RESEARCH
Peer reviewed scientific video journal
Video encyclopedia of advanced research methods
Visualizing science through experiment videos
EDUCATION
Video textbooks for undergraduate courses
Visual demonstrations of key scientific experiments
BUSINESS
Video textbooks for business education
OTHERS
Interactive video based quizzes for formative assessments
Products
RESEARCH
JoVE Journal
Peer reviewed scientific video journal
JoVE Encyclopedia of Experiments
Video encyclopedia of advanced research methods
EDUCATION
JoVE Core
Video textbooks for undergraduates
JoVE Science Education
Visual demonstrations of key scientific experiments
JoVE Lab Manual
Videos of experiments for undergraduate lab courses
BUSINESS
JoVE Business
Video textbooks for business education
Solutions
Language
tr_TR
Menu
Menu
Menu
Menu
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Kyoungrae Kim1, Erik M. Anderson2,4, Brian J. Fazzone2,4, Kerri A. O’Malley2,4, Scott A. Berceli2,4, Terence E. Ryan1,3, Salvatore T. Scali2,4
1Department of Applied Physiology and Kinesiology,University of Florida, 2Division of Vascular Surgery and Endovascular Therapy,University of Florida, 3Center for Exercise Science,University of Florida, 4Malcom Randall Veteran Affairs Medical Center
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Erratum Notice
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
Bu protokol, murin ortak iliak arteriyovenöz fistül oluşumunun cerrahi adımlarını detaylandırır. Bu modeli hemodiyaliz erişimi ile ilişkili ekstremite patofizyolojisini incelemek için geliştirdik.
Kronik böbrek hastalığı önemli bir halk sağlığı sorunudur ve hemodiyaliz gibi kronik renal replasman tedavileri gerektiren son dönem böbrek hastalığı (SDBY) prevalansı artmaya devam etmektedir. Otojen arteriyovenöz fistül (AVF) yerleştirilmesi, SDBY'li hastalar için primer vasküler erişim seçeneği olmaya devam etmektedir. Ne yazık ki, hemodiyaliz hastalarının yaklaşık yarısı, ince paresteziden dijital kangrene kadar değişen diyaliz erişimi ile ilişkili el disfonksiyonu (ARHD) yaşamaktadır. Özellikle, ARHD'den sorumlu olan altta yatan biyolojik faktörler tam olarak anlaşılamamıştır ve mekanizmaları aydınlatmak ve / veya ARHD'nin önlenmesi / tedavisi için yeni terapötikler geliştirmek için yeterli hayvan modeli yoktur. Burada, sol ortak iliak arter ve ven arasında bir AVF'nin oluşturulduğu ve böylece ekstremite patofizyolojisinin değerlendirilmesini kolaylaştıran yeni bir fare modeli tanımlanmıştır. Mikrocerrahi, damar izolasyonu, uzunlamasına venotomi, arteriyovenöz anastomoz oluşumu ve venöz rekonstrüksiyonu içerir. Sahte ameliyatlar, AVF oluşturma dışındaki tüm kritik adımları içerir. İliak AVF yerleşimi santral hemodinamik, periferik iskemi ve arka ekstremite nöromotor performansında bozulmalara klinik olarak anlamlı değişiklikler ile sonuçlanır. Bu yeni preklinik AVF modeli, hemodiyaliz hastaları tarafından bildirilen yaygın nöromotor pertürbasyonları özetleyen ve araştırmacıların ARHD patofizyolojisinin mekanizmalarını araştırmalarına ve potansiyel terapötikleri test etmelerine olanak tanıyan yararlı bir platform sunmaktadır.
Fonksiyonel vasküler erişimin sağlanması ve korunması, hemodiyaliz yoluyla renal replasman tedavisi alan son dönem böbrek hastalığı (SDBY) hastaları için önemli bir birincil hedef olmaya devam etmektedir1. Tekrarlanan hemodiyaliz tedavileri, atık ürünleri uzaklaştırmak, elektrolitleri normalleştirmek ve böbrek fonksiyonu yetersiz kaldığında sıvı dengesini korumak için gereklidir ve bu nedenle uzun süreli sağkalım için gereklidir2. Bu nedenle, vasküler erişim SDBY'li hastalar için bir "yaşam çizgisi" dir ve otojen arteriyovenöz fistül (AVF) yerleşimi bu kohort3 arasında tercih edilen bir diyaliz erişim seçeneği olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, hemodiyaliz hastalarının yaklaşık% 30-60'ı, klinik olarak erişimle ilişkili el disfonksiyonu (ARHD) olarak tanımlanan bir el sakatlığı spektrumu yaşamaktadır. ARHD'nin semptomları zayıflık ve koordinasyonsuzluktan monopleji ve dijital kangrene kadar değişebilir, bu da AVF oluşturulduktan hemen sonra ortaya çıkabilir veya fistül olgunlaşması ile yavaş yavaş gelişebilir. Ayrıca, ARHD, düşük yaşam kalitesi, yüksek kardiyovasküler hastalık riski ve artmış mortalite 2,3,4 ile ilişkili SDBY tedavi programını karmaşıklaştırmaktadır.
