Yöntem makalesi

Su Kaynaklı Antibiyotiğe Dirençli Bakterilerin İzolasyonu ve Tanımlanması ve Antibiyotik Direnç Genlerinin Moleküler Karakterizasyonu

9.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63934

⸱

3 Mart 2023

 , 
1Antimicrobial Research (AMR) Lab, Department of Biotechnology, University of Mumbai

Bu makalede

Özet

Burada, antibiyotiğe dirençli bakterilerin sudan izolasyonu ve tanımlanması ve antibiyotik direnç genlerinin (ARG'ler) moleküler karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Kültür temelli ve kültüre dayalı olmayan (metagenomik analiz) tekniklerin kullanımı, toplam bakteri çeşitliliği ve Mumbai, Hindistan'dan tatlı sularda bulunan farklı ARG'lerin toplam havuzu hakkında tam bilgi sağlar.

Özet

Tatlı su kütleleri ile ilişkili mikrobiyota yoluyla antibiyotik direncinin (AR) gelişimi ve yayılması önemli bir küresel sağlık sorunudur. Bu çalışmada, tatlı su örnekleri, hem geleneksel kültür temelli teknikler hem de yüksek verimli kültürden bağımsız metagenomik bir yaklaşım kullanılarak toplam bakteri çeşitliliği ve AR genleri (ARG'ler) açısından toplandı ve analiz edildi. Bu yazıda, tatlı su örneklerinden elde edilen toplam ve antibiyotiğe dirençli kültürlenebilir bakterilerin sayımı ve kültürlenebilir izolatlarda fenotipik ve genotipik direncin belirlenmesi için sistematik bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, tatlı su örneğinden ekstrakte edilen toplam metagenomik DNA'nın tüm metagenomik analizinin, kültürlenemeyen bakteriler de dahil olmak üzere genel bakteri çeşitliliğinin tanımlanması ve su kütlesindeki toplam farklı ARG (rezistans)" havuzunun tanımlanması için kullanıldığını bildiriyoruz. Bu ayrıntılı protokolleri takiben, 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU / mL aralığında yüksek antibiyotiğe dirençli bakteri yükü gözlemledik. Çoğu izolat, sefotaksim, ampisilin, levofloksasin, kloramfenikol, seftriakson, gentamisin, neomisin, trimetoprim ve siprofloksasin dahil olmak üzere çoklu test edilen antibiyotiklere dirençliydi ve çoklu antibiyotik direnci (MAR) indeksleri ≥0.2 idi ve izolatlarda yüksek direnç seviyelerini gösterdi. 16S rRNA dizilimi, Klebsiella pneumoniae gibi potansiyel insan patojenlerini ve Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. ve Aeromonas spp. gibi fırsatçı bakterileri tanımladı. İzolatların moleküler karakterizasyonu, blaTEM, blaCTX-M (β-laktamlar), aadA, aac (6')-Ib (aminoglikozitler) ve dfr1 (trimetoprimler) gibi çeşitli ARG'lerin varlığını gösterdi ve bu da tüm metagenomik DNA analizi ile doğrulandı. Metagenomik DNA'da antibiyotik efflux pompaları -mtrA, macB, mdtA, acrD, β-laktamaz-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, kloramfenikol asetiltransferaz geni catB10 ve rifampisin direnç geni rphB- için kodlayan diğer ARG'lerin yüksek prevalansı da tespit edilmiştir. Bu çalışmada tartışılan protokollerin yardımıyla, çeşitli AR fenotipik ve genotipik özelliklere sahip su kaynaklı MAR bakterilerinin varlığını doğruladık. Bu nedenle, tüm metagenomik DNA analizi, bir su kütlesinin genel AR durumunu belirlemek için geleneksel kültür tabanlı tekniklere tamamlayıcı bir teknik olarak kullanılabilir.

