzerinde berraklaşana kadar 15 mL konik tüplerde saklayın.
      NOT: Allantoik sıvı sarı ise, yumurta sarısı kesesi tehlikeye girmiştir ve allantoik sıvı atılmalıdır.
    8. Allantoik sıvıyı içeren konik tüpleri 1.500 × g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    9. Duraklama noktası: Aliquot arıtılmış allantoik sıvıyı 50 mL konik tüplere koyun ve uzun süreli depolama için -80 ° C'de saklayın (örneğin, haftalar ila aylar), virüsü dondurarak çözülmenin sert etkilerinden korumak için sıvıyı% 5'lik bir nihai konsantrasyona kadar sakkaroz ile takviye edin. Alternatif olarak, kısa süreli depolama için (örneğin, 1-3 gün), allantoik sıvıyı sakkaroz (son% 5) veya 3x Mannitol-Lizin (ML) tamponu (% 15 Mannitol,% 3 Lizin; tampon tarifleri için Ek Tablo S1'e bakınız) ile destekleyerek, 4 ° C'de depolamadan önce 1x (% 5 Mannitol,% 1 Lizin) nihai konsantrasyonunu elde edin.

2. NDV'nin allantoik sıvıdan saflaştırılması

  1. Allantoik sıvının derinlik filtrasyonu
    1. Arıtılmış allantoik sıvıyı -80 ° C'de saklayın ve saflaştırmadan önceki gece 4 ° C'de çözülür.
    2. Biyolojik bir güvenlik kabininde, boru ve peristaltik pompayı Şekil 2'de gösterildiği gibi ayarlayın.
    3. Henüz yapılmadıysa, allantoik sıvıyı 3x ML tampon ile 1x'lik bir son konsantrasyona birleştirin.
    4. Derinlik filtresini takmadan önce, sistemden 50 mL'lik 0,5 M NaOH'yi bir atık kabına geçirerek boruyu sterilize edin.
    5. 100 mL steril, moleküler sınıf suyu sistemden ve atık kabına geçirerek boruyu durulayın.
      NOT: NaOH NDV'yi devre dışı bırakacağından, virüs içeren allantoik sıvıyı vermeden önce hatların yeterince yıkanması önemlidir.
    6. Sistem, içinden 50 mL PBS çalıştırarak, tüpte yaklaşık 5 mL PBS kaldığında pompayı durdurarak sistemi astarlayın.
    7. Boruya 1-3 μM tutma derecesine sahip derinlik filtresi takın ve filtreyi havalandırmak için derinlik filtresinin apikal tarafındaki ikinci kapağı çıkarın. Sistem üzerinden ek 50 mL PBS çalıştırmaya başlayın.
    8. PBS, filtrenin üst kısmındaki havalandırma deliğinden akmaya başladığında, bağlantı noktasını kapatın ve PBS'yi hatlar boyunca akmaya devam edin.
      NOT: Küçük hava kabarcıkları kabul edilebilir, ancak büyük miktarlarda havanın varlığı, filtrenin adım 2.1.7 ve 2.1.8'de açıklandığı gibi tekrar havalandırılmasını gerektirecektir.
    9. Tüpte yaklaşık 5 mL PBS kaldığında pompayı durdurun.
    10. Atık kabını yeni bir steril toplama kabı ile değiştirin ve derinlik filtresinden allantoik sıvı çalıştırmaya başlayın.
      NOT: Basınç 10 psi'yi geçmemelidir, çünkü bu virüsün kesilmesine neden olur. Basınç, pompanın akış hızını azaltarak veya artırarak manipüle edilebilir. Basınç 10 psi'yi aşmaya başlarsa ve akış hızı daha fazla azaltılamazsa, yeni bir derinlik filtresi kullanılmalıdır. Bu durumda, allantoik sıvı akışına devam etmeden önce 2.1.6-2.1.8 adımları uygulanmalıdır.
    11. Tüm allantoik sıvı filtreden geçtikten sonra, virüs iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için hatlar boyunca 50 mL 1x ML tampon çalıştırın.
    12. Hatlar kuruyana kadar sıvıyı toplayın. Virüsü gece boyunca veya 4 °C'de 36 saate kadar saklayın.
      NOT: Virüs derinlik filtrelendikten sonra, derinlik filtrasyonunu tamamladıktan sonraki 36 saat içinde saflaştırma işlemine devam edin.
    13. Derinlik filtresinin bağlantısını kesin ve 0,5 M NaOH'de depolamadan önce sistemden 100 mL 0,5 M NaOH, 400 PPM ağartıcı 42 °C'ye kadar önceden ısıtılmış olarak çalıştırarak boruyu sterilize edin.
  2. NDV konsantrasyonu için teğetsel akış filtrasyonu
    1. Kasetin bileşenlerini Şekil 3A'da gösterildiği gibi (ve daha öncegösterildiği gibi 25) biyolojik bir güvenlik kabininde monte edin.
      NOT: Manifold ve uç plaka deterjanla yıkanmalı ve kullanımdan önce kurutulmalıdır. Silikon contalar yeniden kullanılabilir ve kasetle birlikte 0,5 M NaOH'de saklanmalıdır.
    2. Teğetsel Akışlı Filtrasyon (TFF) (çapraz akışlı filtreleme olarak da bilinir) sistemini 'açık' bir konformasyonda kurmak (Şekil 3B).
