Allantoik Sıvıdan Yüksek Titerli Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Üretimi

Avian Orthoavulavirus-1 olarak da bilinen Newcastle Hastalığı Virüsü, hem onkolitik bir virüs hem de viral vektörlü bir aşı 1,2,3,4,5,6,7 olarak kullanılma potansiyeline sahip zarflı bir kuş paramiksovirüsüdür. Son zamanlarda, SARS-CoV-2'nin başak proteinini ifade etmek için tasarlanan NDV, fare ve hamster meydan okuma modelleri 7,8,9'da etkili bir burun içi aşı olarak karakterize edilmiştir. Bir kanser immünoterapisi olarak kullanıldığında, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin, özellikle doğal öldürücü hücrelerin, tip I interferon üretiminin ve antitümöre özgü T hücrelerinin^10,11,12,13 üretilmesinin işe alınmasıyla sonuçlanır. Bu güçlü immünostimülatör özelliklere ek olarak, NDV güçlü bir güvenlik profiline ve iyi kurulmuş bir ters genetik sisteme sahiptir^14,15. Bu arzu edilen özellikler, çok sayıda klinik öncesi ve insan klinik çalışmasında NDV'nin değerlendirilmesini sağlamıştır (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)^16,17. Bu son derece umut verici, bağışıklık uyarıcı viral vektörü daha da ilerletmek için, in vivo olarak güvenle uygulanabilen yüksek titreli, ultra saf NDV'nin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı yöntemlere ihtiyaç vardır.

NDV bir kuş paramiksovirüsü olduğundan, embriyonlanmış tavuk yumurtasında en sık çoğaltılır. NDV'yi yaymak için hücre bazlı sistemler mevcut olsa da, çoğu embriyonlanmış tavuk yumurtasında elde edilene benzer titreler üretememiştir¹⁸. Bununla birlikte, yumurta bazlı üretimin uzun olması ve kolayca ölçeklendirilememesi, büyük miktarlarda SPF tavuk yumurtası tedarik edilmesinin sorunlu olabileceği ve yumurta alerjenleri ile kontaminasyon potansiyelinin bulunması da dahil olmak üzere yumurtalarda NDV üretmenin bazı dezavantajları vardır^13,18,19,20 . Son zamanlarda, bir grup, serumsuz ortamda süspansiyonda yetiştirilen Vero hücrelerinin, NDV'nin saflaştırma^21'den önce yumurtalarda elde edilenlerle karşılaştırılabilir titrelere replikasyonunu destekleyebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu, virüsü Vero hücrelerine adapte etmek için virüsün seri geçişini gerektiriyordu ve NDV'yi süspansiyon Vero hücrelerinden arındırmak için bir yöntemin optimizasyonu hala gereklidir²¹.

Daha önce de vurgulandığı gibi, yüksek titreli, in vivo dereceli virüsü arındırmak için kullanılan yöntemler, soru^22'deki virüse bağlı olarak değişir. Rekombinant NDV'nin üretimi için iyi kurulmuş bir ters genetik sistemi mevcuttur. Bir cDNA klonu, yardımcı plazmidler ve T7 RNA polimerazı eksprese eden bir yardımcı virüsün kullanımını içeren bu süreç, daha önce^{ayrıntılı olarak 15,23} olarak tanımlanmıştır. Bu protokol lentojenik veya mezojenik NDV'ye uygulanabilir. Bu protokolde tanımlanan virüs, viral P ve M genleri arasına yerleştirilen denizanası Aequorea victoria'dan gelen yeşil floresan proteinini (GFP) bireysel bir transkripsiyon birimi olarak kodlayan rekombinant bir mezojenik NDV'dir, çünkü bu daha önce yabancı transgen yerleştirme²⁴ için en uygun yer olarak tanımlanmıştır.

Kapalı yöntemler, NDV'nin saflaştırılmasını, 100 ila 500 nm arasında değişen boyutuna ve yoğunluğuna¹⁵ göre özetlemektedir. Bu, yumurtaların alındığı andan itibaren son bir titreye sahip olmaya kadar yaklaşık 3 hafta içinde in vivo dereceli, yüksek titreli NDV stoklarının üretilmesine izin vermiştir. Teğetsel akış filtrasyonu, derinlik filtrasyonu ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme gibi yumurta bazlı virüslerin büyük ölçekli üretiminde sıklıkla kullanılan teknikler tanımlanmıştır ve bu yöntemlerin daha büyük ölçekli üretime çevrilmesini sağlar. NDV'nin saflaştırılması için daha önce tarif edilen teknikler, virüs stabilize edici bir tamponun dahil edilmesi, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme sırasında iyodiksantal kullanımı ve in vivo-grade kalite^15'i sağlamak için çeşitli kalite kontrol önlemlerinin tanımlanması ile geliştirilmiştir. Bu, 0,8 ila 1,0 L allantoik sıvıdan 3 × 10¹⁰ PFU / mL'ye kadar ulaşan titrelere ulaşan in vivo dereceli NDV'nin saflaştırılmasına izin vermiştir.

Hayvanların kullanımını içeren tüm çalışmalar, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'ne uygun olarak Guelph Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm çalışmalar, mezojenik NDV'nin Risk Grubu 2 Patojeni olduğu Kanada'daki bir Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL2) laboratuvarında gerçekleştirilir. NDV'nin amplifikasyonu ve saflaştırılmasında yer alan tüm adımlar, güvenlik ve sterilite amacıyla bir Tip IIA biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.