Giriş

Antimikrobiyal direnç (AMR) en acil küresel sorunlardan biri olarak tanımlanmıştır. AMR'nin hızlı evrimi ve dünya çapında yayılması, bununla ilişkili sağlık maliyetleri açısından insan sağlığına ve küresel ekonomiye yönelik en büyük tehditlerden biridir1. Antibiyotiklerin aşırı kullanımı ve yanlış kullanımı AR'de artışa neden olmuştur. Bu, COVID-19 pandemisi tarafından vurgulanmıştır; bu süre zarfında, birçok durumda, etkilenen hastalarda AMR nedeniyle ilişkili ikincil enfeksiyonların tedavisi büyük ölçüde tehlikeye girmiştir2. Antibiyotiklerin insanlar tarafından doğrudan kullanımı/yanlış kullanımının yanı sıra, tarım ve hayvancılıkta antibiyotiklerin aşırı kullanımı ve yanlış kullanımı ve su kütleleri de dahil olmak üzere çevreye uygunsuz şekilde deşarj edilmesi büyük bir endişe kaynağıdır3. Bakterilerde yeni direnç özelliklerinin ve çoklu ilaç direncinin artması, AR'nin gelişmesine ve yayılmasına yol açan faktörlerin daha iyi anlaşılması ihtiyacını acilen vurgulamaktadır. Plazmidler gibi mobil genetik elementler üzerinde sıklıkla çoklu AR genleri (ARG'ler) taşıyan çoklu antibiyotiğe dirençli bakteriler, bu direnç genlerini potansiyel insan patojenleri de dahil olmak üzere dirençli olmayan mikroorganizmalara aktarabilir ve böylece son çare antibiyotiklerle bile tedavi edilemeyen süper böceklerin ortaya çıkmasına neden olabilir4. Bu çoklu antibiyotiğe dirençli bakteriler, eğer su ekosistemlerinde mevcutsa, balık, yengeç ve yumuşakçalar gibi kontamine su bazlı gıdaların tüketimi yoluyla doğrudan insan bağırsağına girebilir. Önceki çalışmalar, AR bakterilerinin doğal olarak oluşan su sistemlerinde yayılmasının, içme suyu da dahil olmak üzere diğer su kaynaklarına da ulaşabileceğini ve böylece insan besin zincirine girebileceğini göstermiştir 5,6,7.

Bu çalışmanın amacı, toplam bakteri çeşitliliği ve Mumbai, Hindistan'daki bir su kütlesinde bulunan farklı ARG'lerin toplam havuzu hakkında tam bilgi edinmek için kültür tabanlı ve kültür tabanlı olmayan (tüm metagenomik analiz) tekniklerin bir kombinasyonunu kullanarak kapsamlı bir protokol sağlamaktır. Geleneksel olarak, su kütlelerindeki bakteri çeşitliliğini incelemek için kültür temelli teknikler kullanılmıştır. Kültürlenebilir mikroorganizmalar, herhangi bir niş içindeki toplam mikrobiyotanın sadece küçük bir yüzdesini oluşturduğundan, bakteri çeşitliliğinin genel durumunu ve herhangi bir numunede yaygın olan çeşitli dirençli özellikleri daha iyi anlamak için, çeşitli kültür bazlı ve kültürden bağımsız teknikler birlikte kullanılmalıdır. Böyle sağlam ve güvenilir bir kültürden bağımsız teknik, tüm metagenomik DNA analizidir. Bu yüksek verimli yöntem, bakteri çeşitliliği veya çeşitliARG'lerin fonksiyonel ek açıklamaları 8,9 ile ilgili çeşitli çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır. Bu teknik, metagenomu (bir numunedeki toplam genetik materyal) çeşitli analizler için başlangıç materyali olarak kullanır ve bu nedenle kültürden bağımsızdır. Bu çalışmadaki protokoller, su örneklerinde toplam bakteri çeşitliliği ve çeşitli ARG'ler (rezistom) hakkında bilgi edinmek için tüm metagenomik DNA analizi için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Numune toplama ve işleme

  1. Örnek toplama
    1. Su numunesinin uygun hacmini steril numune kaplarında toplayın ve kabın 3/4'ünden fazlasının doldurulmamasını sağlayın.
    2. Numuneleri toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede aseptik koşullar altında laboratuvara taşıyın ve hemen işleyin.
  2. Numune işleme
    1. Herhangi bir partikül maddeyi çıkarmak için su numunesini steril bir müslin bezden aseptik olarak filtreleyin.
    2. Daha fazla analiz için filtrelenmiş suyun uygun seri seyreltmelerini gerçekleştirin.