AVF oluşumunu takiben hemodinamik değişikliklerin neden olduğu vasküler yeniden şekillenmeyi incelemek için çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. İliak veya femoral AVF 16,17,18,19,20 olan büyük hayvan modelleri ve karotis arter-juguler ven anastomozu veya infrarenal aort-inferior vena kava fistül formasyonu kullanan kemirgen modelleri, AVF olgunlaşmasının ve açıklığının yukarıda belirtilen yönlerini incelemek için iyi kurulmuştur 21 . Örneğin, venöz hipertansiyon, daha büyük luminal çap ve artmış ven duvarı kalınlığı başarılı AVF olgunlaşmasının imzalarıdır, oysa medyanın önemli fibrozisi ve akışta herhangi bir değişiklik olmaksızın intimal hiperplazi veya trombüs gelişimi sıklıkla AVF başarısızlıklarını karakterize eder 6,15. Bununla birlikte, büyük hayvan modelleri, murin modellerinin deneysel esnekliğinden veya transgenik yeteneklerinden yoksunken, mevcut kemirgen modelleri, anatomik konum ve / veya ilişkili uzuv patolojisinin eksikliği nedeniyle ARHD'nin araştırılmasını kolayca kolaylaştırmamaktadır. Gerçekten de, ilgili klinik fenotipi özetleyen yerleşik bir preklinik hayvan modelinin eksikliği nedeniyle, semptomatik ARHD hastalarının sayısındaki ilerleyici artışa rağmen, patobiyolojik mekanizmaları aydınlatmak ve yeni terapötik stratejiler geliştirmek için araştırma ilerlemesi durgun kalmıştır. Bu nedenle, bu çalışmanın temel amacı, AVF mikrocerrahisinin prosedürel adımlarını ve AVF ile ilişkili patofizyolojinin karakterizasyonunu sağlayan benzersiz bir ARHD fare modelini tanıtmaktır.
Tüm prosedürler Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve Malcom Randall Gazi İşleri Tıp Merkezi tarafından onaylanmıştır.
NOT: Genç yetişkin (8-10 haftalık) erkek C57BL/6J fareler Jackson Laboratuvarı'ndan satın alınmış ve ışık (12 saat ışık: 12 saat karanlık döngü), sıcaklık (22 °C ± 1 °C) ve nem (%50 ± %10) kontrollü bir hayvan tesisinde barındırılmıştır. Beş farenin kafes başına (W: 18 cm x L: 29 cm x H: 12.5 cm) oturmasına izin verildi ve yuvalama malzemeleri, yiyecek ve su ad libitum olarak sağlandı. Standart chow ile 7 günlük habitat alışmasının ardından, fareler diyet geçiş aşaması olarak 7 gün boyunca kazein bazlı bir chow diyetine dönüştürüldü. Bundan sonra, fareler, daha önce tarif edildiği gibi AVF ameliyatından önce böbrek fonksiyon bozukluğunu (KBH) indüklemek için 2-3 hafta boyunca% 0.2 -% 0.15 adenin takviyesi ile kazein bazlı chow ile beslendi 22,23,24. Kontrol fareleri, adenin takviyesi (kontrol) olmadan kazein bazlı bir chow diyeti aldı. Kontrol ve KBH diyetleri postoperatif iyileşme dönemi (POD) boyunca sürdürüldü.