      1. İlk kez bir kaset kullanıyorsanız, TFF kasetini Elüsyon konformasyonuna monte edin ve 100 mL steril, moleküler sınıf su ile yıkayın (Şekil 3C).
      2. Rezervuar tankında sadece 5 mL su kaldığında, pompayı duraklatın ve TFF sistem kurulumunu kapalı bir konformasyona değiştirin (Şekil 3D).
      3. Rezervuara 100 mL 0,5 M NaOH, 42 °C'ye kadar önceden ısıtılmış 400 PPM ağartıcı ekleyin ve 30-60 dakika boyunca sistemde döngü yapın.
      4. Akışı duraklatın ve TFF sistemini elüsyon kurulumuna geri döndürerek temizleme solüsyonunu etkisiz hale getirmek için akışı sürdürün.
      5. Rezervuarda yaklaşık 5 mL kaldığında, pompayı duraklatın ve sistemi durulamak için 100 mL steril, moleküler sınıf su ekleyin.
      6. Rezervuarda yaklaşık 5 mL kaldığında, pompayı duraklatın ve TFF sistemini açık konformasyona yerleştirin (Şekil 3B). Adım 2.2.3 ile devam edin.
    3. Peristaltik pompayı kullanarak sistemden 100 mL 0,5 M NaOH geçirerek kaseti ve boruyu sterilize edin. Kaset bütünlüğünü korumak için basıncın 30 psi'yi geçmediğinden emin olun.
    4. Rezervuarda yaklaşık 5 mL 0,5 M NaOH kaldığında pompayı duraklatın.
    5. Rezervuara 100 mL steril, moleküler sınıf su ekleyin ve sıvıyı kasetten geçirmeye devam edin. Virüsün inaktivasyonunu önlemek için tüm NaOH'yi rezervuarın yanlarından yıkamak için rezervuarı döndürün. Rezervuar yıkama adımını tekrarlayın.
    6. Rezervuarda yaklaşık 5 mL steril, moleküler sınıf su kaldığında, pompayı duraklatın.
    7. Rezervuara 100 mL PBS ekleyin, steril, moleküler sınıf suyun yanlardan yıkanmasını sağlamak için döner. Kasetten sıvı akışını sürdürün.
    8. Rezervuarda yaklaşık 5 mL kaldığında, pompayı duraklatın, rezervuara derinlik filtreli allantoik sıvı ekleyin ve pompa akışına devam edin.
    9. Virüsün kesilmesini önlemek için 10 psi'yi geçmediğinden emin olmak için basınç göstergesi 1'i (Şekil 3B) izleyin. Peristaltik pompanın hızının bir kombinasyonunu kullanın ve atıklara elüsyonu artırmak için C-kelepçelerinin kullanın.
      NOT: Peristaltik pompanın ve C-kelepçelerinin hızının birleştirilmesi, basıncın artmasına neden olacaktır.
    10. Rezervuarda 50-100 mL allantoik sıvı kaldığında, 150-200mL 1x ML tampon ekleyerek tampon değişimi gerçekleştirmek için pompayı duraklatın.
    11. Pompa akışını sürdürün, 10 psi'yi geçmediğinden emin olmak için basınç göstergesi 1'i (Şekil 3B) tekrar izleyin.
    12. Rezervuarda 5-10 mL kaldığında, pompayı duraklatın.
    13. İki C-kelepçesi kullanarak, Şekil 3C'de gösterildiği gibi iki atık çizgisini kapatın.
    14. Rezervuarı besleyen retentat hattını ayırın ve 50 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin (Şekil 3C).
    15. Pompanın akışını sürdürün, rezervuar tankında birkaç damla sıvı kaldığında duraklayın.
    16. C-kelepçelerini atık hatlarından çıkarın ve retentat besleme hattını rezervuar tankına yeniden takın (Şekil 3B).
    17. 20-25 mL 1x ML tampon ekleyin ve rezervuar tankında yaklaşık 5 mL kalana kadar pompa akışını sürdürün.
    18. 2.2.13 ile 2.2.16 arasındaki adımları yineleyin.
      NOT: Virüs verimini artırmak için 2.2.17 ve 2.2.13 ila 2.2.16 arasındaki adımlar tekrarlanarak 3. bir elüsyon yapılabilir. Bununla birlikte, virüsün çoğu ilk iki salınımda bulunur.
    19. Salınımları bitirdikten sonra, virüsü buzun üzerine veya 4 ° C'ye yerleştirin.
    20. Hatları temizlemek için, sistemi, Şekil 3B'de gösterildiği gibi atık çizgileri rezervuara geri beslenen kapalı döngü formatı ( Şekil 3D) olacak şekilde ayarlayın.
    21. 250 mL 0,5 M NaOH, 42 °C'ye önceden ısıtılmış 400 PPM ağartıcı ekleyerek sistemi temizlemeye devam edin.
    22. Temizleme solüsyonunu gece boyunca sistemden geçirin.
      NOT: Temizleme solüsyonu yeniden sirküle edilirken, pompa 50 mL/dak hızda çalıştırılırsa, yaklaşık 5 psi'lik bir basınç gözlenmelidir. Basınç bunu aşarsa, kaset kirlidir ve temizleme çözeltisi değiştirilmeli ve işlem tekrarlanmalıdır.
    23. Hem atık hatlarını hem de retentate hattını bir atık konteynerine yönlendirerek temizleme solüsyonunu etkisiz hale getirin.