2. Toplam bakteri yükünün tahmini ve antibiyotiğe dirençli bakteri sayısı

  1. Toplam bakteri yükünün belirlenmesi
    1. 18.12 g R2A Agar, Modifiye toz 1.000 mL çift damıtılmış suda askıya alın ve karışımı ısıtarak çözün. Çözünmüş karışımı 121 °C'de, 20 dakika boyunca 15 psi'de otoklav yapın. Otoklavlanmış karışımın uygun miktarını steril Petri plakalarına dökerek R2A Agar, Modifiye plakalar hazırlayın (örneğin; 90 mm steril Petri plakasına yaklaşık 20 mL otoklavlanmış steril ortam ekleyin).
    2. Filtrelenmiş su numunesinin uygun seyreltilerinin 100 μL'sini R2A Agar, Orta katılaştıktan sonra modifiye plaka üzerine eşit olarak yayın. Denemeyi yinelenen olarak gerçekleştirin.
    3. Yukarıdaki tüm plakaları 48 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin (izolasyon için kullanılan ortama bağlı olarak sıcaklığı ve inkübasyon süresini değiştirin).
    4. Toplam bakteri yükünü, denklem (1) kullanarak mililitre başına koloni oluşturan birimler (CFU / mL) cinsinden ifade edin:
      figure-protocol-1(1)
  2. AR bakteri sayısının belirlenmesi
    1. 2.1.1-2.1.4 adımlarını izleyin. Bununla birlikte, R2A Agar yerine, Modifiye plakalar, R2A Agar, Sefotaksim (3 μg / mL), siprofloksasin (0.5 μg / mL), eritromisin (20 μg / mL), kanamisin (15 μg / mL) ve vankomisin (3 μg / mL) olmak üzere beş farklı antibiyotikle ayrı ayrı desteklenen Modifiye plakalar kullanın.
    2. Adım 2.2.1'de belirtildiği gibi nihai antibiyotik konsantrasyonunu elde etmek için antibiyotikleri ayrı ayrı 20 mL steril erimiş R2A Agar, Modifiye (erimiş R2A Agar'ın sıcaklığı ile, ≤40 ° C'de modifiye edilmiş) içeren tüplere ekleyin.
    3. Karıştırmak için girdap yapın ve agar katılaşmadan önce steril Petri plakalarına dökün. Denemeyi yinelenen olarak gerçekleştirin.
    4. Yukarıdaki tüm plakaları 48 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin (farklı bir ortam kullanıyorsanız, sıcaklık ve kuluçka süresi değişebilir).
    5. Kalite kontrolü ve antibiyotiklerin etkinliğini kontrol etmek için, Escherichia coli ATCC 25922 ve Staphylococcus aureus ATCC 29213 suşlarının 100 μL bakteriyel süspansiyonlarını, ilgili antibiyotik içeren R2A Agar, Modifiye plakalara yayın (aşılama için kullanılan taze kültürün yoğunluğunun OD = 600 nm'de 0.5 olduğundan emin olun).
    6. Antibiyotiğe dirençli bakteri sayısını, adım 2.1.4'te açıklandığı gibi CFU / mL cinsinden belirleyin.
  3. İzolatların gliserol stokları
    1. Morfolojik olarak farklı AR kolonilerini seçin.
    2. İlgili antibiyotiği içeren 2 mL'lik steril Luria-Bertani suyunda tek bir izole koloni askıya alın (örneğin, sefotaksim içeren bir plakadan bir koloni seçilmişse, koloniyi 2.3.1 adımından itibaren kendi konsantrasyonunda cefoim taksi içeren steril Luria-Bertani suyunda aşılayın).
    3. OD600 0,5'e ulaşana kadar aşılanmış tüpleri 80 rpm'de 37 ° C'de inkübe edin.
    4. Aseptik koşullar altında 2.3.3 adımından 250 μL steril% 100 gliserol içine 250 μL kültür süspansiyonunu karıştırarak izolatların gliserol stoklarını hazırlayın.
    5. Gliserol stoklarını daha fazla analize kadar -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Kültürlerin gliserol stoklarından yeniden canlanması için, gliserol stoklarını 4 ° C'de çözün. Bu stoğun bir ilmekini, ilgili antibiyotiği içeren 2 mL steril Luria-Bertani suyuna aşılayın ve büyümesine izin verin.

