Yöntem makalesi

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

4.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63980

⸱

27 Temmuz 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University, 2School of Biological Sciences, University of California, San Diego

Bu makalede

Özet

Hücre dışı bakteriler ve Orsay virüsü ve mikrosporidia (mantarlar) gibi hücre içi patojenler de dahil olmak üzere bağırsak mikropları genellikle vahşi Caenorhabditis nematodları ile ilişkilidir. Bu makalede, C. elegans nematodlarını kolonize eden ve/veya enfekte eden mikropların tespiti ve nicelleştirilmesi ve laboratuvarda kontrollü enfeksiyonlardan sonra patojen yükünün ölçülmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Yabani Caenorhabditis nematodlarının bağırsaklarında, bağırsak mikrobiyom bakterileri ve mikrosporidia ve virüsler gibi patojenler de dahil olmak üzere çeşitli mikroorganizmalar yaşar. Caenorhabditis elegans ve memeli bağırsak hücreleri arasındaki benzerlikler ve C. elegans sisteminin gücü nedeniyle, bu konakçı bağırsak-mikrop etkileşimlerini in vivo olarak incelemek için bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Bu etkileşimlerin bazı yönlerini parlak alan mikroskobu ile gözlemlemek mümkün olsa da, mikropları doğru bir şekilde sınıflandırmak ve daha kesin araçlar olmadan kolonizasyon veya enfeksiyonun derecesini karakterize etmek zordur. RNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH), nematodlardaki mikropları vahşi doğadan tanımlamak ve görselleştirmek veya laboratuarda mikroplarla enfekte olmuş nematodlarda enfeksiyonu deneysel olarak karakterize etmek ve ölçmek için bir araç olarak kullanılabilir. Son derece bol miktarda bulunan küçük alt birim ribozomal RNA'yı etiketleyen FISH probları, bakteriler ve mikrosporidyen hücreler için parlak bir sinyal üretir. Birçok tür için ortak olan ribozomal RNA'nın korunmuş bölgelerini hedeflemek için tasarlanan problar, çok çeşitli mikropları tespit edebilirken, ribozomal RNA'nın farklı bölgelerini hedeflemek daha dar algılama için yararlıdır. Benzer şekilde, problar viral RNA'yı etiketlemek için tasarlanabilir. Paraformaldehit (PFA) veya aseton fiksasyonu ile RNA FISH boyama için bir protokol sunulmuştur. PFA fiksasyonu bakteri, mikrosporidia ve virüslerle ilişkili nematodlar için idealdir, oysa mikrosporida sporlarının görselleştirilmesi için aseton fiksasyonu gereklidir. Hayvanlar ilk önce paraformaldehit veya aseton içinde yıkandı ve sabitlendi. Fiksasyondan sonra, probların istenen hedefe hibridizasyonuna izin vermek için FISH probları numunelerle inkübe edildi. Hayvanlar tekrar yıkandı ve daha sonra mikroskop slaytlarında veya otomatik yaklaşımlar kullanılarak incelendi. Genel olarak, bu FISH protokolü, genetik araçların bulunmadığı mikroplar da dahil olmak üzere, C. elegans bağırsağında yaşayan mikropların tespitini, tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlar.

Giriş

Caenorhabditis elegans, bağırsak epitel hücrelerinde doğuştan gelen bağışıklık ve konakçı-mikrop etkileşimlerini incelemek için güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır 1,2. Şeffaf bir gövdeye ve sadece 20 bağırsak hücresine sahip olması nedeniyle, C. elegans, sağlam bir organizma bağlamında mikrobiyal bağırsak kolonizasyonu ve enfeksiyon süreçlerini izlemek için uygun bir sistemi temsil eder. Nematod bağırsak hücreleri, memeli bağırsak epitel hücreleri ile çoklu morfolojik ve fonksiyonel benzerlikler paylaşır, bu da onları mikrobiyom kolonizasyonunu ve patojen enfeksiyonunu yöneten süreçlerin diseksiyonu için inatlanabilir bir in vivo model haline getirir 3,4,5,6.