    24. Rezervuara 400-500 mL steril su ekleyin ve sistemden ve atık kaplarına akıtın.
    25. Rezervuarda yaklaşık 5 mL bırakıldığında, pompayı duraklatın ve rezervuar kabına 100-200 mL 0,5 M NaOH ekleyin ve rezervuar kabını yıkamak için çözeltiyi döndürün.
    26. Rezervuar neredeyse boşaldığında, adım 2.2.23'ü iki kez daha tekrarlayın.
    27. TFF kurulumunu sökün, TFF kasetini ve contalarını 0,5 M NaOH'luk küçük bir hacimde 4 °C'de yeniden kapatılabilir bir plastik torbada saklayın.
      NOT: Borular 0,5 M NaOH'ye batırılmış oda sıcaklığında saklanabilir.
  3. İyodiksanol yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme
    1. Ultra santrifüjü açın ve 4 ° C'ye kadar ön soğumaya ayarlayın. İstenilen rotoru da 4 °C'de önceden soğutun ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: Rotorlar 4 °C'de saklanmalıdır.
    2. PBS ve 3x ML Tamponu ile 1x nihai ML tampon konsantrasyonuna seyrelterek% 40,% 20 ve% 10 iyodiksanol çözeltisi üretmek için% 60 iyodiksanol çözeltisini (satın alma sırasındaki konsantrasyon) kullanın.
    3. 13,2 mL'lik bir üstte, üstü açık, ince duvarlı ultrasantrifüj tüpünde, sırasıyla @, ve iyodiksananol çözeltilerinin 0,5 mL, 2,5 mL ve 2,5 mL'sini kaplayın (Şekil 4A).
      NOT: Ultra santrifüj tüpünün yan tarafına yatırılması ve çözeltinin yavaşça dışarı atılması, iki gradyan katmanının karıştırılması riskini önemli ölçüde azaltacaktır. Her katmanın ayrılması, gradyanın her katmanı arasında görülebilen bir "hale" ile belirgin olmalıdır.
    4. Çeşitli degrade katmanlarının arabirimlerini işaretlemek için bir işaretleyici kalem kullanın.
    5. TFF prosedüründen salınan virüsün 6-6.5 mL tabakası yoğunluk gradyanı üzerinden. Yoğunluk gradyanını bozmamak için virüsü adım 2.3.3'te açıklandığı gibi dikkatlice ekleyin.
    6. Ultra santrifüj tüplerini, uçları birbirlerinden 0,01 g uzakta dengelemek için üstü açık bir kantar kullanarak sallanan kova rotorunun kesici uçlarına yükleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). Ağırlık farklılıklarını hesaba katmak için PBS veya ekstra virüs temizleyici kullanın.
    7. Borular dengelendikten sonra, tüpleri kapatın ve rotora yükleyin.
    8. 4 °C'de 125.000 × g'de 1,5 saat santrifüj.
      NOT: Bu, gecikmeli başlatma özelliğine sahip bir ultrasantrifüj mevcutsa gece boyunca gerçekleştirilebilir.
    9. Ultra santrifüjlemeyi takiben, bir çift steril forseps kullanarak tüpleri çıkarın. ile gradyanları arasındaki hedef bandı (büyük bir bant) arayın (Şekil 4B).
    10. Bir imbikli stand kullanarak tüpü bir beherin üstüne asın.
    11. 5 mL'lik bir şırıngaya 18 G x 1,5 inçlik bir iğne takın ve ultrasantrifüj tüpünün yan tarafını delin.
      NOT: Tüp, hedef bandın biraz altında, iğne yukarı doğru açılı olacak şekilde delinmeli ve hedef banda girecek şekilde yukarı doğru eğimlendirilmelidir.
    12. Hedef bandı çıkarmak için pistonu yavaşça uzatın.
      NOT: Çıkarılan virüsü en üst düzeye çıkarmak için iğneyi hedef bant içinde hareket ettirin. Diğer bantların veya kalıntıların hedef bantla karışmamasına dikkat edin ve fazla diyaliz kasetinin kullanılmasına yol açacağından fazla çözelti almaktan kaçının.
    13. Hedef bant çıkarıldıktan sonra, iğneyi çıkarın ve kalan çözeltinin atık kabına akmasına izin verin. Hedef bandı, diğer tüm ultrasantrifüj tüplerinden tüm bantlar çıkarılana kadar 50 mL'lik bir konik tüpe dağıtın.
    14. Tüm ultrasantrifüj tüplerinden tüm hedef bantlar çıkarılana kadar 2.3.10-2.3.13 adımlarını tekrarlayın.
    15. 2.3.10 ila 2.3.13 arasındaki adımlarda açıklandığı gibi hedef bantları ayıklamaya alternatif yaklaşım
      1. Hedef bandı kaplayan sıvıyı pipet kullanarak yavaşça çıkarın. Hedef banda ulaştıktan sonra, bir pipet kullanarak çıkarın ve virüsü 50 mL'lik bir konik tüpte saklayın.
        NOT: Bu, ultrasantrifüj tüplerinin yeniden kullanılmasına izin verir.
  4. İyodiksanolün virüs çözeltisinden uzaklaştırılması
    NOT: NDV içeren bant,% 15 ila% 16 arasında bir iyodiksanol yoğunluğunda görünür. Çözeltideki iyotiksanol konsantrasyonu, standart bir eğriye atıfta bulunarak 340 nm'de absorbans ölçülerek belirlenebilir (Ek Şekil S1). Bu konsantrasyondaki iyodiksanol çözeltileri C57BL / 6 farelere uygulandığında herhangi bir yan etki veya akut toksisite gözlenmediği için bu adım atlanabilir.