1. Belirtilen patojensiz embriyonlanmış tavuk yumurtası kullanılarak NDV'nin amplifikasyonu

1. SPF embriyonlanmış tavuk yumurtasının aşılanması
   NOT: Tipik olarak, sekiz düzine SPF embriyonlanmış tavuk yumurtası, bir in vivo dereceli NDV partisi oluşturmak için kullanılır. Nakliye sırasındaki hasarı ve canlılıktaki değişkenliği hesaba katmak için bir veya iki düzine ekstra yumurta sipariş edin. Embriyonlanmış tavuk yumurtası biyolojik materyaldir ve kurumsal kılavuzlara göre ele alınmalıdır. Ancak embriyolar yumurtadan çıkmadığı için kurumsal Hayvan Bakım Komitesi onayı gerekli değildir.
   1. SPF embriyone tavuk yumurtası aldıktan sonra, 37 ° C'de bir yumurta inkübatöründe inkübe edin, 9 gün boyunca% 60 nem. Kuluçka makinesinin yumurtaları her saat otomatik olarak sallayacak/döndürecek şekilde ayarlandığından emin olun.
      NOT: Yumurtalar oda sıcaklığında 24 saate kadar veya 4 °C'de 72 saate kadar saklanabilir; Bununla birlikte, bu embriyo canlılığını azaltabilir.
   2. 8-11 günlük inkübasyondan sonra (ideal olarak 9. günde), embriyo canlılığını belirlemek için yumurtaları mumlayın. Uygulanabilir embriyoların göstergeleri olarak ağ benzeri vaskülatür (Şekil 1A) ve embriyo hareketini arayın. Bu özelliklere sahip olmayan yumurtaları atın (Şekil 1B).
   3. Canlı yumurtalarda, hava kesesi ile embriyo arasındaki arayüzü kurşun kalemle 'X' ile işaretleyin (Şekil 1A). Bu enjeksiyon bölgesinin vaskülatürün delinmesine neden olmayacağından emin olun. İnokulum hazırlanırken işaretli yumurtaları inkübatöre geri koyun.
   4. Tüm SPF embriyonlanmış tavuk yumurtalarını enjekte etmek için gereken virüs miktarını hesaplayın. Her yumurtanın 100 μL'lik bir hacimde 100 PFU virüs aldığından emin olun; Virüsü fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 × 10³ PFU / mL konsantrasyonuna kadar seyreltin. Virüs uygulamasındaki yanlışlıkları hesaba katmak için inokulumun ekstra% 20'sini hazırlayın.
   5. Antistatik bir mendil kullanarak, işaretli yumurtaların üst kısımlarını% 70 etanol içinde seyreltilmiş% 10'luk bir iyot çözeltisi ile temizleyin. Çözeltinin kuruması için yaklaşık 1-2 dakika bekleyin.
   6. Bir çift steril keskin cımbız kullanarak kabuğu dikkatlice delin. Cımbızları yumurtalar arasındaki% 70 etanol içinde sterilize edin.
   7. 1 mL'lik bir şırınga ve 25 G'lik bir iğne kullanarak, 1.1.4 adımında hazırlanan inokulumun 100 μL'sini koryoallantoik boşluğa enjekte edin (Şekil 1C). İğne ile yumurtaya yaklaşık 90° açıyla yaklaşın. İğneyi koryoallantoik membranın hemen üstüne yerleştirin.
   8. Aşılamayı takiben, delinme bölgesini örtmek ve yumurtaları inkübatöre geri döndürmek için oje kullanın. Sallanma ayarının aşılamadan 24 saat sonrasına kadar AÇIK olduğundan emin olun.
   9. Aşılamadan 24 saat sonra yumurta canlılığını kontrol edin. Vaskülatürü olmayan ölü yumurtaları koryoallantoik membranda ve embriyo hareketinde atın (Şekil 1B).
      NOT: Bu yumurtalar NDV'den değil, aşılama işlemi nedeniyle ölmüştür.
   10. Yumurtaları inkübatöre geri döndürün, allantoik sıvının yumurta proteinleri ile kirlenmesini önlemek için rocker KAPALI konuma gelir.
   11. Ölü yumurtaları tanımlamak için yumurtaları her 12-24 saatte bir 1.1.9 adımında açıklandığı gibi kontrol edin. Otolizi en aza indirmek için aşılamadan 24 saat sonra ölen yumurtaları 4 ° C'ye taşıyın. Allantoik sıvıyı soğuduktan 2-12 saat sonra hasat edin.
   12. Yumurtaları en az 72 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
       NOT: NDV'nin mezojenik bir suşunu yayıyorsanız, optimum inkübasyon süresi 60-72 saattir, çünkü uzun inkübasyon süreleri allantoik sıvının netliğinin azalması nedeniyle saflaştırma işlemini bozabilir. Bu konu, lentojenik NDV suşlarını çoğaltırken, embriyoyu öldürmek için çok daha uzun sürdükleri için önemli değildir.
   13. Uygun kuluçka döneminden sonra, allantoik sıvıyı toplamadan önce kalan yumurtaları 2-12 saat boyunca 4 ° C'ye taşıyın.
2. NDV içeren allantoik sıvının toplanması
   1. Soğutulmuş yumurtaları biyogüvenlik kabinine taşıyın. Yumurtaların üst kısımlarını% 70 etanol ile temizleyin.
   2. Hava kesesinin bulunduğu yumurtanın apikal tarafını kırmak için steril cımbız ve cerrahi makas kullanın.
   3. Korioallantoik membranı ortaya çıkarmak için kabuğu çıkarın (Şekil 1D).
   4. Membranı dikkatlice delin ve allantoik boşluğu açığa çıkarmak için tekrar soyun (Şekil 1E). Yumurta sarısı kesesinin yanlışlıkla delinmediğinden ve bunun yumurtayı bozacağından emin olun.
   5. Embriyoyu yakalamak ve embriyonik kesesi açmak için künt forseps kullanın.
      NOT: Embriyonik kese içindeki sıvı da NDV içerir.
   6. Embriyoyu forseps ile bastırın ve 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak allantoik sıvıyı toplayın.
   7. Allantoik sıvıyı buz üzerinde berraklaşana kadar 15 mL konik tüplerde saklayın.
      NOT: Allantoik sıvı sarı ise, yumurta sarısı kesesi tehlikeye girmiştir ve allantoik sıvı atılmalıdır.
   8. Allantoik sıvıyı içeren konik tüpleri 1.500 × g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
   9. Duraklama noktası: Aliquot arıtılmış allantoik sıvıyı 50 mL konik tüplere koyun ve uzun süreli depolama için -80 ° C'de saklayın (örneğin, haftalar ila aylar), virüsü dondurarak çözülmenin sert etkilerinden korumak için sıvıyı% 5'lik bir nihai konsantrasyona kadar sakkaroz ile takviye edin. Alternatif olarak, kısa süreli depolama için (örneğin, 1-3 gün), allantoik sıvıyı sakkaroz (son% 5) veya 3x Mannitol-Lizin (ML) tamponu (% 15 Mannitol,% 3 Lizin; tampon tarifleri için Ek Tablo S1'e bakınız) ile destekleyerek, 4 ° C'de depolamadan önce 1x (% 5 Mannitol,% 1 Lizin) nihai konsantrasyonunu elde edin.

