Method Article

Gastrointestinal Stromal Tümörün Genetiği Değiştirilmiş Bir Fare Modelinde Moleküler ve İmmünolojik Teknikler

DOI:

10.3791/63853

⸱

May 2nd, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Hospital of the University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalenin amacı, KitV558Δ/+ fare modelini ve fare örneklerinin başarılı diseksiyonu ve işlenmesi için teknikleri tanımlamaktır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gastrointestinal stromal tümör (GİST) en sık görülen insan sarkomudur ve tipik olarak KIT reseptöründeki tek bir mutasyon tarafından yönlendirilir. Tümör tipleri arasında, yeni nesil kanser tedavilerini araştırmak için çok sayıda fare modeli geliştirilmiştir. Bununla birlikte, GİST'te, çoğu in vivo çalışma, doğal sınırlamaları olan ksenograft fare modellerini kullanır. Burada, bir KitV558Δ / + mutasyonu barındıran gastrointestinal stromal tümörün immün yetkinliği, genetiği değiştirilmiş bir fare modelini tanımladık. Bu modelde, çoğu GİST'den sorumlu onkogen olan mutant KIT, insan GIST'lerinde görülen histolojik görünümü ve immün infiltrasyonu taklit eden bir GIST'e yol açan endojen promotörü tarafından yönlendirilir. Ayrıca, bu model hem hedefe yönelik moleküler hem de immün tedavileri araştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Burada, bir KitV558Δ/+ fare kolonisinin ıslahını ve bakımını açıklıyoruz. Ek olarak, bu yazıda GİST'in tedavisi ve tedariki, KitV558Δ/+ farelerde mezenterik lenf nodu drenajı ve bitişik çekumun yanı sıra moleküler ve immünolojik analizler için numune hazırlama ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GİST, Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 6.000 vaka insidansı olan insanlarda en yaygın sarkomdur1. GIST, Cajal'ın interstisyel hücreleri olarak adlandırılan gastrointestinal kalp pili hücrelerinden kaynaklanıyor gibi görünmektedir ve tipik olarak tirozin kinaz kiti veya PDGFRA2'deki tek bir mutasyon tarafından tahrik edilmektedir. Cerrahi, GİST tedavisinin temelini oluşturur ve iyileştirici olabilir, ancak ilerlemiş hastalığı olan hastalar tirozin kinaz inhibitörü (TKI), imatinib ile tedavi edilebilir. İmatinib, 20 yılı aşkın bir süre önce kullanılmaya başlanmasından bu yana, GİST'teki tedavi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm fareler, NIH kılavuzlarına göre ve Pennsylvania Üniversitesi IACUC'un onayı ile Pennsylvania Üniversitesi'nde patojensiz koşullar altında barındırıldı. Ötenazi, Pennsylvania Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Kaynakları standart çalışma prosedürlerini izleyerek gerçekleştirildi.