    1. 0,5-3 mL 10 kDa molekül ağırlıklı kesilmiş diyaliz kasetini PBS'ye 1 dakika batırarak önceden ıslatın.
      NOT: Diyaliz zarı pürüzsüzden fırfırlı veya engebeli bir görünüme sahip olmalıdır. Ekstrakte edilen virüsün hacmi 10 mL'yi aşarsa, iki adet 0.5-3 mL diyaliz kaseti veya 5-12 mL'lik bir diyaliz kaseti kullanılmalıdır.
    2. Uygun olduğunda, virüsü 50 mL konik tüpten toplamak için 5 veya 10 mL'lik bir şırınga ve 18 G x 1,5 inç künt dolgu iğnesi kullanın.
    3. Diyaliz kasetine girmek için şırıngayı kullanın, zarı delmemeye dikkat edin ve virüsü enjekte edin.
      NOT: Diyaliz kaseti, kasetteki hava cebinin konumunu değiştirmek için döndürülebilir. İğneyi kasetten çıkarmadan önce hava cebi çıkarılmalıdır.
    4. 1 L'lik bir beheri steril 1x PBS ile doldurun, içine bir karıştırma çubuğu ve diyaliz kaseti yerleştirin ve örtün. Hafifçe karıştırarak 4 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Diyaliz kasetini PBS'de yüzecek şekilde takmak için ekstrüde polistiren köpük ve elastik bir bant kullanın. Kaset, ML arabelleği nedeniyle hafifçe şişebilir.
    5. 1-2 saat sonra, taze 1x PBS ile değiştirin ve hafif karıştırma ile 8-10 saat daha 4 ° C'de inkübe etmeye devam edin.
      NOT: Bu bir gecede de yapılabilir.
    6. Bir kez daha taze 1x PBS ile değiştirin, oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edin.
  5. Virüs çözeltisinin konsantrasyonu
    1. Diyaliz kasetini diyaliz tamponundan çıkarın (Şekil 4C) ve küçük, kapatılabilir plastik bir torbaya koyun. Diyaliz kasetinin tamamen suya batırılması için 15-25 mL% 40 20.000 MW polietilen glikol ekleyin.
    2. Sallanma ile oda sıcaklığında inkübe edin. 5 veya 10 mL'lik bir şırınga ve 18 G x 1,5 inç künt dolgu iğnesi kullanarak kasetteki virüs hacmini periyodik olarak kontrol edin.
      NOT: Virüsü konsantre etmek için gereken süre, başlangıç hacmine ve istenen bitiş hacmine bağlı olarak değişecektir. Tipik olarak, istenen son hacim, allantoik sıvının başlangıç hacminden bağımsız olarak 1 ila 1,5 mL arasındadır. Hacmi kontrol ederken, aynı portu kullanmamaya dikkat edin, çünkü bu port bütünlüğünü tehlikeye atar ve polietilen glikol çözeltisi ile virüsün karışmasına neden olabilir.
    3. Konsantre virüsü diyaliz kasetinden çıkarmadan önce, kaseti 1x PBS'de kısaca durulayın ve 18 G x 1,5 inç künt dolgu iğnesini hava ile doldurun.
    4. Hava dolu şırıngayı diyaliz kasetine yerleştirin ve pistonu bastırın. Aparatı döndürün, böylece konsantre virüs, verilen havanın hiçbirini çıkarmadan çıkarılabilir.
    5. Konsantre virüsü, dağıtılan hacme dikkat ederek 50 mL'lik bir konik tüpe dağıtın.
    6. Aynı şırıngayı ve iğneyi kullanarak, diyaliz kasetine uygun miktarda% 60 sakkaroz enjekte edin, böylece daha önce çıkarılan virüsle birleştirildiğinde,% 5'lik bir sakkaroz konsantrasyonunda olur.
    7. Membrana yapışmış olabilecek artık virüsü yerinden çıkarmak için zara masaj yapmak için eldivenli parmaklarınızı kullanın, zarar vermemeye dikkat edin. Yerinden çıkarma işlemini kolaylaştırmak için diyaliz kasetindeki fazla havanın bir kısmını çıkarın.
    8. Bu yıkamayı zaten 50 mL konik tüpte bulunan virüsle birleştirin.
      NOT: Virüs şu anda% 5 sakkarozdadır ve 20 μL, 50 μL, 100 μL veya 200 μL alikotlara dağıtılmaya ve -80 ° C'de saklanmaya hazırdır. Alternatif olarak, uzun süreli depolama için, NDV liyofilize edilebilir ve bölüm 2.6'da açıklandığı gibi 4 ° C'de saklanabilir.
  6. NDV'nin liyofilizasyonu
    1. 16 saat boyunca 44 × 10-3 MBAR ve - 52 °C'de 1.5 mL santrifüj tüplerinde veya 15 mL konik tüplerde aliquoted edilen virüsü liyofilize edin.
    2. Liyofilize numuneleri viral titrede önemli bir azalma olmadan 4 ° C'de saklayın.

3. Kalite kontrol tahlilleri

  1. Genom doğrulaması için viral RNA izolasyonu ve ters transkripsiyon PCR
    1. 20 μL virüs aliquot'u çözün. Kit ile birlikte verilen viral RNA izolasyon protokolünü takip edin.