2. NDV'nin allantoik sıvıdan saflaştırılması

1. Allantoik sıvının derinlik filtrasyonu
   1. Arıtılmış allantoik sıvıyı -80 ° C'de saklayın ve saflaştırmadan önceki gece 4 ° C'de çözülür.
   2. Biyolojik bir güvenlik kabininde, boru ve peristaltik pompayı Şekil 2'de gösterildiği gibi ayarlayın.
   3. Henüz yapılmadıysa, allantoik sıvıyı 3x ML tampon ile 1x'lik bir son konsantrasyona birleştirin.
   4. Derinlik filtresini takmadan önce, sistemden 50 mL'lik 0,5 M NaOH'yi bir atık kabına geçirerek boruyu sterilize edin.
   5. 100 mL steril, moleküler sınıf suyu sistemden ve atık kabına geçirerek boruyu durulayın.
      NOT: NaOH NDV'yi devre dışı bırakacağından, virüs içeren allantoik sıvıyı vermeden önce hatların yeterince yıkanması önemlidir.
   6. Sistem, içinden 50 mL PBS çalıştırarak, tüpte yaklaşık 5 mL PBS kaldığında pompayı durdurarak sistemi astarlayın.
   7. Boruya 1-3 μM tutma derecesine sahip derinlik filtresi takın ve filtreyi havalandırmak için derinlik filtresinin apikal tarafındaki ikinci kapağı çıkarın. Sistem üzerinden ek 50 mL PBS çalıştırmaya başlayın.
   8. PBS, filtrenin üst kısmındaki havalandırma deliğinden akmaya başladığında, bağlantı noktasını kapatın ve PBS'yi hatlar boyunca akmaya devam edin.
      NOT: Küçük hava kabarcıkları kabul edilebilir, ancak büyük miktarlarda havanın varlığı, filtrenin adım 2.1.7 ve 2.1.8'de açıklandığı gibi tekrar havalandırılmasını gerektirecektir.
   9. Tüpte yaklaşık 5 mL PBS kaldığında pompayı durdurun.
   10. Atık kabını yeni bir steril toplama kabı ile değiştirin ve derinlik filtresinden allantoik sıvı çalıştırmaya başlayın.
       NOT: Basınç 10 psi'yi geçmemelidir, çünkü bu virüsün kesilmesine neden olur. Basınç, pompanın akış hızını azaltarak veya artırarak manipüle edilebilir. Basınç 10 psi'yi aşmaya başlarsa ve akış hızı daha fazla azaltılamazsa, yeni bir derinlik filtresi kullanılmalıdır. Bu durumda, allantoik sıvı akışına devam etmeden önce 2.1.6-2.1.8 adımları uygulanmalıdır.
   11. Tüm allantoik sıvı filtreden geçtikten sonra, virüs iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için hatlar boyunca 50 mL 1x ML tampon çalıştırın.
   12. Hatlar kuruyana kadar sıvıyı toplayın. Virüsü gece boyunca veya 4 °C'de 36 saate kadar saklayın.
       NOT: Virüs derinlik filtrelendikten sonra, derinlik filtrasyonunu tamamladıktan sonraki 36 saat içinde saflaştırma işlemine devam edin.
   13. Derinlik filtresinin bağlantısını kesin ve 0,5 M NaOH'de depolamadan önce sistemden 100 mL 0,5 M NaOH, 400 PPM ağartıcı 42 °C'ye kadar önceden ısıtılmış olarak çalıştırarak boruyu sterilize edin.
2. NDV konsantrasyonu için teğetsel akış filtrasyonu
   1. Kasetin bileşenlerini Şekil 3A'da gösterildiği gibi (ve daha önce^{gösterildiği gibi 25}) biyolojik bir güvenlik kabininde monte edin.
      NOT: Manifold ve uç plaka deterjanla yıkanmalı ve kullanımdan önce kurutulmalıdır. Silikon contalar yeniden kullanılabilir ve kasetle birlikte 0,5 M NaOH'de saklanmalıdır.
   2. Teğetsel Akışlı Filtrasyon (TFF) (çapraz akışlı filtreleme olarak da bilinir) sistemini 'açık' bir konformasyonda kurmak (Şekil 3B).
      1. İlk kez bir kaset kullanıyorsanız, TFF kasetini Elüsyon konformasyonuna monte edin ve 100 mL steril, moleküler sınıf su ile yıkayın (Şekil 3C).
      2. Rezervuar tankında sadece 5 mL su kaldığında, pompayı duraklatın ve TFF sistem kurulumunu kapalı bir konformasyona değiştirin (Şekil 3D).
      3. Rezervuara 100 mL 0,5 M NaOH, 42 °C'ye kadar önceden ısıtılmış 400 PPM ağartıcı ekleyin ve 30-60 dakika boyunca sistemde döngü yapın.
      4. Akışı duraklatın ve TFF sistemini elüsyon kurulumuna geri döndürerek temizleme solüsyonunu etkisiz hale getirmek için akışı sürdürün.
      5. Rezervuarda yaklaşık 5 mL kaldığında, pompayı duraklatın ve sistemi durulamak için 100 mL steril, moleküler sınıf su ekleyin.
      6. Rezervuarda yaklaşık 5 mL kaldığında, pompayı duraklatın ve TFF sistemini açık konformasyona yerleştirin (Şekil 3B). Adım 2.2.3 ile devam edin.
   3. Peristaltik pompayı kullanarak sistemden 100 mL 0,5 M NaOH geçirerek kaseti ve boruyu sterilize edin. Kaset bütünlüğünü korumak için basıncın 30 psi'yi geçmediğinden emin olun.
   4. Rezervuarda yaklaşık 5 mL 0,5 M NaOH kaldığında pompayı duraklatın.
   5. Rezervuara 100 mL steril, moleküler sınıf su ekleyin ve sıvıyı kasetten geçirmeye devam edin. Virüsün inaktivasyonunu önlemek için tüm NaOH'yi rezervuarın yanlarından yıkamak için rezervuarı döndürün. Rezervuar yıkama adımını tekrarlayın.
   6. Rezervuarda yaklaşık 5 mL steril, moleküler sınıf su kaldığında, pompayı duraklatın.
   7. Rezervuara 100 mL PBS ekleyin, steril, moleküler sınıf suyun yanlardan yıkanmasını sağlamak için döner. Kasetten sıvı akışını sürdürün.
   8. Rezervuarda yaklaşık 5 mL kaldığında, pompayı duraklatın, rezervuara derinlik filtreli allantoik sıvı ekleyin ve pompa akışına devam edin.
   9. Virüsün kesilmesini önlemek için 10 psi'yi geçmediğinden emin olmak için basınç göstergesi 1'i (Şekil 3B) izleyin. Peristaltik pompanın hızının bir kombinasyonunu kullanın ve atıklara elüsyonu artırmak için C-kelepçelerinin kullanın.