Yabani C. elegans, bağırsağı kolonize eden ve enfekte eden çeşitli mikroplarla beslenir ve bu nematodların örneklenmesi, virüslerin, ökaryotların (mantarlar, oomisitler) ve doğal olarak bu konakçı 7,8,9,10 ile ilişkili bakterilerin keşfiyle sonuçlanmıştır. Orsay virüsünün bağırsağı enfekte ettiği bulundu ve şu anda C. elegans 9'un bilinen tek doğal virüsüdür. Mikrosporidia, vahşi yakalanan Caenorhabditis'te en sık bulunan enfeksiyon olan mantar ile ilişkili zorunlu hücre içi patojenlerdir ve C. elegans ve ilgili nematodları enfekte eden birkaç tür keşfedilmiştir 8,11. Vahşi yakalanan C. elegans'ın bağırsak lümeninde yaşayan birçok bakteri yaygın olarak bulunur ve C. elegans mikrobiyomu (CeMbio) 6,12,13,14 için doğal bir model olarak birkaç tür kurulmuştur. C. elegans'ı doğal olarak kolonileştiren ve / veya enfekte eden mikropları keşfetmek ve karakterize etmek, bu konakçı-mikrop etkileşimlerini yöneten genetik mekanizmaları anlamak ve yalnızca sağlam bir konakçı hayvan bağlamında meydana gelen yeni mikrobiyal süreçleri görselleştirmek için çok önemlidir.

Örneklemeden sonra, yabani nematodlar, enfeksiyon veya kolonizasyonun göstergesi olan fenotipleri aramak için diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu ile taranır. Örneğin, bağırsak hücrelerinin stereotipik granül görünümündeki değişiklikler, hücre içi parazit enfeksiyonunun varlığı ile ilişkili olabilir8. Spesifik olarak, bağırsak granüllerinin kaybı ve azalmış sitozolik viskozite viral enfeksiyonun belirtileridir, oysa bağırsak granüllerinin 'oluklar' halinde yeniden düzenlenmesi, Nematocida 8,9 cinsinde mikrosporidia ile enfeksiyonu gösterebilir. Yabani C. elegans örneklerinde çok çeşitli mikroplar bulunduğundan, DIC mikroskobu ile mikropları ayırt etmek zor olabilir. Mikropların konakçı içindeki uzamsal dağılımı ile ilgili bilgilerin, birçok mikrobun küçük boyutu nedeniyle tespit edilmesi de zor olabilir15. Ek olarak, in vitro olarak ilgilenilen herhangi bir mikrobun kültürlenmesi her zaman mümkün değildir, bu da tespit ve / veya nicelemede zorluklara yol açar.

RNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH), sabit hücrelerdeki küçük ribozomal alt birimin (SSU) RNA'sına bağlanan floresan probları kullanarak mikropları floresan olarak etiketlemek için bir yöntem sağlar. Morfolojik özelliklerin analizi belirli bir mikrop sınıfını gösteriyorsa, bu tür mikropların spesifik veya geniş sınıflarını hedefleyen FISH probları kullanılabilir. Örneğin, EUB338, bakteriyel SSU için evrensel bir prob olarak kabul edilir ve yaygın olarak çok çeşitli bakterileri tespit etmek için kullanılır16. Burada açıklanan protokol, bir florofor ile etiketlenmiş ve daha önce tasarlanmış problar mevcut olmasına rağmen, ilgilenilen mikrobun hedef SSU'sunu tamamlayıcı olacak şekilde özel olarak tasarlanmış tek sarmallı DNA probları kullanır16. Mikropların SSU'sunu hedeflemenin temel avantajı, tipik olarak hücredeki tüm RNA'nın% 80-90'ını oluşturan ve çok yüksek bir sinyal-gürültü oranıyla lekelenmeye yol açan bu RNA'nın nispeten büyük bolluğudur17. Problar ayrıca, virüs aktif olarak çoğalıyorsa, enfekte olmuş hücrelerde genellikle çok yüksek kopyalarda bulunan Orsay virüsü 9,18 gibi virüsleri tespit etmek için RNA'yı hedeflemek üzere tasarlanabilir.