    2. İzole RNA'yı derhal ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) için bir şablon olarak kullanın veya -80 ° C'de saklayın.
    3. Ters transkripsiyon reaksiyonlarını, üretici tarafından sağlanan protokolde açıklandığı gibi hazırlayın.
    4. NDV patotipini (Tablo 1, F protein primer seti) ve gerekli gen kontrol elemanlarının varlığını (Tablo 1, Transgen primer seti) doğrulamak için elde edilen cDNA'yı çeşitli kalite kontrol PCR reaksiyonları için bir şablon olarak kullanın.
      NOT: Astarlar, yayılan NDV suşuna göre tasarlanmalıdır.
      1. Patotipin ana belirleyicisi olan F proteini bölünme bölgesini sıralamak için F proteini primer setini kullanın (Tablo 1). 435 baz çifti uzunluğunda bir PCR ürünü arayın.
        NOT: Burada, primerler NDV'nin LaSota suşuna göre tasarlanmıştır (Genbank katılımı AF077761.1). Optimal transgen ekspresyonunun, P ve M genleri24 arasına yabancı bir transgen yerleştirildiğinde meydana geldiği iyi bilinmektedir.
      2. Transgenin gen başlangıcının ve gen sonu elemanlarının bütünlüğünü doğrulamak için transgen primer setini kullanın. Gen başlangıcını ve gen sonu dizi bütünlüğünü doğrulamak için PCR ürününü sıralayın.
    5. DNA dizilimi için PCR ürünlerini gönderin ve bunları homoloji şablonuyla karşılaştırın.
  2. Kirletici proteinleri tespit etmek için SDS PAGE ve Coomassie boyama
    1. İlk olarak% 6 ve% 15 poliakrilamid çözeltileri hazırlayarak bir yoğunluk gradyanı SDS PAGE jeli dökün (Ek Tablo S1). 'lik çözeltinin 5 mL'sini ve ardından %6'lık çözeltinin 5 mL'sini çekmek için 10 mL'lik bir pipet kullanın.
    2. Pipetleri çözeltiden çıkarın ve kısa bir süre hava çekerek bir hava kabarcığı oluşturun.
      NOT: Hava kabarcığı yukarı doğru hareket ettikçe, bu, SDS PAGE gradyanını oluşturmak için çözümü karıştırır.
    3. Çözeltiyi döküm aparatına dağıtın ve 30 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin.
    4. 20 μL'lik son bir hacimde, bir virüs alikotunu 4x indirgeyici tamponla (Ek Tablo S1) birleştirin, böylece nihai konsantrasyon 1x olur ve bir termosiklusta 95 ° C'de 10 dakika kaynatın. Virüsün en az 1 × 107 PFU'sunu yükleyin.
    5. SDS PAGE'yi çalışan arabelleğe (Ek Tablo S1) batırın ve örnekleri yükleyin.
    6. Jeli 1-1,5 saat boyunca 120 V'ta çalıştırın.
    7. Jeli çalışan tampondan çıkarın ve daha küçük bir kaba aktarın.
    8. Jeli örtmek için Coomassie boyama çözeltisi (Ek Tablo S1) ekleyin. Oda sıcaklığında 4-5 saat inkübe edin.
    9. Boyama çözeltisini çıkarın ve ajitasyonla oda sıcaklığında 4-8 saat inkübe ederek destain çözeltisi (Ek Tablo S1) ekleyin. Destain çözümünü üç ila dört kez değiştirin.
      NOT: Jel berrak olmalı ve rengi lekelenmeden önceki gibi olmalıdır.
    10. Jeli kolorimetrik bir ayarda görüntüleyin. Allantoik sıvı ve saflaştırılmış virüs örnekleri içeren Coomassie boyalı SDS PAGE jelinin temsili bir görüntüsü için Şekil 5'e bakınız.
  3. Enfeksiyöz viral titrenin medyan doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID50) ve immünofloresan testi ile nicelleştirilmesi
    NOT: Vero hücreleri DF1 hücrelerine alternatif olarak kullanılabilir; Bununla birlikte, sitopatik etki (CPE) Vero hücrelerinde daha az belirgindir. Bu tahlilde fusojeniteyi artıran L289A mutasyonunu barındıran ve P ve M genleri arasındaki GFP'yi eksprese eden NDV kullanılmaktadır.
    1. % 2 fetal sığır serumu (FBS) ve 125 μg / mL tripsin ile desteklenmiş DMEM'i kullanmadan bir gün önce 80 μL'lik bir hacimde 20.000 hücre / kuyucukta 96 kuyucuklu bir DF1 hücresi plakası tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
    2. Ertesi gün, buz üzerinde 20 μL aliquot virüs çözülür.
    3. Seri seyreltmeler hazırlamak için 1,5 mL tüpler kullanın. 10-2 seyreltme hazırlamak için virüsün 10 μL'sini 990 μL PBS ile seyrelterek başlayın. En az 10-10'a kadar, 900 μL PBS ve önceki seyreltmenin 100 μL'sinin eklenmesiyle yapılan diğer tüm seyreltmeleri hazırlayın.
      NOT: Seyreltmeler arasında hareket ederken yeni bir pipet ucu kullanın.