      NOT: Peristaltik pompanın ve C-kelepçelerinin hızının birleştirilmesi, basıncın artmasına neden olacaktır.
   10. Rezervuarda 50-100 mL allantoik sıvı kaldığında, 150-200mL 1x ML tampon ekleyerek tampon değişimi gerçekleştirmek için pompayı duraklatın.
   11. Pompa akışını sürdürün, 10 psi'yi geçmediğinden emin olmak için basınç göstergesi 1'i (Şekil 3B) tekrar izleyin.
   12. Rezervuarda 5-10 mL kaldığında, pompayı duraklatın.
   13. İki C-kelepçesi kullanarak, Şekil 3C'de gösterildiği gibi iki atık çizgisini kapatın.
   14. Rezervuarı besleyen retentat hattını ayırın ve 50 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin (Şekil 3C).
   15. Pompanın akışını sürdürün, rezervuar tankında birkaç damla sıvı kaldığında duraklayın.
   16. C-kelepçelerini atık hatlarından çıkarın ve retentat besleme hattını rezervuar tankına yeniden takın (Şekil 3B).
   17. 20-25 mL 1x ML tampon ekleyin ve rezervuar tankında yaklaşık 5 mL kalana kadar pompa akışını sürdürün.
   18. 2.2.13 ile 2.2.16 arasındaki adımları yineleyin.
       NOT: Virüs verimini artırmak için 2.2.17 ve 2.2.13 ila 2.2.16 arasındaki adımlar tekrarlanarak 3^. bir elüsyon yapılabilir. Bununla birlikte, virüsün çoğu ilk iki salınımda bulunur.
   19. Salınımları bitirdikten sonra, virüsü buzun üzerine veya 4 ° C'ye yerleştirin.
   20. Hatları temizlemek için, sistemi, Şekil 3B'de gösterildiği gibi atık çizgileri rezervuara geri beslenen kapalı döngü formatı ( Şekil 3D) olacak şekilde ayarlayın.
   21. 250 mL 0,5 M NaOH, 42 °C'ye önceden ısıtılmış 400 PPM ağartıcı ekleyerek sistemi temizlemeye devam edin.
   22. Temizleme solüsyonunu gece boyunca sistemden geçirin.
       NOT: Temizleme solüsyonu yeniden sirküle edilirken, pompa 50 mL/dak hızda çalıştırılırsa, yaklaşık 5 psi'lik bir basınç gözlenmelidir. Basınç bunu aşarsa, kaset kirlidir ve temizleme çözeltisi değiştirilmeli ve işlem tekrarlanmalıdır.
   23. Hem atık hatlarını hem de retentate hattını bir atık konteynerine yönlendirerek temizleme solüsyonunu etkisiz hale getirin.
   24. Rezervuara 400-500 mL steril su ekleyin ve sistemden ve atık kaplarına akıtın.
   25. Rezervuarda yaklaşık 5 mL bırakıldığında, pompayı duraklatın ve rezervuar kabına 100-200 mL 0,5 M NaOH ekleyin ve rezervuar kabını yıkamak için çözeltiyi döndürün.
   26. Rezervuar neredeyse boşaldığında, adım 2.2.23'ü iki kez daha tekrarlayın.
   27. TFF kurulumunu sökün, TFF kasetini ve contalarını 0,5 M NaOH'luk küçük bir hacimde 4 °C'de yeniden kapatılabilir bir plastik torbada saklayın.
       NOT: Borular 0,5 M NaOH'ye batırılmış oda sıcaklığında saklanabilir.
3. İyodiksanol yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme
   1. Ultra santrifüjü açın ve 4 ° C'ye kadar ön soğumaya ayarlayın. İstenilen rotoru da 4 °C'de önceden soğutun ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: Rotorlar 4 °C'de saklanmalıdır.
   2. PBS ve 3x ML Tamponu ile 1x nihai ML tampon konsantrasyonuna seyrelterek% 40,% 20 ve% 10 iyodiksanol çözeltisi üretmek için% 60 iyodiksanol çözeltisini (satın alma sırasındaki konsantrasyon) kullanın.
   3. 13,2 mL'lik bir üstte, üstü açık, ince duvarlı ultrasantrifüj tüpünde, sırasıyla @, ve iyodiksananol çözeltilerinin 0,5 mL, 2,5 mL ve 2,5 mL'sini kaplayın (Şekil 4A).
      NOT: Ultra santrifüj tüpünün yan tarafına yatırılması ve çözeltinin yavaşça dışarı atılması, iki gradyan katmanının karıştırılması riskini önemli ölçüde azaltacaktır. Her katmanın ayrılması, gradyanın her katmanı arasında görülebilen bir "hale" ile belirgin olmalıdır.
   4. Çeşitli degrade katmanlarının arabirimlerini işaretlemek için bir işaretleyici kalem kullanın.
   5. TFF prosedüründen salınan virüsün 6-6.5 mL tabakası yoğunluk gradyanı üzerinden. Yoğunluk gradyanını bozmamak için virüsü adım 2.3.3'te açıklandığı gibi dikkatlice ekleyin.
   6. Ultra santrifüj tüplerini, uçları birbirlerinden 0,01 g uzakta dengelemek için üstü açık bir kantar kullanarak sallanan kova rotorunun kesici uçlarına yükleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). Ağırlık farklılıklarını hesaba katmak için PBS veya ekstra virüs temizleyici kullanın.
   7. Borular dengelendikten sonra, tüpleri kapatın ve rotora yükleyin.
   8. 4 °C'de 125.000 × g'de 1,5 saat santrifüj.
      NOT: Bu, gecikmeli başlatma özelliğine sahip bir ultrasantrifüj mevcutsa gece boyunca gerçekleştirilebilir.
   9. Ultra santrifüjlemeyi takiben, bir çift steril forseps kullanarak tüpleri çıkarın. ile gradyanları arasındaki hedef bandı (büyük bir bant) arayın (Şekil 4B).
   10. Bir imbikli stand kullanarak tüpü bir beherin üstüne asın.
   11. 5 mL'lik bir şırıngaya 18 G x 1,5 inçlik bir iğne takın ve ultrasantrifüj tüpünün yan tarafını delin.
       NOT: Tüp, hedef bandın biraz altında, iğne yukarı doğru açılı olacak şekilde delinmeli ve hedef banda girecek şekilde yukarı doğru eğimlendirilmelidir.
   12. Hedef bandı çıkarmak için pistonu yavaşça uzatın.