Bilinen problarla elde edilen sonuçlara bağlı olarak, in situ tür doğrulaması için daha spesifik problar tasarlamak için daha fazla dizi bilgisi elde etmek gerekebilir. Yaygın bir yaklaşım, daha farklı olan bölgeleri (PCR yoluyla) yükseltmek için SSU'nun korunmuş bölgelerine (bakteriler için 16S ve ökaryotlar için 18S) karşı evrensel primerler kullanmaktır8. Bu dizi bilgisi kullanılarak, daha fazla türe özgüllüğe sahip problar tasarlanabilir. Bu FISH probları daha sonra mikropların kültürden bağımsız bir şekilde tanımlanmasını sağlayabilir8. Ek olarak, RNA FISH, filamentasyon veya doku lokalizasyon paternleri de dahil olmak üzere benzersiz morfolojik kolonizasyon ve enfeksiyon özellikleri hakkında fikir verebilir19,20. Farklı renkli FISH probları aynı anda kullanılabilir, bu da vahşi nematod numunelerindeki mikroplar arasında görsel ayrım yapılmasını ve bir konakçı15,20 içindeki mikrop-mikrop dinamiklerinin gözlemlenmesini sağlar. Ayrıca, RNA FISH boyaması, bilinen bir türün enfeksiyonu ve kolonizasyonunun, örneğin enfeksiyona karşı direnci artıran veya azaltan C. elegans mutantlarının karşılaştırılmasında patojen yükü hakkında fikir vermek için manuel olarak veya otomatik yaklaşımlar yoluyla kolayca ölçülebildiği konakçı-patojen etkileşim çalışmalarına uygulanabilir21.

Protokol

NOT: Nematodlar paraformaldehit çözeltisi (PFA) veya aseton ile sabitlenebilir. PFA, morfolojinin asetondan daha iyi görselleştirilmesine izin verir ve aseton tarafından tahrip edilen transgenik yeşil floresan proteininden (GFP) gelen sinyalleri koruyabilir. Bununla birlikte, bu yaşam aşamasının etiketlenmesini sağlamak için mikrosporidian sporları geçirgenleştirmek için aseton fiksasyonu gereklidir. Ayrıca, aseton PFA'dan daha uygun olabilir, çünkü daha az toksiktir ve numuneler, fiksatifin çıkarılmasına gerek kalmadan -20 ° C'lik bir dondurucuda asetonda birkaç gün saklanabilir. Aşağıda, PFA çözeltisini veya asetonu fiksatif olarak kullanan iki ayrı protokol bulunmaktadır. Protokol adımlarının görselleştirilmesi için bkz: Şekil 1.