1. Ameliyat öncesi ölçümler
2. Cerrahi hazırlık
3. Anestezi ve konumlandırma
4. Cerrahi hedef bölgenin araştırılması
5. Ortak iliak arteriyovenöz fistül anastomozunun oluşturulması
6. Postoperatif bakım ve ölçüm
Adenin diyetine maruz kalan hayvanlar, kazein bazlı chow alan hayvanlara kıyasla glomerüler filtrasyon hızlarını azaltmış (kontrol: 441.3 ± 54.2 μL / dak ile KBH: 165.1 ± 118.3 μL / dak, p < 0.05) ve artmış serum kan üre azot seviyeleri (kontrol: 20.39 ± 4.2 μL / dak vs KBH: 38.20 ± 10.65 μL / dak, p < 0.05) artmış ve arteriyovenöz fistül cerrahisinden önce böbrek yetmezliğinin varlığını doğrulamıştır.
AVF açıklığının doğrulanması
Teknik başarının intraoperatif görsel olarak doğrulanması, fistül açıklığının ilk tanımlanması olmasına rağmen, çalışma süresi boyunca açıklığı veya fizyolojik olgunlaşmayı tam olarak garanti etmez. Postoperatif açıklık sonuçları (yani başarı veya başarısızlık) daha önce gösterdiğimiz gibi hem dupleks ultrason görüntüleme hem de histolojik inceleme kullanılarak belirlendi25. Şekil 2'de sırasıyla temsili B modu, nabız dalgası Doppler ve renkli Doppler ultrason görüntüleri ve arteriyovenöz fistül anastomozunun morfolojik kesitleri gösterilmektedir. Bir patent fistülü, türbülanslı hemodinamik ile renkli Doppler analizinde ve fistül bölgesinde spektral genişleme ile doğrudan görselleştirilir. Giriş ve çıkış kaplarının uyarlanabilir akış aracılı değişiklikleri de dolaylı olarak AVF açıklığını doğrular. Spesifik olarak, aort pik sistolik ve diyastolik sonu hızını yükseltir, IVC yüksek tepe hızı ile pulsatilite geliştirir ve hem aortta hem de IVC'de damar genişlemesi belirgindir (Şekil 2A). Buna karşılık, başarısız veya tromboze bir fistül, giriş veya çıkış ölçümlerinde neredeyse hiç değişiklik yapmaz ve sol iliak vaskülatür içinde türbülans veya spektral genişleme yoktur. Genellikle, tromboza bağlı fistül yetmezliği, nabız dalgası Doppler analizinde minimal veya hiç akış olmadığı şeklinde görselleştirilen sol iliak arteri kısmen veya tamamen tıkar. Şekil 2B , cerrahi oluşturmadan 2 hafta sonra bir AVF'nin seri histoloji kesitlerini göstermektedir. Kesitler 5 μm kalınlığındadır ve Masson'un trikromu ile boyanmıştır. Arter ve venin cerrahi anastomozu açıktır ve belirgin venöz arteriyelizasyon mevcuttur (venöz duvar kalınlaşması ve neointimal hiperplazili fibrozis). Erken AVF yetmezliği olan fareleri ekarte etmek için postoperatif 3. günde ultrason görüntüleme yapıldı ve daha sonra çalışma süresi boyunca seri, invaziv olmayan ölçümler elde edildi. Morfolojik değerlendirme, kurban anında döneme özgü vasküler yeniden şekillenme detayları sağlar ve ultrason bulgularını doğrulamak için kullanılmıştır. Başlangıçta yaklaşık P'lik bir AVF açıklık oranı (postoperatif ölümün -30'u ve fistül yetmezliğinin -30'u)25 beklenir, ancak cerrahi başarı oranı pratikle ve artan yeterlilikle önemli ölçüde iyileşir (~%5- başarısızlık oranı).
İliak arteriyovenöz fistül oluşumunu takiben patofizyolojik özellikler
Hemodinamik değişiklik: Erişim ile ilişkili ekstremite patofizyolojisini bağlamsallaştırmak için AVF hemodinamiği ve distal arka ekstremite perfüzyonunun özellikleri ölçülmelidir. Ameliyat sonrası B-mod ve nabız dalgası Doppler ultrason ölçümlerinde giriş ve çıkış damar genişlemesi (IVC: POD3'te 1.4 kat, POD13 ve IRA'da 1.6 kat: POD3'te 1.4 kat ve POD13'te 1.7 kat, p < 0.05) ve pik sistolik hızda artışlar (IVC pik sistolik hız: POD3'te 5.5 kat ve POD13'te 4.9 kat ve IRA pik sistolik hız: Sahte hayvanlara kıyasla POD3'te 2,8 kat ve POD13, P'de 3,7 kat < 0,05) (Şekil 3A-D). Ayrıca, postoperatif tek taraflı arka ekstremite iskemisi belirgindi, bu da fistülün distali çalma aracılı arteriyel hipoperfüzyonunu doğruladı. Sol pençe perfüzyon eksikliklerinin kontralateral ekstremitenin ~ 'si, tibialis anterior kasının perfüzyon açığının ise ~` olması beklenir. Fareler çalışma süresi boyunca bu açıkları kısmen geri kazanmıştır (Şekil 3E, F).