    4. Şekil 6'da gösterildiği gibi 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyusunu enfekte etmek için her seyreltmenin 20 μL'sini kullanın.
      NOT: Her kuyudaki son hacim 100 μL olacaktır.
    5. CPE / GFP varlığını incelemeden veya dolaylı bir immünofloresan testi (IFA) yapmadan önce plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de en az 48 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Bu kültür koşulları altında, CPE 10 saat sonra belirgindir (Şekil 7A-D), sonraki 24 saat boyunca artar (Şekil 7E-H). GFP veya CPE ile puanlama yapılırsa plaka CPE'nin yoğunluğunu artırmak için daha uzun süre inkübe edilebilir.
      1. CPE veya GFP ile puanlama yapılıyorsa ve IFA gerçekleştirmiyorsa, adım 3.3.18.1'e atlayın.
    6. IFA yapıyorsanız, hücreleri 100 μL 1x PBS ile iki kez durulayın.
    7. Her bir oyuğa PBS'de seyreltilmiş 100 μL% 4'lük paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
    8. Hücreleri her biri 3x 5 dakika 100 μL 1x PBS,% 0.1 Ara 20 (% 0.1 PBS-T) ile yıkayın.
    9. PBS'de 100 μL% 0.1 NP-40 ilavesiyle hücreleri geçirgenleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
    10. Hücreleri 100 μL% 0.1 PBS-T ile 3x 5 dakika yıkayın.
    11. Oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °C'de gece boyunca% 0.1 PBS-T'de seyreltilmiş % 5 (V / V) normal keçi serumundan oluşan 100 μL bloke tamponu ekleyin.
    12. % 0.1 PBS-T'de seyreltilmiş birincil fare anti-NDV ribonükleoprotein antikorunun kuyucuğuna 100 μL ilave edilerek 1 μg / mL'ye kadar oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
    13. Hücreleri% 0.1 PBS-T'lik 100 μL'de 5 dakika boyunca 3 kat yıkayın.
    14. %0,1 PBS-T'de seyreltilmiş AlexaFluor 488 Goat fare karşıtı ikincil antikorun 100 μL'sini 2 μg/mL'ye ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    15. Hücreleri% 0.1 PBS-T'lik 100 μL'de 5 dakika boyunca 3 kat yıkayın.
    16. Son yıkamadan sonra, hücreleri% 0.1 PBS-T'nin 100 μL'sinde bırakın.
    17. Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak kuyucukları görüntüleyin.
    18. IFA yaparken, negatif kontrol kuyularında görülenden daha büyük floresan arayın, bu da kuyunun Şekil 8'de gösterildiği gibi NDV için pozitif olduğunu gösterir.
      1. NDV CPE'yi karakterize eden sinsiti ve büyük, yuvarlak hücrelerin varlığını arayın. GFP'yi ifade eden bir virüsle enfekte olmuş skorlama kuyuları varsa, GFP'nin varlığını arayın.
    19. Virüsün PFU/mL'sini belirlemek için Spearman-Karber titre hesaplayıcısı26'ya uygun bilgileri girin (Tablo 2). Örnek TCID50 titre plakası için Şekil 6'ya bakın.
  4. Viral titrenin kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ile ölçülmesi
    NOT: Zamandan tasarruf etmek ve numunelerin manipülasyonunu azaltmak için tek adımlı bir qRT-PCR kiti önerilir. Prob tabanlı bir tahlil, virüs dizileri için algılamanın özgüllüğünü arttırmak için kullanılır.
    1. Virüs dizilerinin bilinen bir miktarının standart bir eğrisini oluşturun (Ek Şekil S2A,B).
      NOT: Bu, NDV L geninin sentetik 500 bp çift sarmallı DNA fragmanı satın alınarak yapılabilir. NDV L geninin 500 bp fragmanının dizisi Ek Şekil S2C'de görülebilir.
    2. Virüs DNA fragmanının miktarını (genellikle üreticiler tarafından nanogram veya femtomol olarak sağlanır), Avogadro'nun sayısını ve molleri molekül formülüne (Eq (1)) kullanarak DNA fragmanının molekül sayısına veya kopyalarına dönüştürün.
      figure-protocol-1 (1)
    3. 1.00'den başlayarak 10.00 kopyadan başlayarak 10.00 × 100 kopyaya ×kadar bilinen virüs DNA fragmanı kopyalarının on kat seyreltme serisini hazırlayarak standart eğri örneklerini hazırlayın.
    4. Bilinmeyen örneklerdeki NDV RNA miktarını belirlemek için, bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak NDV RNA'yı ekstrakte edin. Kitle birlikte verilen protokolü izleyin. RNA ekstrakte edildikten sonra, tek adımlı qRT-PCR kitinde sağlanan önerilen protokolle devam edin.
    5. Reaksiyonları aşağıdaki sıcaklık ve döngü koşullarına sahip gerçek zamanlı bir PCR cihazında çalıştırın: 1) 10 dakika boyunca 55 ° C'de bir ters transkripsiyon döngüsü; 2) 1 dakika boyunca 95 ° C'de bir başlangıç denatürasyon döngüsü; ve 3) 40 döngü denatürasyon (10 s için 95 ° C), uzatma (30 s için 60 ° C) ve floresan sinyal alımı.
    6. qRT-PCR testi tamamlandıktan sonra, gerçek zamanlı PCR cihazı yazılımını kullanarak standart eğri örneklerine dayalı standart eğriyi oluşturun (Ek Şekil S2A, B).