1. PFA fiksasyonu ile FISH boyama

  1. Nematodları ilişkili mikroplarla hazırlayın
    1. Uygun gıda kaynağı ile tohumlanmış standart Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakaları üzerinde istenen ilgili mikropla nematodlar yetiştirin. İstenilen yaşam aşamasına ulaşılana kadar nematodları 20 ° C'de inkübe edin.
    2. Görselleştirilmesi istenen mikropla enfekte olmuş veya kolonize edilmiş Caenorhabditis suşunu içeren NGM plakalarına 2 mL M9 minimal tuz ortamı (42 mMNa 2HPO 4,22mM KH 2 PO 4, 8.6 mM NaCl, 19 mM NH4Cl) +% 0.1 Ara 20 ekleyin.
      NOT: Deterjan ilavesi, nematodların pipetlere ve mikrofüj tüplerine yapışmasını önlemek ve pelet L1-L2 evre nematodlarına yardımcı olmaktır. Tween 20 yerine %0,1 Triton-X kullanılabilir.
    3. Bir cam Pasteur pipet ve ampul kullanarak plakalardaki nematodları pipetleyin ve işaretli 1,5 mL mikrofüj tüplerine aktarın.
      NOT: Cam pipetler tercih edilir, çünkü nematodlar plastik pipetlere yapışabilir, ancak deterjan ilavesi (Tween 20 veya Triton-X) bu sorunu en aza indirebilir.
    4. Bir mikrosantrifüj kullanarak, kolonize veya enfekte olmuş nematodları içeren numuneleri L1 hayvanları için 60 s için 2.000 x g'da veya L4 veya yetişkin hayvanlar için 60 s için 500 x g'da döndürün. Sonraki tüm santrifüjleme adımları seçilen hızda gerçekleştirilecektir.
    5. Süpernatantı bir pipet kullanarak mikrofüj tüplerinden çıkarın. Süpernatantı peletin 100 μL yukarısına kadar dikkatlice çıkararak nematod peletini rahatsız etmekten kaçının. Bu, işaretli 1,5 mL mikrofüj tüpleri kullanılarak tahmin edilebilir.
  2. Dış kontaminasyonu ortadan kaldırmak için nematodları yıkayın
    1. Mikrofüj tüplerine 1 mL 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH2PO4) + %0,1Ara 20 (PBS-T) ekleyin.
    2. Numuneleri uygun hızda bir mikrosantrifüjde döndürün (bkz. adım 1.1.4). Bir pipet kullanarak, süpernatanın 100 μL hariç tamamını çıkarın. Bu, işaretli 1,5 mL mikrofüj tüpleri kullanılarak tahmin edilebilir.
    3. Yukarıdaki iki adımı 2-3 kat tekrarlayın.
      NOT: Toplam üç yıkama tipik olarak yeterlidir; Bununla birlikte, aşırı dış kontaminasyonu gidermek için ek yıkamalar yapılabilir.
  3. PFA ile nematodları düzeltin
    1. Duman davlumbazında,% 4'lük bir PFA'lık nihai konsantrasyon için, adım 1.2.3'ten elde edilen nematod peletinin üzerinde 100 μL süpernatant içeren mikrofüj tüpüne% 16 PFA'nın 33 μL'sini ekleyin.
      DİKKAT: PFA kanserojendir. PFA ile temas, cilt hassaslaşmasına, tahrişe ve göz hasarına neden olabilir. PFA, solunum tahrişine veya hassaslaşmaya yol açabilecek toksik dumanları serbest bırakır. PFA kullanırken, uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla bir duman davlumbazında çalışın ve kullanmadan önce uygun güvenlik bilgi formlarına bakın.
    2. Kolonize edilen veya ilgili mikropla enfekte olan nematodları içeren numuneleri oda sıcaklığında 30-45 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkayı takiben, protokol devam etmeye hazır olana kadar numuneleri% 70 etanol içinde 4 ° C'de saklayın.
      NOT: GFP'nin zaman içinde PFA tarafından bozulması nedeniyle transgenik suşlarda GFP sinyalini korumak için daha kısa bir inkübasyon süresi daha iyidir. Daha uzun inkübasyon süreleri, fiksatifin numunelere daha iyi geçirgenleşmesini sağlar. Numuneye bağlı olarak inkübasyon süresini ampirik olarak belirlemek en iyisidir.
  4. PFA çözümünü kaldırma
    1. Numuneleri uygun hızda bir mikrosantrifüjde döndürün (bkz. adım 1.1.4). Bir pipetle, peleti rahatsız etmeden süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.
      DİKKAT: Süpernatant toksik olan PFA içerir. Süpernatantı atın ve en azından ilk ikisi bir duman davlumbazında toksik atık olarak yıkanır.
    2. Mikrofüj tüplerindeki numunelere 0,5 mL PBS-T ekleyin.
    3. PBS-T ile 1.4.1 ve 1.4.2 2-3x arasındaki adımları izleyin ve yineleyin.
      NOT: Daha fazla yıkama yapmak, arka plan sinyalini azaltmaya yardımcı olacaktır. Toplamda en az dört yıkama önerilir.
    4. Son yıkamayı takiben, numuneleri aşağı doğru döndürün ve pelet bozulmadan bırakarak süpernatanı çıkarın.
  5. Hibridizasyon tamponunu (HB) hazırlayın ve nematodları yıkayın
    1. Numune başına 1 mL HB (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, %0,01 SDS) hazırlayın.