Arka ekstremite disfonksiyonu: Birkaç gün sürebilen hafif (çoğu vaka) ila şiddetli (birkaç vaka) bacak topallamasını içeren AVF oluşumundan sonra ipsilateral ekstremite sakatlığı beklenir. Çözülmemiş arka ekstremite felci ve / veya pençe nekrozu, normal aralığın dışındaki fistül boyutunun neden olduğu ciddi bir iskemik hasarın göstergesi olabilir. Arka ekstremite nöromotor fonksiyonu, iyileşme süresi boyunca sırayla gerçekleştirilen kavrama gücü testi ve koşu bandı yürüyüş paterni analizi ile ölçüldü. Beklenen tek taraflı kavrama gücü, postoperatif 4. günde kontralateral ekstremitenin ~% 50'sidir ve kademeli iyileşme vardır. AVF fareleri ayrıca yürüyüş değerlendirmesi sırasında düşük koşu bandı hızlarına ihtiyaç duyarlar (<20 cm / dak) (Şekil 3G, H).

Resim 1: Arteriyovenöz fistül anastomozunun mikrocerrahi basamakları. (A) Orta hat laparotomi ve sol iliak arter/ven izolasyonu dahil olmak üzere cerrahi hedef bölgeye maruz kalma. (B) Proksimal ve distal bölgelerde sol ortak iliak arteriyovenöz demet üzerinde 4-0 sütür ligatürleri (örneğin, geçici damar kelepçeleri olarak kullanılır). (C) İliak venin ön duvarında uzunlamasına venotomi. (D) İliak venin arka duvarı ve iliak arterin ön duvarı üzerinden 10-0 imbricating sütür. (E) İmbrikasyon distansiyonu ile eliptik insizyon. (F) Resim C'deki ilk uzunlamasına venotomi, kesilmiş bir 10-0 dikiş kullanılarak onarılır. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Arteriyovenöz fistül açıklığının doğrulanması . (A) Doppler ultrasonografide AVF açıklığının belirlenmesi. Patent fistülün özellikleri arasında B-mod görüntülemede arteriyel ve venöz dilatasyon, sol iliak vaskülatürün renkli Doppler analizinde türbülanslı akım, sol iliak damarların nabız dalgası Doppler değerlendirmesinde pulsatil spektral genişleme, infrarenal aortun pik sistolik ve diyastolik sonu hızında artışlar ve pik sistolik hızda artışlarla IVC içinde pulsatilite sayılabilir. İliak damarlarda azalmış veya hiç akım olmaması AVF yetmezliği/trombozu düşündürür. Dubleks ultrason tekniği hem morfolojik hem de fizyolojik veriler sağlar. Hız ölçümleri saniyede milimetre cinsindendir. (B) Fistül oluşumundan 14 gün sonra AVF anastomozunun morfolojik değerlendirilmesi. Görüntüler Masson'un trikromu ile boyandı. Seri kesit mikroskobunda proksimal (sol uç) ile distal (sağ uç) ortak iliak arteriyovenöz anatomiye kadar anatomik değişiklikler vardır. Vaskülatürün pıhtı ve/veya aşırı neointimal hiperplaziye bağlı tıkanması AVF yetmezliğini doğrular. Görüntüler 10x büyütmelidir. A: Ortak iliak arter, V: Ortak iliak ven. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: AVF oluşumundan önceki ve sonraki patofizyolojik özellikler. (A) infrarenal aort çapı, (B) infrarenal aort pik sistolik hızı, (C) inferior vena kava çapı ve (D) inferior vena kava tepe sistolik hızında preoperatif ve postoperatif gün 3 ve 13'te ultrasonografi ölçümü. Ameliyat öncesi ve 2 haftalık iyileşme süresi boyunca (E) tibialis anterior ve (F) ventral patide lokal kan perfüzyonu (Lazer doppler) ölçümü. Nöromotor fonksiyonel testler, ameliyat öncesi ve sonrası (G) kavrama gücü ve (H) koşu bandı testini içeriyordu. Veriler iki yönlü ANOVA kullanılarak analiz edildi ve uygun olduğunda Tukey'in post-hoc testi yapıldı. ±*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, **** p < 0,0001 ve Control_Sham. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, #### p < 0,0001 ve CKD_Sham. N = 6-10/grup. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Bu protokol, murin ortak iliak arteriyovenöz fistül oluşumunun cerrahi adımlarını detaylandırır. Bu modeli hemodiyaliz erişimi ile ilişkili ekstremite patofizyolojisini incelemek için geliştirdik.