       NOT: Çıkarılan virüsü en üst düzeye çıkarmak için iğneyi hedef bant içinde hareket ettirin. Diğer bantların veya kalıntıların hedef bantla karışmamasına dikkat edin ve fazla diyaliz kasetinin kullanılmasına yol açacağından fazla çözelti almaktan kaçının.
   13. Hedef bant çıkarıldıktan sonra, iğneyi çıkarın ve kalan çözeltinin atık kabına akmasına izin verin. Hedef bandı, diğer tüm ultrasantrifüj tüplerinden tüm bantlar çıkarılana kadar 50 mL'lik bir konik tüpe dağıtın.
   14. Tüm ultrasantrifüj tüplerinden tüm hedef bantlar çıkarılana kadar 2.3.10-2.3.13 adımlarını tekrarlayın.
   15. 2.3.10 ila 2.3.13 arasındaki adımlarda açıklandığı gibi hedef bantları ayıklamaya alternatif yaklaşım
       1. Hedef bandı kaplayan sıvıyı pipet kullanarak yavaşça çıkarın. Hedef banda ulaştıktan sonra, bir pipet kullanarak çıkarın ve virüsü 50 mL'lik bir konik tüpte saklayın.
          NOT: Bu, ultrasantrifüj tüplerinin yeniden kullanılmasına izin verir.
4. İyodiksanolün virüs çözeltisinden uzaklaştırılması
   NOT: NDV içeren bant,% 15 ila% 16 arasında bir iyodiksanol yoğunluğunda görünür. Çözeltideki iyotiksanol konsantrasyonu, standart bir eğriye atıfta bulunarak 340 nm'de absorbans ölçülerek belirlenebilir (Ek Şekil S1). Bu konsantrasyondaki iyodiksanol çözeltileri C57BL / 6 farelere uygulandığında herhangi bir yan etki veya akut toksisite gözlenmediği için bu adım atlanabilir.
   1. 0,5-3 mL 10 kDa molekül ağırlıklı kesilmiş diyaliz kasetini PBS'ye 1 dakika batırarak önceden ıslatın.
      NOT: Diyaliz zarı pürüzsüzden fırfırlı veya engebeli bir görünüme sahip olmalıdır. Ekstrakte edilen virüsün hacmi 10 mL'yi aşarsa, iki adet 0.5-3 mL diyaliz kaseti veya 5-12 mL'lik bir diyaliz kaseti kullanılmalıdır.
   2. Uygun olduğunda, virüsü 50 mL konik tüpten toplamak için 5 veya 10 mL'lik bir şırınga ve 18 G x 1,5 inç künt dolgu iğnesi kullanın.
   3. Diyaliz kasetine girmek için şırıngayı kullanın, zarı delmemeye dikkat edin ve virüsü enjekte edin.
      NOT: Diyaliz kaseti, kasetteki hava cebinin konumunu değiştirmek için döndürülebilir. İğneyi kasetten çıkarmadan önce hava cebi çıkarılmalıdır.
   4. 1 L'lik bir beheri steril 1x PBS ile doldurun, içine bir karıştırma çubuğu ve diyaliz kaseti yerleştirin ve örtün. Hafifçe karıştırarak 4 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Diyaliz kasetini PBS'de yüzecek şekilde takmak için ekstrüde polistiren köpük ve elastik bir bant kullanın. Kaset, ML arabelleği nedeniyle hafifçe şişebilir.
   5. 1-2 saat sonra, taze 1x PBS ile değiştirin ve hafif karıştırma ile 8-10 saat daha 4 ° C'de inkübe etmeye devam edin.
      NOT: Bu bir gecede de yapılabilir.
   6. Bir kez daha taze 1x PBS ile değiştirin, oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edin.
5. Virüs çözeltisinin konsantrasyonu
   1. Diyaliz kasetini diyaliz tamponundan çıkarın (Şekil 4C) ve küçük, kapatılabilir plastik bir torbaya koyun. Diyaliz kasetinin tamamen suya batırılması için 15-25 mL% 40 20.000 MW polietilen glikol ekleyin.
   2. Sallanma ile oda sıcaklığında inkübe edin. 5 veya 10 mL'lik bir şırınga ve 18 G x 1,5 inç künt dolgu iğnesi kullanarak kasetteki virüs hacmini periyodik olarak kontrol edin.
      NOT: Virüsü konsantre etmek için gereken süre, başlangıç hacmine ve istenen bitiş hacmine bağlı olarak değişecektir. Tipik olarak, istenen son hacim, allantoik sıvının başlangıç hacminden bağımsız olarak 1 ila 1,5 mL arasındadır. Hacmi kontrol ederken, aynı portu kullanmamaya dikkat edin, çünkü bu port bütünlüğünü tehlikeye atar ve polietilen glikol çözeltisi ile virüsün karışmasına neden olabilir.
   3. Konsantre virüsü diyaliz kasetinden çıkarmadan önce, kaseti 1x PBS'de kısaca durulayın ve 18 G x 1,5 inç künt dolgu iğnesini hava ile doldurun.
   4. Hava dolu şırıngayı diyaliz kasetine yerleştirin ve pistonu bastırın. Aparatı döndürün, böylece konsantre virüs, verilen havanın hiçbirini çıkarmadan çıkarılabilir.
   5. Konsantre virüsü, dağıtılan hacme dikkat ederek 50 mL'lik bir konik tüpe dağıtın.
   6. Aynı şırıngayı ve iğneyi kullanarak, diyaliz kasetine uygun miktarda% 60 sakkaroz enjekte edin, böylece daha önce çıkarılan virüsle birleştirildiğinde,% 5'lik bir sakkaroz konsantrasyonunda olur.
   7. Membrana yapışmış olabilecek artık virüsü yerinden çıkarmak için zara masaj yapmak için eldivenli parmaklarınızı kullanın, zarar vermemeye dikkat edin. Yerinden çıkarma işlemini kolaylaştırmak için diyaliz kasetindeki fazla havanın bir kısmını çıkarın.
   8. Bu yıkamayı zaten 50 mL konik tüpte bulunan virüsle birleştirin.
      NOT: Virüs şu anda% 5 sakkarozdadır ve 20 μL, 50 μL, 100 μL veya 200 μL alikotlara dağıtılmaya ve -80 ° C'de saklanmaya hazırdır. Alternatif olarak, uzun süreli depolama için, NDV liyofilize edilebilir ve bölüm 2.6'da açıklandığı gibi 4 ° C'de saklanabilir.
6. NDV'nin liyofilizasyonu
   1. 16 saat boyunca 44 × 10-3 MBAR ve ^- 52 °C'de 1.5 mL santrifüj tüplerinde veya 15 mL konik tüplerde aliquoted edilen virüsü liyofilize edin.
   2. Liyofilize numuneleri viral titrede önemli bir azalma olmadan 4 ° C'de saklayın.