      NOT: Yazılım ayrıca standart eğriye dayanarak bilinmeyen örneklerdeki NDV RNA miktarını da hesaplayacaktır.
  5. Farelerde akut toksisite için güvenlik testi
    1. Akut toksisiteyi değerlendirmek için 1 × 10 8 PFU virüsü kuyruk damarı yoluyla intravenöz olarak üç8 haftalık BALB / C faresine enjekte edin.
    2. Fareleri kilo kaybı (% >20), kambur duruş, karıştırılmış paltolar, uyuşukluk ve solunumdaki değişiklikler gibi olumsuz olaylar açısından izleyin. İlk 48 saat boyunca günde üç ila dört kez değerlendirin. Farelerin 48 saat sonra iyileşmeye başlaması gerektiğinden, tamamen iyileşene kadar günde bir ila iki kez izleyin.
      1. Gerektiğinde salini deri altından ve destekleyici bakımdan uygulayın. Örneğin, geri kazanım diyet jeli, fıstık ezmesi ile takviye edin veya ısı pucks kullanın. Hayvan bakımı kurumsal kılavuzlarında belirtildiği gibi, son nokta kriterlerine ulaşmış ötenazi fareleri, izofluran doz aşımı ve ardından servikal çıkık ile takip eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Allantoik sıvı hasadı
Allantoik sıvı embriyonlanmış tavuk yumurtasından toplandığından, net ve şeffaf görünmelidir. Sıvı opak ve sarı görünüyorsa, bu kirleticilerin varlığını gösterir. Saflaştırma sırasında bu allantoik sıvının dahil edilmesi, basınç, virüsün kesilmesine ve bulaşıcı virüsün kaybına neden olacak şekilde hızla yükselip 10 psi'yi geçeceğinden, saflaştırma işlemini engelleyecektir. Kanlı görünen allantoik sıvı, yumurtaların çok fazla PFU virüsü ile aşılandığını göstermektedir. Bu yumurta ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Preklinik çalışmalarda terapötik ajanlar olarak kullanılan virüsler, in vivo15 uygulandığında toksisiteyi önlemek için yüksek oranda saflaştırılmalıdır. Maceracı ajanlar veya kirleticiler uzaklaştırılmazsa, bu viral ajanın terapötik etkisini reddeden ciddi advers reaksiyonlara yol açabilir28. NDV embriyonlanmış tavuk yumurtasında üretildiğinden, preklinik veya klinik modellerde in vivo kullanılmadan önce çıkarılması gereken ovalbümin gibi birkaç kirletici ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

J.G.E.Y, Ontario Veteriner Koleji Doktora Bursu ve Ontario Yüksek Lisans Bursu aldı. Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından SKW'ye (hibe #304737) ve LS'ye (hibe #401127) Keşif Hibeleri tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 TripsinHyCloneSH30042.02
1 mL Kayma Uçlu ŞırıngaBD309659
10 mL Luer-Lok ŞırıngaBD302995
%10 Povidon İyot ÇözeltisiLORIS109-08
15 mL Konik TüplerThermo-Fisher14955240
18G x 1 1/2 inç Künt Dolgu İğnesiBD305180
18G x 1 1/2 inç Hassas Kayar İğneBD305196
25 G x 5/8 inç İğneBD305122
2-MerkaptoetanolThermo-Fisher03446I-100
%30 Akrilamid/Bis Çözeltisi 37.5:1BioRad1610158
%4 Paraformaldehit-PBSThermo-FisherJ19943-K2
5 mL Luer-Lok ŞırıngaBD309646
96 Kuyulu Doku Kültürü Plakası - Düz TabanlıGreiner Bio One655180
Asetik Asit,Buzul Thermo-FisherA38-212
AgarozKurbağaA87-500G
Alexa-Fluor 488 Keçi-Anti-FareInvitrogenA11001
Allegra X-14 SantrifüjBeckman CoulterB08861
Amonyum PersülfatBioRad161-0700
Çamaşır Suyu (%5)Thermo-Fisher36-102-0599
Geniş, tırtıksız uçlu forsepsThermo-Fisher09-753-50
Bromofenol MaviSigma-Aldrich114405-25G
Centramate Kaset TutucuPALLCM018V
ChemiDoc XRS+BioRad1708265
CO2 İnkübatörThermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259Thermo-FisherBP101-50
DF1 HücreleriATCCCRL-12203
Diyet Jeli Geri KazanımClearH2O, INC72-01-1062
Dijital 1502 Sporcu Yumurta Kuluçka MakinesiBerry Hill1502W
D-MannitolSigma-AldrichM4125-500G
Yumurta CandlerBerry HillA46
Etanol (%70)Thermo-FisherBP82031GAL
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi, pH 8.0, H2O'da 0.5M Thermo-FisherBP2482-500
Dişi Dişli Tee bağlantı parçaları, naylon, 1/8 inç NPT(F)Cole-Parmer06349-50
Fetal Sığır SerumuGibco12483-020
İnce Nokta Yüksek Hassasiyetli ForsepsThermo-Fisher22-327379
Floresan MikroskopZEISS AXIOIFA yapılmıyorsa veya NDV bir floresan proteini kodlamıyorsa gerekli değildir
Dondurarak Kurutma Sistemi Freezone 4.5LABCONCO
GiBOX Jel GörüntüleyiciAgaroz Jellerin Sentez
GliserolThermo-FisherG33-1
GlisinThermo-FisherBP381-5
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkriptaz KitiThermo-Fisher4368814
Yüksek Glikoz Dulbecco'nun Modifiye Esansiyel OrtamıCytivaSH30022.01
Nem KitiBerry Hill3030
İodiksanolSigma-AldrichD1556Suda% 60 (a/h) iyodiksanol çözeltisi (steril)
L-Lizin MonohidroklorürSigma-Aldrich62929-100G-F
Erkek ve Dişi Luer-Lok a 1/8 ulusal boru dişinde, NPTCole-Parmer41507-44
Masterflex L/S Dijital SürücüCole-ParmerRK-07522-20Dijital göstergeli Peristaltik Pompa
Masterflex L/S Hassas Boru için Kolay Yük Pompa KafasıCole-ParmerRK-07514-10
Masterflex Silikon boru (Platin) L/S 16Cole-Parmer96420-16BioPharm Platinle Kürlenmiş Silikon
MC Pro 5 TermodöngüleyiciEppendorfEP950040025
MetanolThermo-FisherA412-4
Mini Protean Tetra HücreBioRad1658000EDUSDS-PAGE döküm ve çalışan aparat
Fare-Anti-NDVNovus BiyolojiklerNBP2-11633Klon 6H12
Normal Keçi SerumuAbcamAB7481
NP-40Thermo-Fisher85124
Omega Membran LV Centramate Kaset, 100KPALLOS100T02
Optima XE-90 UltrasantrifüjBeckman CoulterA94471
OWL Easycast B1A Mini Jel Elektroforez SistemiThermo-FisherB1A
PBS 10X SolüsyonThermo-FisherBP399-20
Poli (Etilen Glikol) Ortalama Mn 20.000Sigma-Aldrich81300-1KG