      NOT: Yağışı önlemek için HB her kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır. Bununla birlikte, genel bir tampon (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5) önceden yapılabilir ve HB'ye ihtiyaç duyulana kadar oda sıcaklığında saklanabilir. Kullanmadan önce, genel tamponun numunesi başına 1 mL hazırlayın ve% 0.01'lik bir nihai konsantrasyona SDS ekleyin.
    2. Nematod peletini içeren mikrofüj tüplerine 800 μL HB ekleyin. Mikrosantrifüjdeki numuneleri toplayın (bkz. adım 1.1.4). Pelet'i rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın.
  6. FISH probunu istenen hedef sıraya hibridize edin
    1. Hazırlanan HB numunesi başına 100 μL'yi, istenen FISH probu ile 5-10 ng / μL probun son konsantrasyonuna karıştırın.
      NOT: FISH probları 15-23 -mer oligolardır, ilgilenilen mikrobun SSU'suna karşı antisensittir ve 5' veya 3' ucuna tutturulmuş renkli bir florofor ile etiketlenmiştir (burada kullanılan problar için Tablo 1'e bakınız). Genel olarak, stok FISH probları 1 mg / mL'de depolanır.
    2. Her numuneye 100 μL HB içeren FISH probu ekleyin. Tüpleri hafifçe hafifçe hafifçe hareket ettirerek veya ters çevirerek karıştırın.
      NOT: Aynı numunedeki birden fazla floresan sinyalini görselleştirmek için farklı renkli FISH probları aynı anda eklenebilir (bkz. Şekil 1B).
    3. Numuneleri 46-54 °C'de kuru bir banyoda veya 1.200 rpm'de 46-54 °C'de termal karıştırıcıda gece boyunca (6-24 saat) inkübe edin.
      NOT: 46-48 °C'de inkübasyon tipik olarak hibridizasyon için kullanılır. Bununla birlikte, bu sıcaklığın FISH probunun erime sıcaklığına bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Genel olarak, hibridizasyon sıcaklığı erime sıcaklığının 4 ° C altındadır.
  7. FISH probunu çıkarın ve nematodları yıkayın
    1. Numune başına 3 mL yıkama tamponu (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, %0,01 SDS) hazırlayın.
      NOT: Dünya Bankası, yağışı önlemek için her kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır. Bununla birlikte, genel bir tampon (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5) önceden yapılabilir ve yıkama tamponuna ihtiyaç duyulana kadar oda sıcaklığında saklanabilir. Kullanmadan önce, genel tamponun numunesi başına 3 mL hazırlayın ve EDTA'yı 5 mM'lik bir son konsantrasyona ve SDS'yi% 0.01'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
    2. Numuneleri uygun hızda santrifüj yapın (bkz. adım 1.1.4). HB'yi bir pipet kullanarak çıkarın, nematod peletini rahatsız edilmeden bırakmaya dikkat edin.
    3. Her numuneye 1 mL hazırlanmış WB ekleyin.
    4. Numuneleri uygun hızda santrifüj yapın (bkz. adım 1.1.4). Dünya Bankası'nı bir pipet kullanarak çıkarın ve pelet bozulmadan bırakmaya dikkat edin.
    5. Her numuneye 1 mL hazırlanmış WB ekleyin.
    6. Numuneleri kuru bir banyoda 48-56 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin (veya 1200 rpm'de 48-56 ° C'de termal karıştırıcı). Kuru bir banyoda inkübe ediliyorsa, tüpleri her 15-20 dakikada bir yavaşça ters çevirin.
      NOT: Genel olarak, standart yıkama sıcaklığı olarak 48 °C kullanılır; ancak, yüksek arka plan sinyali varsa bu sıcaklığın ayarlanması gerekebilir. Yıkama sıcaklığı genellikle hibridizasyon sıcaklığından 2 ° C daha yüksektir. Dünya Bankası'nda kuluçka süresi, arka planı daha da azaltmak için 30 dakikaya kısaltılabilir, bundan sonra 1.7.4 ve 1.7.5 adımları tekrarlanmalıdır. Bunu 48 ° C'de bir (bakteriler için) veya iki (mikrosporidia sporoplazmalar için) 30 dakikalık kuluçka süreleri izlemelidir.
    7. Numuneleri uygun hızda santrifüj yapın (bkz. adım 1.1.4). Bir pipet kullanarak, peleti rahatsız edilmeden bırakmaya dikkat ederken yıkama tamponunu çıkarın.
    8. Örneklerin her birine 100-500 μL PBS-T ekleyin. Bu noktada, numuneler protokol devam etmeye hazır olana kadar PBS-T'de 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
  8. Nematodları monte edin
    1. Numuneleri uygun hızda santrifüj yapın (bkz. adım 1.1.4). Nematod peletini rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok PBS-T çıkarın.
    2. (İsteğe bağlı) Numunelere DAPI (Malzeme Tablosu) ile 20 μL antifade montaj ortamı ekleyin.
    3. 200 μL'lik bir pipetleyiciyi 200 μL'lik bir pipet ucuyla takın ve daha büyük nematodların pipetlenmesine izin vermek üzere pipetin ucunu kesmek için makas kullanın.
    4. Kesilmiş pipet ucu ile peletin 5-10 μL'sini mikroskop sürgüsüne aktarın. 22 x 22 kapak kapağı ile örtün. Slaytları saklamak için, kapak kapağının kenarlarını oje ile kapatın ve daha fazla kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de karanlık bir kutuda saklayın.