3. Kalite kontrol tahlilleri

1. Genom doğrulaması için viral RNA izolasyonu ve ters transkripsiyon PCR
   1. 20 μL virüs aliquot'u çözün. Kit ile birlikte verilen viral RNA izolasyon protokolünü takip edin.
   2. İzole RNA'yı derhal ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) için bir şablon olarak kullanın veya -80 ° C'de saklayın.
   3. Ters transkripsiyon reaksiyonlarını, üretici tarafından sağlanan protokolde açıklandığı gibi hazırlayın.
   4. NDV patotipini (Tablo 1, F protein primer seti) ve gerekli gen kontrol elemanlarının varlığını (Tablo 1, Transgen primer seti) doğrulamak için elde edilen cDNA'yı çeşitli kalite kontrol PCR reaksiyonları için bir şablon olarak kullanın.
      NOT: Astarlar, yayılan NDV suşuna göre tasarlanmalıdır.
      1. Patotipin ana belirleyicisi olan F proteini bölünme bölgesini sıralamak için F proteini primer setini kullanın (Tablo 1). 435 baz çifti uzunluğunda bir PCR ürünü arayın.
         NOT: Burada, primerler NDV'nin LaSota suşuna göre tasarlanmıştır (Genbank katılımı AF077761.1). Optimal transgen ekspresyonunun, P ve M genleri²⁴ arasına yabancı bir transgen yerleştirildiğinde meydana geldiği iyi bilinmektedir.
      2. Transgenin gen başlangıcının ve gen sonu elemanlarının bütünlüğünü doğrulamak için transgen primer setini kullanın. Gen başlangıcını ve gen sonu dizi bütünlüğünü doğrulamak için PCR ürününü sıralayın.
   5. DNA dizilimi için PCR ürünlerini gönderin ve bunları homoloji şablonuyla karşılaştırın.
2. Kirletici proteinleri tespit etmek için SDS PAGE ve Coomassie boyama
   1. İlk olarak% 6 ve% 15 poliakrilamid çözeltileri hazırlayarak bir yoğunluk gradyanı SDS PAGE jeli dökün (Ek Tablo S1). 'lik çözeltinin 5 mL'sini ve ardından %6'lık çözeltinin 5 mL'sini çekmek için 10 mL'lik bir pipet kullanın.
   2. Pipetleri çözeltiden çıkarın ve kısa bir süre hava çekerek bir hava kabarcığı oluşturun.
      NOT: Hava kabarcığı yukarı doğru hareket ettikçe, bu, SDS PAGE gradyanını oluşturmak için çözümü karıştırır.
   3. Çözeltiyi döküm aparatına dağıtın ve 30 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin.
   4. 20 μL'lik son bir hacimde, bir virüs alikotunu 4x indirgeyici tamponla (Ek Tablo S1) birleştirin, böylece nihai konsantrasyon 1x olur ve bir termosiklusta 95 ° C'de 10 dakika kaynatın. Virüsün en az 1 × 10⁷ PFU'sunu yükleyin.
   5. SDS PAGE'yi çalışan arabelleğe (Ek Tablo S1) batırın ve örnekleri yükleyin.
   6. Jeli 1-1,5 saat boyunca 120 V'ta çalıştırın.
   7. Jeli çalışan tampondan çıkarın ve daha küçük bir kaba aktarın.
   8. Jeli örtmek için Coomassie boyama çözeltisi (Ek Tablo S1) ekleyin. Oda sıcaklığında 4-5 saat inkübe edin.
   9. Boyama çözeltisini çıkarın ve ajitasyonla oda sıcaklığında 4-8 saat inkübe ederek destain çözeltisi (Ek Tablo S1) ekleyin. Destain çözümünü üç ila dört kez değiştirin.
      NOT: Jel berrak olmalı ve rengi lekelenmeden önceki gibi olmalıdır.
   10. Jeli kolorimetrik bir ayarda görüntüleyin. Allantoik sıvı ve saflaştırılmış virüs örnekleri içeren Coomassie boyalı SDS PAGE jelinin temsili bir görüntüsü için Şekil 5'e bakınız.
3. Enfeksiyöz viral titrenin medyan doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID₅₀) ve immünofloresan testi ile nicelleştirilmesi
   NOT: Vero hücreleri DF1 hücrelerine alternatif olarak kullanılabilir; Bununla birlikte, sitopatik etki (CPE) Vero hücrelerinde daha az belirgindir. Bu tahlilde fusojeniteyi artıran L289A mutasyonunu barındıran ve P ve M genleri arasındaki GFP'yi eksprese eden NDV kullanılmaktadır.
   1. % 2 fetal sığır serumu (FBS) ve 125 μg / mL tripsin ile desteklenmiş DMEM'i kullanmadan bir gün önce 80 μL'lik bir hacimde 20.000 hücre / kuyucukta 96 kuyucuklu bir DF1 hücresi plakası tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_{2'de inkübe edin}.
   2. Ertesi gün, buz üzerinde 20 μL aliquot virüs çözülür.
   3. Seri seyreltmeler hazırlamak için 1,5 mL tüpler kullanın. ^10-2 seyreltme hazırlamak için virüsün 10 μL'sini 990 μL PBS ile seyrelterek başlayın. En az 10-10'a kadar, ⁹⁰⁰ μL PBS ve önceki seyreltmenin 100 μL'sinin eklenmesiyle yapılan diğer tüm seyreltmeleri hazırlayın.
      NOT: Seyreltmeler arasında hareket ederken yeni bir pipet ucu kullanın.
   4. Şekil 6'da gösterildiği gibi 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyusunu enfekte etmek için her seyreltmenin 20 μL'sini kullanın.
      NOT: Her kuyudaki son hacim 100 μL olacaktır.
   5. CPE / GFP varlığını incelemeden veya dolaylı bir immünofloresan testi (IFA) yapmadan önce plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de en az 48 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Bu kültür koşulları altında, CPE 10 saat sonra belirgindir (Şekil 7A-D), sonraki 24 saat boyunca artar (Şekil 7E-H). GFP veya CPE ile puanlama yapılırsa plaka CPE'nin yoğunluğunu artırmak için daha uzun süre inkübe edilebilir.
      1. CPE veya GFP ile puanlama yapılıyorsa ve IFA gerçekleştirmiyorsa, adım 3.3.18.1'e atlayın.
   6. IFA yapıyorsanız, hücreleri 100 μL 1x PBS ile iki kez durulayın.
   7. Her bir oyuğa PBS'de seyreltilmiş 100 μL% 4'lük paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
   8. Hücreleri her biri 3x 5 dakika 100 μL 1x PBS,% 0.1 Ara 20 (% 0.1 PBS-T) ile yıkayın.
   9. PBS'de 100 μL% 0.1 NP-40 ilavesiyle hücreleri geçirgenleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
   10. Hücreleri 100 μL% 0.1 PBS-T ile 3x 5 dakika yıkayın.
   11. Oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °C'de gece boyunca% 0.1 PBS-T'de seyreltilmiş % 5 (V / V) normal keçi serumundan oluşan 100 μL bloke tamponu ekleyin.
   12. % 0.1 PBS-T'de seyreltilmiş birincil fare anti-NDV ribonükleoprotein antikorunun kuyucuğuna 100 μL ilave edilerek 1 μg / mL'ye kadar oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
   13. Hücreleri% 0.1 PBS-T'lik 100 μL'de 5 dakika boyunca 3 kat yıkayın.
   14. %0,1 PBS-T'de seyreltilmiş AlexaFluor 488 Goat fare karşıtı ikincil antikorun 100 μL'sini 2 μg/mL'ye ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
   15. Hücreleri% 0.1 PBS-T'lik 100 μL'de 5 dakika boyunca 3 kat yıkayın.
   16. Son yıkamadan sonra, hücreleri% 0.1 PBS-T'nin 100 μL'sinde bırakın.
   17. Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak kuyucukları görüntüleyin.
   18. IFA yaparken, negatif kontrol kuyularında görülenden daha büyük floresan arayın, bu da kuyunun Şekil 8'de gösterildiği gibi NDV için pozitif olduğunu gösterir.
       1. NDV CPE'yi karakterize eden sinsiti ve büyük, yuvarlak hücrelerin varlığını arayın. GFP'yi ifade eden bir virüsle enfekte olmuş skorlama kuyuları varsa, GFP'nin varlığını arayın.
   19. Virüsün PFU/mL'sini belirlemek için Spearman-Karber titre hesaplayıcısı^26'ya uygun bilgileri girin (Tablo 2). Örnek TCID₅₀ titre plakası için Şekil 6'ya bakın.
4. Viral titrenin kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ile ölçülmesi
   NOT: Zamandan tasarruf etmek ve numunelerin manipülasyonunu azaltmak için tek adımlı bir qRT-PCR kiti önerilir. Prob tabanlı bir tahlil, virüs dizileri için algılamanın özgüllüğünü arttırmak için kullanılır.
   1. Virüs dizilerinin bilinen bir miktarının standart bir eğrisini oluşturun (Ek Şekil S2A,B).
      NOT: Bu, NDV L geninin sentetik 500 bp çift sarmallı DNA fragmanı satın alınarak yapılabilir. NDV L geninin 500 bp fragmanının dizisi Ek Şekil S2C'de görülebilir.
   2. Virüs DNA fragmanının miktarını (genellikle üreticiler tarafından nanogram veya femtomol olarak sağlanır), Avogadro'nun sayısını ve molleri molekül formülüne (Eq (1)) kullanarak DNA fragmanının molekül sayısına veya kopyalarına dönüştürün.
      (1)
   3. 1.00'den başlayarak 10.00 kopyadan başlayarak 10.00 × 10^{0 kopyaya} ×kadar bilinen virüs DNA fragmanı kopyalarının on kat seyreltme serisini hazırlayarak standart eğri örneklerini hazırlayın.
   4. Bilinmeyen örneklerdeki NDV RNA miktarını belirlemek için, bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak NDV RNA'yı ekstrakte edin. Kitle birlikte verilen protokolü izleyin. RNA ekstrakte edildikten sonra, tek adımlı qRT-PCR kitinde sağlanan önerilen protokolle devam edin.
   5. Reaksiyonları aşağıdaki sıcaklık ve döngü koşullarına sahip gerçek zamanlı bir PCR cihazında çalıştırın: 1) 10 dakika boyunca 55 ° C'de bir ters transkripsiyon döngüsü; 2) 1 dakika boyunca 95 ° C'de bir başlangıç denatürasyon döngüsü; ve 3) 40 döngü denatürasyon (10 s için 95 ° C), uzatma (30 s için 60 ° C) ve floresan sinyal alımı.
   6. qRT-PCR testi tamamlandıktan sonra, gerçek zamanlı PCR cihazı yazılımını kullanarak standart eğri örneklerine dayalı standart eğriyi oluşturun (Ek Şekil S2A, B).
      NOT: Yazılım ayrıca standart eğriye dayanarak bilinmeyen örneklerdeki NDV RNA miktarını da hesaplayacaktır.
5. Farelerde akut toksisite için güvenlik testi
   1. Akut toksisiteyi değerlendirmek için 1 × 10 8 PFU virüsü kuyruk damarı yoluyla intravenöz olarak üç⁸ haftalık BALB / C faresine enjekte edin.
   2. Fareleri kilo kaybı (% >20), kambur duruş, karıştırılmış paltolar, uyuşukluk ve solunumdaki değişiklikler gibi olumsuz olaylar açısından izleyin. İlk 48 saat boyunca günde üç ila dört kez değerlendirin. Farelerin 48 saat sonra iyileşmeye başlaması gerektiğinden, tamamen iyileşene kadar günde bir ila iki kez izleyin.
      1. Gerektiğinde salini deri altından ve destekleyici bakımdan uygulayın. Örneğin, geri kazanım diyet jeli, fıstık ezmesi ile takviye edin veya ısı pucks kullanın. Hayvan bakımı kurumsal kılavuzlarında belirtildiği gibi, son nokta kriterlerine ulaşmış ötenazi fareleri, izofluran doz aşımı ve ardından servikal çıkık ile takip eder.