3. 16S rRNA gen dizilimi ile kültürlenebilir bakterilerin tanımlanması

  1. PCR için izolatlardan DNA şablonunun hazırlanması
    NOT: Ham DNA'nın bakterilerden izolasyonu için PCR için DNA şablonunun hazırlanması için açıklanan protokol Carlson ve ark.10 tarafından verilmiştir.
    1. Steril bir kürdan kullanarak, bir Petri plakasında büyüyen izolatın tek, izole edilmiş, saf bir kolonisini alın. Bakteri kolonisini steril bir mikrosantrifüj tüpünde 100 μL steril çift damıtılmış suda askıya alın ve 10 dakika kaynatın.
    2. Enkazı peletlemek için süspansiyonu 2 dakika boyunca 10.000 × g'de santrifüj yapın ve süpernatantı ham DNA şablonu olarak kullanılmak üzere taze steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  2. 16S rRNA geninin V3 bölgesinin hedeflenen PCR amplifikasyonu ve dizilimi
    1. Tablo 1'de belirtildiği gibi, PCR amplifikasyonu için bir PCR tüpünde reaksiyon karışımının 40 μL'sini hazırlayın.
      NOT: DNA preparatı, kontaminasyon olasılığını en aza indirirken bir buz bloğu üzerinde yapılmalıdır (reaktifleri tutarken eldiven giyin ve çalışma yüzeyini% 70 etanol ile iyice temizleyin).
    2. Tüpü termal bloğa yerleştirin ve PCR termal çevrimcisinde uygun programı çalıştırın. Standartlaştırılmış PCR döngü koşulları ve 16S rRNA genlerinin V3 bölgelerinin amplifikasyonu için primer bilgiler için Tablo 2'ye bakınız.
    3. Amplikonları çözmek ve görselleştirmek için agaroz jel elektroforezi (AGE) uygulayın. Yükseltilmiş PCR ürününün 10 μL'sini ve 2 μL 6x jel yükleme tamponunu (Tablo 3) karıştırın ve bu karışımı, agaroz jelinin 100 mL'sinde 0.5 μL ethidyum bromür (EtBr) içeren 100 mL 1x TAE tamponunun 100 mL'sinde 1.5 g agaroz tozu [Tablo 3] içinde 1.5 g agaroz tozu [Tablo 3] içinde kuyucuklara yükleyin.
      DİKKAT: EtBr güçlü bir kanserojendir. EtBr ve EtBr içeren jeller kullanılırken eldivenler her zaman giyilmelidir.
    4. Amplikonların büyüklüğünün tahmini için DNA merdiveni ekleyin.
    5. Jelin elektroforezini 80-100 V'ta bir TAE tank tamponunda gerçekleştirin.
    6. İzleme boyası jelin 3 / 4'ünü çalıştırdığında, elektroforezi durdurun ve amplikon bantlarını bir UV transilluminator altında görselleştirin.
    7. İzolatı tanımlamak için 16S rRNA gen dizilimi için PCR ürününü (amplicon) kullanın.
    8. Amplikonu denklem (2) kullanarak spektrofotometrik analize tabi tutarak ölçün.
      figure-protocol-2(2)
    9. DNA'nın saflığını kontrol etmek için A260/A280 oranını hesaplayın.
      NOT: İdeal olarak, bu sayı 1,5'in üzerinde ve tercihen 1,8 ile 2,0 arasında olmalıdır.
    10. İzolatları tanımlamak için, uygun bir hizalama arama aracı kullanarak dizi veritabanlarıyla elde edilen dizileri karşılaştırın.

4. Antibiyotik duyarlılık testi kullanılarak izolatlarda antibiyotik direncinin saptanması

NOT: Bu protokol, disk difüzyonu ile antibiyotik duyarlılık testi (AST) yöntemini açıklamaktadır. Aşağıdaki antibiyotik diskler kullanıldı: sefotaksim (5 μg), ampisilin (10 μg), levofloksasin (5 μg), kloramfenikol (30 μg), tigesiklin (15 μg), seftriakson (30 μg), imipenem (10 μg), gentamisin (10 μg), neomisin (10 μg), trimetoprim (5 μg) ve siprofloksasin (5 μg).