2. Aseton fiksasyonu ile FISH boyama

  1. Nematodları adım 1.1'de açıklandığı gibi ilişkili mikroplarla hazırlayın.
  2. Adım 1.2'de açıklandığı gibi dış kontaminasyonu ortadan kaldırmak için nematodları yıkayın.
  3. Nematodları asetonla sabitleyin
    1. Pelet rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve numuneye 1 mL laboratuvar sınıfı aseton ekleyin.
      DİKKAT: Aseton oldukça yanıcı bir sıvı ve buhardır. Tezgahtan oje sökücü olarak satın alınabilmesine rağmen, asetonun ciddi göz tahrişine neden olduğunu ve uyuşukluğa veya baş dönmesine neden olabileceğini hatırlamak önemlidir.
    2. Kolonize edilmiş veya ilgili mikropla enfekte olmuş nematodları içeren numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkayı takiben, numuneler protokol devam etmeye hazır olana kadar 2 haftaya kadar -20 ° C'de asetonda saklanabilir.
      NOT: Bu protokolü, floresanı korumak isteniyorsa, GFP'yi (veya allelik mutasyona uğramış formlarını) eksprese eden transgenik C. elegans suşlarıyla kullanmayın, çünkü aseton bu sinyali yok eder.
  4. Asetonu çıkarın
    1. Numuneleri uygun hızda bir mikrosantrifüjde döndürün (bkz. adım 1.1.4). Bir pipetle, peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın.
      DİKKAT: Süpernatant aseton içerir. Süpernatantı atın ve en azından ilk ikisi bir duman davlumbazında toksik atık olarak yıkanır.
    2. Mikrofüj tüplerindeki numunelere 0,5 mL PBS-T ekleyin.
    3. PBS-T ile 2.4.1 ve 2.4.2 2-4x arasındaki adımları izleyin ve yineleyin.
      NOT: Daha fazla yıkama yapmak, arka plan sinyalini azaltmaya yardımcı olacaktır. Toplamda dört yıkama yapılması önerilir.
    4. Son yıkamadan sonra, numuneleri aşağı doğru döndürün ve peletin bozulmadığından emin olmak için süpernatanı çıkarın.
  5. Hibridizasyon tamponunu (HB) hazırlayın ve nematodları adım 1.5'te açıklandığı gibi yıkayın.
  6. FISH probunu adım 1.6'da açıklandığı gibi istenen hedef sıraya hibridize edin.
  7. FISH probunu çıkarın ve nematodları yıkayın
    1. Numune başına 1,1 mL yıkama tamponu (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, %0,01 SDS) hazırlayın.
      NOT: Dünya Bankası, yağışı önlemek için her kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır. Bununla birlikte, genel bir tampon (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5) önceden yapılabilir ve bir yıkama tamponuna ihtiyaç duyulana kadar oda sıcaklığında saklanabilir. Kullanmadan önce, genel tamponun numunesi başına 1.1 mL hazırlayın ve EDTA'yı 5 mM'lik bir nihai konsantrasyona ve SDS'yi% 0.01'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
    2. Numuneleri uygun hızda santrifüj edin (bkz. 1.1.4). HB'yi bir pipet kullanarak çıkarın, nematod peletini rahatsız edilmeden bırakmaya dikkat edin.
    3. Her numuneye 100 μL hazırlanmış WB ekleyin.
    4. Numuneleri uygun hızda santrifüj edin (bkz. 1.1.4). Dünya Bankası'nı bir pipet kullanarak çıkarın ve pelet bozulmadan bırakmaya dikkat edin.
    5. Her numuneye 1 mL hazırlanmış WB ekleyin.
    6. Numuneleri kuru bir banyoda 48-56 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin (veya 1.200 rpm'de 48-56 ° C'de termal karıştırıcı). Kuru bir banyoda inkübe ediliyorsa, tüpleri her 15-20 dakikada bir yavaşça ters çevirin.
      NOT: Genel olarak, standart yıkama sıcaklığı olarak 48 °C kullanılır; ancak, yüksek arka plan sinyali varsa bu sıcaklığın ayarlanması gerekebilir. Yıkama sıcaklığı genellikle hibridizasyon sıcaklığından 2 ° C daha yüksektir.
    7. Numuneleri uygun hızda santrifüj yapın (bkz. adım 1.1.4). Bir pipet kullanarak, peleti rahatsız edilmeden bırakmaya dikkat ederken yıkama tamponunu çıkarın.
    8. Örneklerin her birine 100-500 μL PBS-T ekleyin. Bu noktada, numuneler protokol devam etmeye hazır olana kadar PBS-T'de 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
  8. Nematodları adım 1.8'de açıklandığı gibi monte edin.