Allantoik sıvı hasadı
Allantoik sıvı embriyonlanmış tavuk yumurtasından toplandığından, net ve şeffaf görünmelidir. Sıvı opak ve sarı görünüyorsa, bu kirleticilerin varlığını gösterir. Saflaştırma sırasında bu allantoik sıvının dahil edilmesi, basınç, virüsün kesilmesine ve bulaşıcı virüsün kaybına neden olacak şekilde hızla yükselip 10 psi'yi geçeceğinden, saflaştırma işlemini engelleyecektir. Kanlı görünen allantoik sıvı, yumurtaların çok fazla PFU virüsü ile aşılandığını göstermektedir. Bu yumurta grubundan elde edilen verim beklenenden önemli ölçüde daha düşük olacaktır ve bu virüsün in vivo olarak kullanılabilmesi olası değildir. Lentojenik NDV ile aşılanmış yumurtalar, Şekil 1'de gösterildiği gibi, 72 saat sonra hala belirgin vaskülatüre sahip olmalı ve embriyolar ölmemiş olmalıdır. Eğer varsa, bu embriyonun bir şekilde hasar gördüğünü veya kirlendiğini gösterir.

İyodiksanol yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme
Ultrasantrifüjlemeyi takiben, ila gradyanlar arasında yüksek titreli, beyaz, NDV içeren bir bant yerleştirilmelidir (Şekil 4B).

SDS-PAGE jellerinin Coomassie boyası
Şekil 5 , saflaştırılmamış (Şerit 2) ve saflaştırılmış virüs stoğu (Şerit 3) arasındaki farkı göstermektedir. İkisinin karşılaştırılması, kirletici protein bantlarının yoğunluğunda ve saflaştırılmış virüs stokunda baskın NDV bantlarının ortaya çıkmasında önemli bir azalma olduğunu göstermektedir.

TCID 50 ile viral titrenin nicelleştirilmesi
Konsantre bir NDV stoğunu titretirken önerilen koşullar kullanılıyorsa, CPE 24 saat sonra belirgin olmalıdır (Şekil 6). Benzer titreye sahip bir lentojenik suş NDV ile karşılaştırıldığında, CPE aynı zamanda mezojenik suşta daha belirgindir.

8 haftalık BALB/C farelerde akut toksisite analizi
1 × 108 PFU intravenöz olarak uygulandığında, fareler% >20 kilo kaybı, karıştırılmış ceket, kambur duruş ve anormal solunum gibi olumsuz etkiler açısından izlenmelidir. İlk 24-36 saat içinde, fareler kilo vermeye başlayacak ve muhtemelen karıştırılmış paltolar ve kambur bir duruş geliştirecektir. Bununla birlikte, virüs yeterince safsa, fareler kilo alımı ve 36 saat sonra duruş ve ceket durumundaki iyileşme ile gözlendiği gibi iyileşmeye başlar. Bu iyileşme belirtilerini 36 saate kadar göstermeyen fareler, son nokta kriterleri için yakından izlenmeye devam etmelidir. Tipik olarak, bu, potansiyel olarak virüs parçacıklarının toplanması nedeniyle yanlış titreme nedeniyle gerçekleşmiştir.