  1. AST için inokulumun hazırlanması
    1. Luria-Bertani suyu (herhangi bir antibiyotik olmadan) gibi steril seçici olmayan bir ortamın 2 mL'sinde steril bir döngü kullanarak tek, izole edilmiş, saflaştırılmış bir AR kolonisini aseptik olarak aşılayın ve gece boyunca 80 rpm'de 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Bir gecede yetiştirilen kültürün 100-150 μL'sini (yaklaşık olarak, OD 600 = 1.8-2.0) 2 mL'lik taze seçici olmayan Luria-Bertani et suyu ortamında alarak yeniden askıya alın ve 2-4 saat boyunca inkübe edin (OD600 0.4-0.5'e ulaşana kadar).
    3. Bu taze yetiştirilmiş kültür süspansiyonunu, steril% 0.85 tuzlu su çözeltisi kullanarak, kültürün yoğunluğu kabaca 1-2 × 108 hücre / mL'ye karşılık gelen 0.5 McFarland standardına (yaklaşık olarak OD600 = 0.1) eşit olacak şekilde seyreltin.
    4. Eşit hücre dağılımı için bakteri süspansiyonunu nazikçe karıştırın.
    5. Yukarıdaki süspansiyonu seyreltmeden sonraki 15 dakika içinde kullanın.
  2. Agar plakalarının aşılanması
    1. 1.000 mL çift damıtılmış suda 38 g MHA'yı karıştırarak AST'yi gerçekleştirmek için Mueller-Hinton Agar (MHA) plakaları hazırlayın ve karışımı ısıtarak çözün. Çözünmüş karışımı 121 °C'de, 15 dakika boyunca 15 psi'de otoklav yapın.
    2. Plakalardaki MHA derinliğinin 4 mm (plaka başına 25 mL ortam) olduğundan emin olun.
    3. Aynı zamanda, antibiyotik disklerini dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına ısıtın.
      NOT: Antibiyotik diskler, diskler üzerinde daha sonra inhibisyon bölgesini (ZOI) etkileyebilecek olası yoğuşma tehlikesini azaltmak için diskler başlangıçta 4 ° C'de ve daha sonra oda sıcaklığında çözülerek kademeli olarak çözülmelidir.
    4. Aseptik koşullar altında, steril bir pamuklu çubuğu adım 4.1'de hazırlanan inokuluma batırın ve plakaların aşırı aşılanmasını önlemek için fazla süspansiyonu çıkarın.
    5. Kültürü, MHA plakasının tepesinden başlayarak ve kenardan kenara ileri geri giderek plakalara eşit olarak yayın. Ovalarken plakayı 60° döndürün.
  3. Antibiyotik disklerin uygulanması
    1. Alevle sterilize edilmiş forsepslerin yardımıyla, antibiyotik diskleri aseptik olarak aşılanmış MHA plakalarına aktarın ve agar ile tam seviye teması sağlamak için disklere hafifçe bastırın.
      NOT: Bu prosedür, kültürün plakalara aşılanmasından sonraki 15 dakika içinde yapılmalıdır.
    2. İnhibisyon bölgelerinin üst üste binmesini önlemek için organizmayı, kullanılan antibiyotiği ve plakanın boyutunu dikkate alarak agar plakasına uygun sayıda antibiyotik disk yerleştirin.
      NOT: 90 mm'lik dairesel bir plaka üzerine dört ila beş disk yerleştirilebilir.
  4. Plakaların inkübasyonu
    1. Antibiyotik disklerin uygulanmasından sonraki 15 dakika içinde, plakaları ters çevirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. Sonuçların yorumlanması
    1. ZOI çapını milimetre (mm) cinsinden ölçün ve EUCAST11 tarafından verilen kesme noktası değerlerine göre yorumlayın. Aşağıda verilen iki örneğe bakın.
      1. Enterobakteraller için bir siprofloksasin antibiyotik diski (5 μg) için bölge çapı kesme noktası (mm) S ≥ 25 ve R < 22'dir, yani ZOI 25 mm'≥ hassas (S) olarak kabul edilirken, ZOI 22 mm'< dirençli (R) olduğu anlamına gelir. ZOI çapı 22 ila 25 arasında düşerse, izolat ara (I) olarak kabul edilir.
      2. Staphylococcus spp. için bir kloramfenikol antibiyotik diski (30 μg) için bölge çapı kesme noktası (mm) S ≥ 18 ve R < 18'dir, yani ZOI 18 mm'≥ hassas olarak kabul edilirken, ZOI 18 mm'< dirençlidir.
    2. İzolatın dirençli olduğu antibiyotik sayısının izolatın maruz kaldığı toplam antibiyotik sayısına oranını bularak çoklu antibiyotik direnci (MAR) indeksini belirleyin.
      NOT: Kalite kontrol için, E. coli ATCC 25922 ve S. Aureus ATCC 29213, adım 4'te olduğu gibi protokolü izleyen referans gerinimler olarak kullanılır.

5. İzolatlardaki antibiyotik direnç genlerinin PCR tabanlı tespiti

  1. İzolatlardaki ARG'lerin tanımlanması için standart bir PCR protokolü kullanın. Adım 3.1'de verilen protokolü kullanarak DNA şablonunu hazırlayın.
    NOT: Bu çalışmada kullanılan PCR döngü koşulları 10 dakika boyunca 94 ° C, ardından 30 s için 94 ° C'lik 35 döngü, uygun sıcaklıkta 30 s tavlama (her astar seti için standartlaştırıldığı gibi), 40 s için 72 ° C'de uzatma ve 5 dakika boyunca 72 ° C'de son bir uzatma idi. Reaksiyon karışımı Tablo 4'te açıklanmıştır. ARG'lerin, astarların ve tavlama sıcaklıklarının listesi Tablo 5'te verilmiştir.
  2. Amplikonların saflığını çözümlemek, görselleştirmek ve kontrol etmek için 3.2.3-3.2.10 adımlarını izleyin.