Sonuçlar

Mikrobiyom bakterilerini analiz etmek için, vahşi izole hayvanlarda bakteriyel 16S'ye spesifik ve evrensel FISH probları kullanılmıştır. Yabani Caenorhabditis tropicalis suşu (JU1848), Fransız Guyanası'ndaki küçük bir nehrin yakınındaki Nouragues ormanından, çürüyen palmiye ağacı meyvelerinden örneklendi22. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu altında, bu nematod suşunun bağırsak epiteline yönlü olarak yapıştığı görülen bir bakteri ile kolonize edildiği bulunmuştur (Şekil 2A). JU1848 daha sonra diğer mikrobiyal kirleticileri ortadan kaldırmak ve istenen yapışkan bakteri23 için zenginleştirmek için seçici olarak temizlendi. Evrensel PCR yöntemi kullanılarak, bakteri Alfaproteobakteri sınıfında yeni bir tür olarak tanımlandı. Cal Fluor Red 610 ile etiketlenmiş bir FISH probu daha sonra C. tropicalis içindeki kolonizasyonun floresan görselleştirmesine izin vermek için bu bakterinin 16S rRNA dizisine özel olarak tasarlanmıştır (Şekil 2B). Birçok bakteri türünü (EUB338) bağlayabilen evrensel bir 16S rRNA FISH probu, 6-karboksifloresin (FAM) ile etiketlendi ve bu örneğe de eklendi. Yeşil ve kırmızı floresan sinyalleri tamamen örtüşür, bu da bağırsakları kolonize eden bakterilerin çoğunun yapışan Alfaproteobakteri bakterisi olduğunu düşündürür. Bu hayvanlar lekelenmeden önce PFA'da sabitlendi.

Laboratuvarda bilinen kimliğin hücre içi patojenleri ile deneysel enfeksiyonu analiz etmek için, vahşi tip bir arka plana sahip C. elegans üzerinde Orsay virüsü ve mikrosporidian spesifik FISH probları kullanılmıştır. Orsay virüsü, Nodaviridae ailesinden pozitif iplikçikli bir RNA virüsüdür ve C. elegans'ta bulunan tek doğal viral patojendir. Orsay virüsünün iki parçalı RNA genomu RNA1 ve RNA2 segmentlerinden oluşur ve bu segmentlerin her ikisini de hedefleyen FISH probları geliştirilmiştir (Şekil 3A,B)9,18. Bağırsakta, viral RNA, Hücre İçi Patojen Yanıtı (IPR) 25,26,27 adlı transkripsiyonel savunma programının aktivasyonu için gerekli olan RIG-I homolog DRH-1 24 tarafından algılanır. Antiviral IPR genlerinin transkripsiyonu en azından kısmen ZIP-1 transkripsiyon faktörü21 tarafından kontrol edilir. Burada, ZIP-1::GFP ekspresyonu, sitoplazmada pozitif Orsay virüsü FISH boyaması gösteren hücrelerin bağırsak çekirdeklerinde lokalize olarak görülmektedir (Şekil 3A)21. Orsay'a özgü FISH ile boyanmış çoklu hayvanların, kolay niceleme için bu sinyalin gücünü gösterdiği gösterilmiştir (Şekil 3B). Şekil 3A,B'de gösterilen hayvanlar PFA'da sabitlenmiştir.