Florida Üniversitesi Vasküler Cerrahi ve Endovasküler Terapi Bölümü'nden Dr. Guanyi Lu'ya, iliak AVF modelinin geliştirilmesi ve cerrahi eğitim konusundaki teknik destek için ve Florida Üniversitesi Uygulamalı Fizyoloji ve Kinesiyoloji Bölümü'nden Ravi Kumar'a canlı mikrocerrahi görüntüleri elde eden teknik destek için içtenlikle teşekkür ederiz.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüleri, R01-HL148697 Enstitü numaraları (S.T.S.'ye) ve Amerikan Kalp Derneği hibe numarası POST903198 (K.K.'ya) tarafından desteklenmiştir.
| % 0.15 Adenin diyeti | ENVIGO | TD.130899 | % 20 kazein,% 0.15 adenin,% 0.9 P |
| 0.2% Adenin diyeti | ENVIGO | TD.130900 | % 20 kazein,% 0.2 adenin,% 0.9 P |
| 10-0 Naylon sütür | AD cerrahi | XXS-N1005T4 | |
| 29 G iğne şırıngaları | Exel International | 14-841-32 | |
| 31 G iğne şırıngaları | Avukat | U-100 insülin | şırınga |
| 4-0 ipek sütür | AD cerrahi | S-S41813 | |
| 45 derece açılı dumont forseps | Güzel Bilim Araçları | 11253-25 | |
| 5-0 PGA sütür | AD cerrahi | PSGU-518R13 | |
| 6-0 ipek sütür | AD cerrahi | S-S618R13 | |
| Emilebilir jelatin sünger | ETHICON | 1975 | |
| Alkol müstahzarları | Covidien | 5110-cs4000 | %70 izopropil alkol |
| Buprenorfin | NA | NA | 0.01 g/mL |
| C57BL6/J fareler | Jaxon Laboratuvar | ||
| Kazein diyeti | ENVIGO | TD.130898 | %20 kazein, %0.9 |
| P Pamuklu çubuklar | CONSTIX | SC-9 | Orta tek uçlu yuvarlak pamuklu çubuk |
| Pamuklu çubuklar | CONSTIX | SC-4 | Küçük çift uçlu sert, keskin, sivri uçlu pamuklu çubuk |
| Curity dokumasız süngerler (2x2) | Covidien | 9022 | |
| Kavisli Vannas yaylı makas | Güzel Bilim Araçları | 15001-08 | |
| Doppler ultrason | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Ekstra ince graefe forseps | Güzel Bilim Araçları | 11150-10 | 2 çift |
| Göz yağlayıcı | CLCMEDICA | Optixcare göz yağı | |
| Heparin (5000 U/mL) | Ulusal İlaç Kodları Listesi | 63739-953-25 | 100 IU/mL |
| Sıcak boncuk sterilizatörü | Güzel Bilim Araçları | 18000-50 | |
| Düşük sıcaklıkta koter | Bovie | AA04 | |
| Kalem düzeltici | Wahl | 5640-600 | |
| Pudrasız cerrahi eldivenler | Ansell | 7824PF | |
| Yuvarlak saplı iğne tutucular | Güzel Bilim Araçları | 12076-12 | |
| Steril havlu örtüsü | Dynarex | DY440-MI | |
| Sterilize edilmiş %0,9 salin | Ulusal İlaç Kodları Listesi | 46066-807-25 | |
| Düz dumont forseps | Güzel Bilim Araçları | 11253-20 | |
| Düz iğne tutucu | Güzel Bilimler Araçlar | FST 12001-13 | |
| Düz vannas yaylı makas | Güzel Bilim Araçları | 25001-08 | |
| TrizChLOR4 | Ulusal İlaç Kodları Listesi | 17033-279-50 |