6. Toplam bakteri çeşitliliğinin tanımlanması ve metagenomdaki ARG'lerin tespiti için tüm metagenomik DNA analizi

  1. Su örneğinden toplam DNA'nın (metagenom) ekstraksiyonu
    1. Metagenomik DNA'yı filtrelenmiş su örneklerinden çıkarın.
      NOT: Mevcut çalışmada, metagenomik DNA (toplam DNA), üreticinin protokolünü takiben referans alınan DNA izolasyon kiti kullanılarak filtrelenmiş su örneklerinden ekstrakte edilmiştir ( bkz.
    2. Ekstrakte edilen metagenomik DNA'nın 3 μL'sini % 0.8'lik bir agaroz jeline yükleyerek DNA'nın kalitesini kontrol edin ve jeli yaklaşık 30 dakika boyunca 80-110 V'ta çalıştırın.
    3. Tek bir sağlam bandın varlığını kontrol edin.
    4. DNA konsantrasyonunu bir florometre kullanarak kontrol edin.
  2. Bakteriyel çeşitliliğin belirlenmesi ve tüm metagenomik DNA dizilimi kullanılarak ARG'lerin tespiti
    1. Kütüphane hazırlama ve PCR amplifikasyonu:
      1. Referans verilen DNA kütüphanesi hazırlık kitini kullanarak bir çift uçlu dizileme kütüphanesi hazırlayın ( bkz.
      2. DNA'yı 200 ng DNA alarak ve mekanik olarak daha küçük parçalara ayırarak adaptör ligasyonu için hazırlayın, ardından 3' uçlarına bir "A" eklendiği sürekli bir son onarım adımı izleyin.
      3. Dizileme için kullanılan platforma bağlı olarak, DNA parçalarının her iki ucuna da spesifik adaptörler bağlayın.
        NOT: Çift barkodlu kütüphaneleri sıralama için bir akış hücresine bağlamak için çok önemli diziler bu bağdaştırıcılarda bulunur. Bu, adaptör bağlı parçaların PCR amplifikasyonuna ve standart sıralama astarlarının bağlanmasına izin verir.
      4. Kaliteyi ve miktarı kontrol etmek için, üreticinin talimatlarına göre yüksek hassasiyetli bir DNA çipi kullanarak güçlendirilmiş kütüphaneyi analiz edin.
    2. Küme oluşturma ve sıralama:
      1. Yükseltilmiş kitaplığı, küme oluşturma ve sonraki sıralama için uygun sıralama platformuna yükleyin.
        NOT: Kütüphane molekülleri, çift uçlu akış hücresi üzerindeki tamamlayıcı adaptör oligolarına bağlanır. Sıralama sırasında, ileri iplikçikler, ters ipliğin yeniden sentezinden sonra seçici olarak bölünür. Bu kopyalanan ters iplikçik daha sonra parçanın karşı ucundan sıralanır.
    3. Biyoinformatik analiz:
      1. Uygun platformu kullanarak yüksek kaliteli verilerden iskeleler oluşturun.
      2. Bu iskeleleri, ARG'lerin taksonomik sınıflandırması ve tanımlanması için biyoinformatik analize tabi tutun.
        NOT: Toplam bakteri çeşitliliğinin tanımlanması ve metagenomdaki ARG'lerin tespiti için tüm metagenomik DNA analizinin iş akışı Şekil 1'de verilmiştir. Makalede açıklanan metodolojinin tamamının bir akış şeması Şekil 2'de verilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Toplam bakteri yükü ve antibiyotiğe dirençli (AR) bakteri sayısı
Toplam bakteri yükünün sayımı, su örneklerinin 10−4 ila 10−6 kat seyreltilmesinin R2A Agar, Modifiye ortam üzerine yayılmasıyla gerçekleştirildi. AR bakteri sayısının sayımı için, antibiyotik içeren ortam plakalarına 10−3 ila 10−6 kat seyreltme yayıldı (Şekil 3). Toplam ve AR bakteri sayıları CFU / mL olarak hesaplandı ve tüm kaplama deneyleri çift olarak gerçekleş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Örneklem toplama ve işleme önemli bir rol oynar ve çalışmanın sonuçlarını ve yorumlanmasını etkileyebilir. Bu nedenle, numunelerdeki değişkenliği dışlamak için, incelenen tatlı su kütlesinin birden fazla yerinde örnekleme yapmak önemlidir. Bu tür numuneleri işlerken uygun aseptik çevre koşullarının korunması, kontaminasyonu önleyebilir. Ayrıca, ekstrakte edilen nükleik asitlerin kalitesini ve miktarını etkileyebilecek bakteri bileşimindeki değişiklikleri önlemek için, transit koşulları, numune toplama noktasından sonraki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek çatışan çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Mumbai Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Bölümü-Üniversite Araştırma ve Bilimsel Mükemmellik Teşvik (DST-PURSE) Programından mali hibelerle desteklenmiştir. Devika Ghadigaonkar, program kapsamında Proje Üyesi olarak çalıştı. Bilim ve Teknoloji Bölümü-Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu (DST-SERB) Proje no: CRG/2018/003624 kapsamında Kıdemli Araştırma Görevlisi Harshali Shinde tarafından sağlanan teknik yardım kabul edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 bp DNA merdiveniHimediaMBT049-50LNAmplikonların boyutunun tahmini için