PowePac 300BioRadModel 1655050 - Agaroz jel elektroforezi
Q5 için High Fidelity 2X Master MixNew England BiolabsM0492S
QIA Amp Viral RNA Mini KitiQiagen52904
RedSafeThermo-Fisher50999562
Slide-a-lyzer Diyaliz Kaseti (Ekstra Güç), 10.000 MWCO 0.5-3 mLThermo-Fisher66380
Sodyum Dodesil SülfatThermo-FisherBP166-500
Sodyum Hidroksit (Peletler)Thermo-FisherS318-10
Spesifik patojen içermeyen yumurtalarCFIANATedarikçisi konuma göre değişecektir
SükrozThermo-FisherS5-3
Supracap 50 Derinlik FiltresiPALLSC050V100P
Cerrahi MakasThermo-Fisher08-951-5
Sw41Ti RotorBeckman Coulter331362Protokol adımı 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7'de kullanılır
SX4750 RotorBeckman Coulter369702
SxX4750 Konsiyel Tabanlı Borular için AdaptörBeckman Coulter359472
TEMEDInvitrogen15524-010
İnce Duvarlı Ultraclear santrifüj tüpleri ( 9/16 inç x 3 1/2 inç)Beckman Coulter344059
Tris BaseThermo-FisherBP152-5
Boru Vidalı KelepçePALL88216
Tween 20Sigma-AldrichP1379-1L
Yardımcı Basınç GöstergeleriCole-Parmer68355-06
Görüntülemesi

Kaynaklar

  1. Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
  2. Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).
  3. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies. Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).
  4. Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).
  5. Matuszewska, K., et al. Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).
  6. McAusland, T. M., et al. Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).
  7. Warner, B. M., et al. Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease. iScience. 24 (11), 103219(2021).
  8. Sun, W., et al. Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate. EBioMedicine. 62, (2020).
  9. Sun, W., et al. A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).
  10. Xu, Q., et al. Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo. International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).
  11. Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy. Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).
  12. Ricca, J. M., et al. Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy. Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).
  13. Zamarin, D., et al. Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy. Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).
  14. Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy. Biomedicines. 7 (3), (2019).
  15. Santry, L. A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).
  16. Cassel, W. A., Murray, D. R. A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).
  17. Plitt, T., Zamarin, D. Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations. Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).
  18. Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).
  19. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  20. Hegde, N. R. Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).
  21. Fulber, J. P. C., et al. Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures. Vaccines. 9 (11), 1335(2021).
  22. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).
  23. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830(2013).
  24. Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression. The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).
  25. van Vloten, J. P., et al. Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).
  26. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85(2016).
  27. Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence. PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).
  28. Sheets, R. L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines. Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).
  29. Chung, E. H. Vaccine allergies. Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50(2014).
  30. Schirrmacher, V. Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate. Biomedicines. 4 (3), (2016).
  31. Ajamian, F., et al. CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).
  32. Axis-Shield. Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).
  33. Mita, A., et al. Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations. Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).
  34. Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient. Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).
  35. Zhou, Y., et al. A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation. Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).
  36. Zhao, H., Peeters, B. P. H. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).
  37. Cheng, X., et al. Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy. Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).
  38. Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).
  39. Wang, Y., et al. Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity. PLOS ONE. 12 (9), 0183923(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Rekombinant NDVTanjansiyel Akış FiltrasyonuYoğunluk Gradyanı UltrasantrifüjlemeDiyaliz KasetiKalite Kontrol AnalizleriTCID50 Analiziİmmünofloresan AnalizEmbriyoli Tavuk Yumurtaları
Allantoik Sıvıdan Yüksek Titerli Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Üretimi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.