Method Article

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

DOI:

10.3791/63973

⸱

July 12th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Johannes Kepler University Linz, 2Charité - University Medicine Berlin, 3Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, tek hücrelerde çoklu yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemoterapötik ilaçlar, kanser hücrelerinde onarılamaz DNA hasarına neden olarak apoptoza veya erken yaşlanmaya neden olabilir. Apoptotik hücre ölümünün aksine, yaşlanma, kanser hücrelerinin yayılmasını kısıtlayan temelde farklı bir makinedir. Onlarca yıllık bilimsel çalışmalar, yaşlanan kanser hücrelerinin tümörlerde ve kanser hücrelerini ve stromal hücreleri modüle eden mikro ortamlarda karmaşık patolojik etkilerini ortaya koymuştur. Yeni kanıtlar, yaşlanmanın kanser tedavisi sırasında güçlü bir prognostik faktör olduğunu ve bu nedenle kanser örneklerinde yaşlanan hücrelerin hızlı ve doğru bir şekilde tespit edilmesinin gerekli olduğunu göstermektedir. Bu yazıda kanser hücrelerinde tedaviye bağlı yaşlanmayı (TIS) görselleştirmek ve saptamak için bir yöntem sunulmaktadır. Diffüz büyük B hücreli lenfoma (DLBCL) hücre hatları mafosfamid (MAF) veya daunorubisin (DN) ile tedavi edildi ve yaşlanma belirteci, yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal), DNA sentez belirteci 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) ve DNA hasar belirteci gama-H2AX (γH2AX) açısından incelendi. Akış sitometresi görüntüleme, kanser hücrelerindeki üç belirteci aynı anda görselleştirmek ve ölçmek için kısa sürede yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüler üretmeye yardımcı olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli uyaranlar hücresel yaşlanmayı tetikleyebilir ve hücrelerin kararlı bir hücre döngüsü tutuklaması durumuna girmesine neden olabilir. Bu uyaranlar, içsel sinyal değişikliklerini veya dışsal stresleri içerir. İçsel sinyaller arasında ilerleyici telomer kısalması, telomer yapısındaki değişiklikler, epigenetik modifikasyon, proteostaz bozuklukları, mitokondriyal disfonksiyon ve onkogenlerin aktivasyonu sayılabilir. Dışsal stresler arasında enflamatuar ve/veya doku hasarı sinyalleri, radyasyon veya kimyasal tedavi ve beslenme yoksunluğu 1,2,3,4<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücresel yaşlanmayı indüklemek için mafosfamid veya daunorubisin tedavisi ile DLBCL hücre hatları

NOT: Protokol aynı zamanda yapışkan kanser hücreleri için de çalışır. Hücre büyüklüğüne bağlı olarak, tohum 1-2, 10 5 hücreyi 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna × ve plakayı, işlemden bir gece önce%5 CO2, 37 ° C inkübatörde inkübe edin. Protokol adımları, süspansiyon hücreleri ile aynıdır, ancak iki istisna dışında. İlk olarak, hücrelerin adım 3.4'ten sonra plakadan tripsinize edilmesi gerekir. İkincisi, yıkama adımları tripsinizasyondan önce santrifüjleme yapılmadan gerçekleştirilir.

  1. DLBCL....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek renkli kontrol örneklerinin kayıtlı verileri yüklenerek görüntü analiz yazılımı kullanılarak bir kompanzasyon matrisi oluşturulmuştur. Ek Şekil S1'de gösterildiği gibi, EdU'dan C12FDG'ye ihmal edilemeyen (katsayı değeri ≥ 0.1) bir ışık yayılımı 0.248 çapraz konuşma katsayısı değeri ile tespit edilirken, diğer kanallar arasındaki çapraz konuşma anlamlı değildi. Dört farklı DLBCL hücre hattı, hücresel yaşlanmayı indüklemek için 5 μg / mL MAF veya 20 ng / mL DN ile tedavi edildi ve geleneksel.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, kemoterapi tedavisi üzerine dört farklı DLBCL hücre hattının yaşlanma giriş kabiliyetini, parlak alan görüntüleme ve akış sitometrisine dayalı niceleme ile inceledi. Tek hücreli bir düzeyde, tedavi edilen KARPAS422 ve WSU-DLCL2 hücrelerinde ve OCI-LY1 hücrelerinde daha az ölçüde majör C12FDG + EdU-Ki67 + yaşlanan popülasyonları başarıyla tespit ettik, SU-DHL6 hücre hattı tedaviye dirençliydi. Hücre hatları arasındaki yaşlanma giriş kabiliyetindeki fark, farklı genomi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Linz Johannes Kepler Üniversitesi'nden Yong Yu'ya verilen bir hibe ile desteklenmiştir (BERM16108001).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Fosfo (Ser139) AntikorBiolegend613407
Anti-Ki-67 Fare Monoklonal Antikoru (Alexa Fluor 647)Biolegend350509
C12FDG (5-Dodekanoylaminofloresein Di-β-D-Galaktopiranosid)Fisher Scientific11590276
Klorokin -difosifSigma aldrichC6628
Temizleyici (Coulter Clenz)Beckman Coulter8546929
Click-iT EdU Pasifik Mavi Akış Sitometri Test KitiThermo ScientificC10418
DaunorubisinMedchemexpressHY-13062A
Debubbler (%70 İzopropanol)Millipore1.3704
Görüntü Analiz yazılımı (Amnis  FİKİRLER  6.3)LuminexCN-SW69-12
Cihaz ve görüntüleme yazılımı (Amnis  ImageStreamX  Mk II Görüntüleme Akış Sitometresi Sistemi ve INSPIRE yazılımı)Luminex100220
KARPASDSMZACC 31
mafosfamid sikloheksilaminNiomechD-17272
OCI-LY1DSMZACC 722
ParaformaldehitFisher Scientific11473704
PETG (2-Feniletil-β-D-tiyogalaktozid) Sigma aldrichP4902
saponinSigma aldrich47036
KılıfMilliporeBSS-1006-B
Luminex400041için SpeedBead
Kiti (% 0.4-0.7 Hipoklorit)VWRJT9416-1
SU-DHL6DSMZACC 572
WSU-DLCL2DSMZACC 575
ImageStream Sterilizatörü Serisi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  2. Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119),....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Imaging Flow CytometrySenescence MarkersTherapy Induced SenescenceFluorescent Marker DetectionDLBCL Cell LinesGamma H2AX DetectionEdU IncorporationC12 FDG StainingSingle Cell ImagingNuclear Foci Quantification

Related Articles