2x PCR Taq mastermixHiMediaMBT061-50RPCR reaksiyon karışımı yapmak için
37 & C İnkübatörGS-192, Gayatri ScientificNABakterilerin inkübasyonu için
6x Jel Yükleme TamponuHiMediaML015-1MLDNA örneğini tartmaya ve elektroforezin ilerlemesini izlemeye yardımcı olan Yükleme ve İzleme boyası
Agaroz tozuHimediaMB229-50GAgaroz Jel Elektroforezi (AGE) Ampisilin
antibiyotik diskiHiMediaSD002AST
OtoklavEquitronNAgerçekleştirmek için Ortamın, cam plakaların, test tüplerinin vb. sterilizasyonu için gereklidir
Biyoanalizör 2100Agilent TechnologiesNAGüçlendirilmiş kitaplığın kalitesini ve miktarını kontrol etmek için
Bisafety B2 KabiniIMSETIMSET BSC-Class II Tip B2Bakteri kültürü, AST vb. gibi mikrobiyolojik çalışmalar için kullanılır.
Sefotaksim antibiyotik diskHiMediaSD295E-5VLAST gerçekleştirmek için
Sefotaksim antibiyotik tozuHiMediaTC352-5GAntibiyotiğe dirençli bakterilerin izolasyonu sırasında gerekli olan antibiyotik stok çözeltisinin hazırlanması için
Seftriakson antibiyotik diskHiMediaSD065AST
Santrifüj MinispinEppendorfMinispin Plus-5453 gerçekleştirmek içinHam DNA hazırlığı sırasında enkazı peletlemek için kullanılır
Kloramfenikol antibiyotik diskHiMediaSD006-5x50DSAST
Siprofloksasin antibiyotik diskiHiMediaSD060-5x50DSAST
Siprofloksasin antibiyotik tozuyapmak için HiMediaTC447-5GAntibiyotiğe dirençli izolasyon sırasında gerekli olan antibiyotik stok çözeltisinin hazırlanması için bakteri
KolorimetreArayışıNAKültür süspansiyonlarının OD'sini kontrol etmek için
Kapsamlı Antibiyotik Direnç Veritabanı (CARD) veritabanıARG'lerin işlevsel açıklaması; https://card.mcmaster.ca/
Soğutma Çalkalayıcı İnkübatörüBTL41 Allied ScientificNABakteri kültürü için ortam plakalarının inkübasyonu için
Derin Dondurucu (-40 &°; C)  HaierDW40L, Haier BiyomedikalGliserol stoklarının depolanması için
DNA Kitaplığı Hazırlık KitiNEB Next Illumina NA için Ultra DNA Kitaplığı Hazırlık KitiEşleştirilmiş uçlu dizileme kitaplığı hazırlığı
EDTAHiMediaGRM1195-100GAgaroz Jel Elektroforezi (AGE) için Jel çalıştırma tamponunun hazırlanması için
Elektroforez AparatıTechResource15 cm jel döküm tepsisiAgaroz jeli yapmak için  ve elektroforez yapmak 
Elektroforez Elektrotlu güç paketiGeneiNAAGE 
Eritromisin antibiyotik diskiHiMediaSD222-5VLAST gerçekleştirmek için
Eritromisin antibiyotik tozuHiMediaCMS528-1GAntibiyotiğe dirençli bakterilerin izolasyonu sırasında gerekli olan antibiyotik stok çözeltisinin hazırlanması için
Eritromisin antibiyotik tozuHiMediaTC024-5GAntibiyotiğe dirençli izolasyon sırasında gerekli olan antibiyotik stok çözeltisinin hazırlanması için bakteri
Escherichia coli ATCC 25922       HiMedia0335X-1yapılırken kontrol olarak kullanılır
HiMediaMB071-1GJel Dokümantasyon Sistemi altında elektroforez sonrası DNA'nın interkalasyon ajanı ve görselleştirilmesi
FlorometreQubit 2.0NAEkstrakte edilmiş metagenomik DNA
Jel Dokümantasyon SistemiBioRadkonsantrasyonunu belirlemek içinElektroforezden sonra PCR amplikonlarını görselleştirmek için kullanılır
Gentamisin antibiyotik diskHiMediaSD170-5x50DSAST
Buzul Asetik Asitgerçekleştirmek için HiMediaAS119-500MLAgaroz Jel Elektroforezi (AGE) için Jel çalışma tamponunun hazırlanması için
GliserolHiMediaGRM1027-500MLGliserol stokları yapmak için
İmipenem antibiyotik diskHiMediaSD073AST
Kaiju DatabaseNAgerçekleştirmek için NA Okumalarıntaksonomik sınıflandırması için; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamisin antibiyotik diskiHiMediaSD017-5x50DSAST