1. KitV558Δ/+ fare ıslahı

  1. KitV558Δ/+ farelerini C57BL/6J farelerini kullanarak C57BL/6J arka plana 10 defadan fazla geri geçirin. Bunu yapmak için, erkek KitV558Δ / + farelerini dişi C57BL / 6J farelerle 1: 2 oranında üretin.
    NOT: Homozigot Kit V5....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KitV558Δ/+ fare modeli, immün yetkin bir fare modelinde terapötiklerin araştırılmasına izin verir. KitV558Δ/+ fareler, ilerleyici bağırsak tıkanıklığı nedeniyle ortalama 8 aylık bir ömre sahiptir (Şekil 4). KitV558Δ / + farelerden elde edilen tümörler, tirozin kinaz Kiti ve transmembran kanalı DOG1 (Şekil 5) ve transkripsiyon faktörü ET.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KitV558Δ/+ fare modeli, GİST'in moleküler ve immünolojik analizinde güçlü bir araştırma aracıdır. Üreme stratejisi tek bir haç gerektirse de, tümör yanıtını analiz eden deneylerde KitV558Δ / + fare kohortlarının kullanılması kapsamlı bir üreme gerektirir. Benzer tümör ağırlıklarını sağlamak için fareler yaş ve cinsiyet uyumlu olmalıdır ve farelerin% 10'u tümörler kurulduğunda 8 haftalıktan önce ölür. Bireysel farelerde tümör hacmini izlemek için BT veya MRI gibi gelişmiş görüntülem.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KitV558Δ/+ fareler genetik olarak tasarlanmış ve Dr. Peter Besmer10 tarafından paylaşılmıştır. Bu çalışma NIH hibeleri R01 CA102613 ve T32 CA251063 tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 mikron filtreEMSCO1194-2360
1x RBC lizis tamponuYaşam Teknolojileri00-4333-57
3mL şırıngaThermo Fisher Scientific / BD Biosciences14823435
4– %15 Mini-PROTEAN TGX Prekast Protein Jelleri, 10 kuyulu, 30 & lBio-Rad4561083
%4 Paraformaldehit ÇözeltisiThermo Fisher ScientificAAJ19943K2
40 mikron filtreEMSCO1194-2340
5M NaClSigma AldrichS6546
70 mikron filtreEMSCO1194-2350
AKT antikoru (C67E7)Hücre Sinyalizasyonu4691
C57BL/6J farelerJackson Laboratuvarı
Kollajenaz IVSigma AldrichC5138
Komple mini edta içermeyen proteaz inhibitörüThomas ScientificC852A34
Kontes II Otomatik Hücre SayacıThermo Fisher Scientific
Tek Kullanımlık NeşterlerThermo Fisher Scientific/Exel International14-840-00
Dnase IThomas ScientificC756V81
Dog1 antikoruabcamab64085
EDTASigma AldrichE9884
ERK antikoru (p44/42)Hücre Sinyalizasyonu9102
FBSThomas ScientificC788U23
FIJI yazılımıFIJIhttps://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 HomojenizatörThermo Fisher Scientific15-340-169
HBSSPennsylvania Üniversitesi Hücre Merkezi
Imatinib mesilatSelleck KimyasallarıS1026
KIT antikoru (D13A2)Hücre Sinyalizasyonu3074
KitV558Δ/+ GenotiplemeTransnetyx
Mikrosantrifüj tüpleri (1.5mL)Thermo Fisher Scientific05-408-129
Fare İmmünotespit Kiti Üzerinde Fare, TemelVektör LaboratuvarlarıBMK-2202
Nitroselüloz Membran, Önceden Kesilmiş, 0.45 & mRio-Rad1620145
Yağsız Kuru SütThermo Fisher ScientificNC9121673
Nonidet P 40 SubstituteSigma Aldrich74385
p-AKT antikoru (S473)Hücre Sinyali4060
p-ERK antikoru (p44/42)Hücre Sinyali9101
p-KIT antikoru (Y719)Hücre Sinyali3391
PMSF Proteaz İnhibitörüThermo Fisher Scientific36978
Proeinase KThermo Fisher ScientificBP170050
Yuvarlak Tabanlı Polistiren Testi (FACS) TüpleriFalcon / Thermo Fisher Scientific14-959-2A
RPMIPennsylvania Üniversitesi Hücre Merkezi
Sodyum florür (NaF)Sigma Aldrich
Sodyum ortovanadat (Na3VO4)Sigma AldrichS6508
SuperSignal West Dura Uzatılmış Süreli SubstratThermo Fisher Scientific34076
TBS tamponu (10x)University of Pennsylvania Cell Center
Doku kültürü kabı (100mm2)Thermo Fisher Scientific/Falcon08-772E
TrisHCLThermo Fisher ScientificBP1757500
Tween 20Rio-Rad1706531
  vivaCT 80 platformuScanco medikal
201154

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
  2. Joensuu, H., DeMatteo, R. P.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gastrointestinal Stromal TumorGenetically Engineered MiceImmunocompetent Mouse ModelKit MutationTumor MicroenvironmentFlow CytometrySingle Cell SuspensionProtein IsolationTyrosine Kinase InhibitorsTumor Dissection

Related Articles