Şekil 1: Belirtilen patojensiz embriyonlanmış tavuk yumurtasından NDV'nin enfeksiyonu ve toplanması. (A) Embriyo hareketine ek olarak 9 günlük inkübasyondan sonra belirgin olması gereken ağ benzeri vaskülatür (oklar). 'X', koryoallantoik membran ile hava boşluğu arasındaki arayüzü ve yumurtanın aşılanması için deliğin nerede oluşturulması gerektiğini gösterir. (B) Ölü bir embriyoyu tasvir eden resim. Web benzeri vaskülatür yokluğuna dikkat edin. Embriyo hareketi eksikliği de gözlenecektir. (C) Hava boşluğunun, yumurta sarısı kesesinin, amniyotik kesenin, koryoallantoik membranın ve allantoik sıvının yerlerini gösteren embriyonlanmış tavuk yumurtasının bileşenlerinin diyagramı. (D) Koriallantoik membranı açığa çıkarmak için kabuğun çıkarılması. (E) Koryoallantoik membranın açılmasından sonra allantoik sıvının ve embriyonun nasıl görünmesi gerektiğini gösterir. Kısaltma: NDV = Newcastle hastalığı virüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Derinlik filtrasyonu için kullanılan aparatın genel montajını özetleyen şematik. Basınç göstergesinin derinlik filtresinin yukarı yönünde takılı olduğundan emin olun. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Farklı konfigürasyonlarında teğetsel akış filtreleme kurulumu. Oklar sıvı akışının yönünü gösterir. (A) TFF kasetinin nasıl monte edildiğine dair resim. (B) TFF sisteminin, sıvının saflaştırılması ve konsantrasyonu sırasında kullanılan "açık" konfigürasyonundaki şeması. (C) Virüs ve temizleme çözeltisinin elüsyonu sırasında kullanılan sıvı sistemden salınırken TFF kurulumunun şeması. (D) TFF sisteminin temizliği sırasında kullanılan "kapalı" konfigürasyonundaki TFF sisteminin şeması. Kısaltma: TFF = Teğetsel akış filtrasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: TFF'den konsantre virüsün yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme ve diyalizi . (A) İyodiksanol yoğunluk gradyanının bileşimini gösteren şema. (B) Saflaştırma işlemi sırasında ML tamponu kullanılarak üretilen virüsün ultrasantrifüjlenmesini takiben virüs bantlama paterni. Ana virüs içeren bant siyah bir oval ile gösterilir. (C) Diyaliz prosedürünün sonunda bir iyodiksanol gradyanı ile hazırlanan 10 mL virüs yüklü bir diyaliz kasetinin tipik boyutu. Kısaltma: TFF = Teğetsel akış filtrasyonu; ML = Mannitol-Lizin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 5: Coomassie boyalı SDS-PAGE jel. Jel, 1 × 105 PFU yüklendiğinde saflaştırılmamış (şerit 2) ve saflaştırılmış (şerit 3) mezojenik NDV stokları arasında kirletici proteinlerin varlığını karşılaştırır. Şerit 1 ve 4 = moleküler ağırlık merdiveni (MW). NDV HN, F0 ve bölünmeyi takip eden alt birimleri, F1 ve F2, ilgili moleküler ağırlıkları27 ile birlikte beyaz yazı tipi olarak gösterilmiştir. Kısaltmalar: SDS-PAGE = sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi; NDV = Newcastle hastalığı virüsü; PFU = plak oluşturan birimler; HN = hemaglutinin; F0 = Füzyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: TCID50 tarafından virüs titresini belirlemek için kullanılan 96 delikli plaka düzeni örneği. Plaka 12 sütuna ayrılmıştır ve her sütun farklı bir seri seyreltmeyi temsil eder. Pozitif kuyucuklar (CPE, transgen ekspresyonu veya IFA ile belirlendiği gibi) gri renkle gösterilir. Bu örnekteki pozitif kuyucukların sayısı göz önüne alındığında, Spearman-Karber titre hesaplayıcısını (Tablo 2) kullandıktan sonra beklenen titre hem TCID50/mL hem de PFU/mL'de listelenmiştir. Kısaltmalar: TCID50 = medyan doku kültürü enfeksiyöz doz; CPE = sitopatik etki; IFA = immünofloresan testi; PFU = plak oluşturan birimler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: DF1 hücrelerinin lentojenik veya mezojenik NDV ile enfeksiyonunu takiben CPE'nin karşılaştırılması. DMEM +% 15 FBS, DMEM +% 15 FBS +% 5 allantoik sıvı veya DMEM +% 2 FBS + 125 μg / mL tripsin gibi farklı kültür koşulları altında 10 saatlik inkübasyondan (A-D) veya 24 saatlik inkübasyondan (E-H) sonra 0.5'lik bir MOI kullanılmıştır. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltmalar: CPE = sitopatik etki; NDV = Newcastle hastalığı virüsü; MOI = enfeksiyon çokluğu; FBS = fetal sığır serumu; DMEM = Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: GFP transgeni olmayan lentojenik NDV'yi titretmek için IFA'nın gerekli olduğu bir duruma bir örnek. Vero hücreleri, %2 FBS ve 125 μg/mL tripsin içeren DMEM'de kültürlendi. Görüntüler 10-7 seri seyreltmeden alınmıştır. (A) Enfekte olmuş hücrelerin parlak alan görüntüsü. (B) IFA virüsü tespit etmek için kullanıldığında lekeli hücrelerin tipik görünümünü gösterir. (C) (A) ve (B)'nin birleştirilmiş görüntüsü. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: IFA = immünofloresan testi; NDV = Newcastle hastalığı virüsü; GFP = yeşil floresan protein; FBS = fetal sığır serumu; DMEM = Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Newcastle hastalığı virüs gen segmentlerinin tespiti için PCR ve RT-qPCR primerleri. NDV genomunun iki bölgesinin spesifik amplifikasyonu için kullanılan primer setler. F proteini primer seti, F proteininin F proteini bölünme bölgesini kapsayan bir bölgesinin amplifikasyonu ile sonuçlanır. Transgen primer seti, optimal transgen yerleştirme bölgesi olan fosfoprotein ve matriks genleri arasındaki intergenik bölgeyi güçlendirir. Bu tablo ayrıca viral L geni21'i ve qRT-PCR testinde kullanılan L gen probunu hedef alan primer dizileri de içerir. Kısaltmalar: PCR = polimeraz zincir reaksiyonu; RT-qPCR = ters transkripsiyon kantitatif PCR; NDV = Newcastle hastalığı virüsü. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: Spearmann-Karber titre hesaplayıcısı. Bu etkileşimli elektronik tablo, mL'deki kuyu inokulumu, seyreltme şeması ve seyreltme başına replika sayısına dayanan TCID50 sonuçlarını kullanarak virüs konsantrasyonunu belirlemek için uygun iş akışını ve denklemleri içerir. Konsantrasyon, doku kültürünün% 50'sini (TCID 50) enfekte etmek için gereken mL'de hacim ve virüs süspansiyonunun mL'si başına plak oluşturan birimler olarak bildirilmiştir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S1: İyodiksanol konsantrasyonlarının belirlenmesi. (A) 340 nm'de bilinen iyodiksanol konsantrasyonundaki çözeltilerin emiliminden elde edilen standart eğri. (B) Standart eğri ve (A)'dan denklem, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme, diyaliz ve polietilen glikol konsantrasyonunu takiben çözeltideki iyotiksanol konsantrasyonunu belirlemek için kullanılmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S2: NDV L geninin sentetik 500 bp çift sarmallı DNA fragmanının qRT-PCR tahlilinden üretilen amplifikasyon ve standart eğri. Amplifikasyon (A) ve standart eğri (B), DNA fragmanının on kat seri seyreltmesini (1.0 × 109 kopya ila 1.0 × 100 kopya) içeren örneklerden oluşturulmuştur. Amplifikasyon ve standart eğri için, 1.0 × 10 1 kopya ve1.0 × 100 kopya içeren örnekler eşiğin altındaydı ve 35 Cp'nin altında bir kesişme noktası değeri üretmedi. Son standart eğri, DNA parçasının 1.0 × 109 kopya ila 1.0 × 102 kopya içeren örneklere dayanarak oluşturuldu. (C) qRT-PCR protokolünde standart eğriyi oluşturmak için kullanılan 500 nükleotid NDV L gen fragmanının DNA dizisi. Kısaltmalar: PCR = polimeraz zincir reaksiyonu; RT-qPCR = ters transkripsiyon kantitatif PCR; NDV = Newcastle hastalığı virüsü; Cp = kesişme noktası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S3: NDV'nin diyaliz kasetinden yüklenmesi ve çıkarılması. (A) Bir sakkaroz yoğunluk gradyanından izole edilen ve diyaliz adımının sonunda görüntülenen yaklaşık 10 mL virüs içeren çözelti ile yüklendikten sonra bir diyaliz kasetinin tipik boyutu. (B) ML tampon takviyesi olmadan iyodiksanol yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme kullanıldığında elde edilen sonuçlara bir örnek. Encircled, kaldırılacak hedef virüs bandıdır. Oklarla belirtilen, hasarlı viryonlar içerebilen ek bir banttır. ML tamponunun saflaştırma işlemine dahil edilmesinin ardından, bu bandın artık belirgin olmadığını unutmayın. Kısaltmalar: NDV = Newcastle hastalığı virüsü; ML = mannitol-lizin. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S1: Arıtma işlemi sırasında kullanılan batı leke çözeltileri ve ML tamponu üretmek için gerekli adımları sağlar. Kısaltmalar: SDS-PAGE = sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi; TEMED = tetrametiletilenilamin; ML = Mannitol-lizin. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.