Kanamisin antibiyotik tozuHiMediaMB105-5Ggerçekleştirmek için Antibiyotiğe dirençli bakterilerin izolasyonu sırasında gerekli olan antibiyotik stok çözeltisinin hazırlanması için
Levofloksasin antibiyotik diskHiMediaSD216-5VLAST
Luria Bertani suyuHimediaM1245-500Ggerçekleştirmek için Kültürlerin zenginleştirilmesi için
McFarland StandartlarıHimediaR092-1HayırKültür süspansiyonunun yoğunluğunu karşılaştırmak için
Moleküler Biyoloji suHiMediaTCL018-500MLPCR reaksiyon karışımı
yapmak içinMueller-Hinton Agar (MHA) HiMediaM173-500GAntibiyotc Duyarlılık Testi (AST) yapmak içinNeomisin
antibiyotik diskiHiMediaSD731-5x50DSAST
PCR Gradient Thermal Cyclergerçekleştirmek için EppendorfMastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz 16S rRNA bölgesinin ve çeşitli Antibiyotik Direnç genlerinin amplifikasyonu için PCR yapmak için kullanılır
Astarlar PCR amplikasyonu içinXcelrisNA
R2A Agar, Modifiye HiMediaM1743Toplam ve antibiyotiğe dirençli (AR) bakteri yükünün izolasyonu için ortam plakalarının hazırlanması için
İskele nesliCLC Genomics Workbench 6.0NAİskele üretimi için
SıralayıcıIllumina platformu (2 x 150 bp kimya)NAAmplifiye edilmiş kütüphane
 HiMediaTC046-500GSu örneğini seri olarak seyreltmek için %0,85 tuzlu
Toprak DNA izolasyon KitiXcelgenNAFiltrelenmiş su örneğinden tüm metagenomik DNA'nın ekstraksiyonu için 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213HiMedia0365PAST yapılırken kontrol olarak kullanılır
Taksonomik SınıflandırmaKaiju ioinformatics toolNAOkumaların filumdan cins düzeyine kadar farklı taksonomik gruplara sınıflandırılması için 
Kapsamlı Antibiyotik Direnç Veritabanı (CARD)NAARG'lerin fonksiyonel açıklaması için
Tigesiklin antibiyotik diskiHiMediaSD278AST
Trimetoprim antibiyotik diskigerçekleştirmek için HiMediaSD039-5x50DSAST
Tris tabanıgerçekleştirmek için HiMediaTC072-500GAgaroz Jel için Jel çalışma tamponunun hazırlanması için Elektroforez (AGE)
Vankomisin antibiyotik tozuHiMediaCMS217Antibiyotiğe dirençli bakterilerin izolasyonu sırasında gerekli olan antibiyotik stok solüsyonunun hazırlanması için
Tartı TerazisiMettler ToledoME204 Mettler ToledoOrtam tozlarını, reaktif tozlarını vb. tartmak için kullanılır.
NA - Uygulanamaz
sırasında amplikonları çözmek için AST Etidyum Bromür   Sodyum Klorür dizilimi su hazırlamak için

Kaynaklar

  1. Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
  2. Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139(2021).
  3. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
  4. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
  5. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
  6. Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
  7. Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180(2019).
  8. Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
  9. de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592(2021).
  10. Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
  11. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
  12. Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
  13. Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350(2015).
  14. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
  15. Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  16. Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
  17. Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  18. Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173(2013).
  19. Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062(2022).
  20. Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
  21. Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356(2014).
  22. Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
  23. Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Su Kaynakl BakterilerMetagenomik DNA AnaliziK lt r Tabanl Teknikler16S rRNA SekanslamaAntibiyotik Duyarl l k Testioklu Antibiyotik DirenciTatl Su MikrobiyotasBeta Laktamaz Genleri

İlgili makaleler