Paris'ten gelen nematod katili anlamına gelen Nematocida parisii adlı mikrosporidian parazit, bağırsağın zorunlu bir hücre içi patojenidir. N. parisii'nin 18S rRNA'sını etiketleyen birkaç FISH probu, floresan olarak etiketlenmiş MicroA ve MicroB probları da dahil olmak üzere kullanılmıştır. MicroB FISH ile boyanmış çoklu hayvanların, kolay niceleme için bu sinyalin gücünü gösterdiği gösterilmiştir (Şekil 3C). Ek olarak, C. elegans yakından ilişkili diğer mikrosporidia tarafından enfekte edilir. N2'nin N. parisii ve ilgili N. ausubeli ile birlikte enfeksiyonu, 18S rRNA üzerindeki farklı bir bölgeye bağlanmak için birbirleriyle rekabet eden türe özgü FISH probları tasarlayarak bu FISH protokolü kullanılarak ayırt edilebilir (Şekil 3D)28. Bu örnekte, N. parisii FISH probu, N. parisii 18S rRNA ile mükemmel baz eşleşmesine sahiptir, ancak N. ausubeli 18S rRNA ile 7 bp uyumsuzluğa sahiptir. Tersi N. ausubeli sondası için geçerlidir. Bu nedenle, her türe özgü FISH probu, konyak olmayan türler üzerinde 18S konyak türüne bağlanma konusunda rekabet edecektir. Ek olarak, DAPI'nin çekirdekleri boyamak için kullanılması, enfeksiyonun tüm hayvan bağlamında, özellikle de büyük, kolayca tanımlanabilir çekirdeklere sahip bağırsak için daha iyi lokalizasyonuna izin verir. Şekil 3C, D, PFA'da sabitlenmiş hayvanları içerir. N. parisii ile daha sonraki enfeksiyonlar, merontların sporlara dönüşmesine neden olur. N. parisii sporlarını görselleştirmek için, hayvanlar spor duvarına PFA'dan daha iyi nüfuz ettiği için asetonla sabitlenmelidir (Şekil 3E, F)8. Ortaya çıkan FISH boyaması, muhtemelen kırmızı renkte N. parisii'ye özgü problarla boyanmış N. parisii sporlarına karşılık gelen küçük ve büyük çubuk şeklindeki yapıları göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: FISH protokolünün görsel gösterimi. Biorender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Bağırsaklarda yapışan bakterilerle kolonize edilmiş vahşi C. tropicalis JU1848 suşunun FISH boyaması. (A) JU1848'in bağırsağına (içinde) yönlü olarak bağlanan binlerce ince basil bakterisini (bac) tasvir eden Nomarski görüntüsü, lümen (lu) içinde saç benzeri bir fenotip oluşturur. Bu şekil paneli Morgan, E. et al. (2021)23'ten uyarlanmıştır. (B) PFA'da sabitlenmiş JU1848'in FISH boyaması, yapışan bakterinin 16S rRNA dizisini (üstte) hedeflemek için tasarlanmış kırmızı etiketli bir prob (b002_16S_A-CF610) ve 16S bakteri (altta) hedeflemek üzere tasarlanmış yeşil etiketli evrensel bir FISH probu (EUB338-FAM) kullanılarak. Konakçı çekirdeklerinin DAPI boyaması mavi renkle gösterilmiştir. Prob dizileri için Tablo 1'e bakın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Hücre içi patojenlerle enfekte olmuş C. elegans'ın FISH boyaması. (A,B) ZIP-1::GFP eksprese eden ve GFP sinyalini korumak için boyanmadan önce PFA ile sabitlenen Orsay virüsü ile enfekte olan C. elegans'ın FISH boyaması. Patojen boyama için Orsay 1 Kırmızı ve Orsay 2 Kırmızı problar kullanıldı. (A) Bileşik görüntü, birleştirilmiş kırmızı ve yeşil floresan kanallardan oluşur. Nükleer ZIP-1::GFP ekspresyonu Orsay virüsü enfeksiyonu üzerine indüklenir ve yeşil renkle gösterilir. Bağırsak granüllerinden otofloresan sarı renkte gösterilir ve sarı oklarla gösterilir. Noktalı çizgiler nematod gövdesini özetler. Ölçek çubuğu = 25 μm. (B) Bileşik görüntü, birleştirilmiş kırmızı floresan ve DIC kanallarından oluşur. Ölçek çubuğu = 200 μm. (C,D) PFA'da sabitlenmiş mikrosporidia ile enfekte olmuş vahşi tip C. eleganların FISH boyanması. (C) N. parisii ile enfekte olmuş ve PFA'da sabitlenmiş vahşi tip C. elegans'ın FISH boyaması. Patojen boyama için MicroB-CF610 probu kullanıldı. Kompozit görüntü, birleştirilmiş kırmızı floresan ve DIC kanallarından oluşur. Ölçek çubuğu = 100 μm. (D) Bağırsakta N. parisii ve N. ausubeli ile birlikte enfekte olan vahşi tip C. elegans'ın FISH boyaması. İki patojen, 18S rRNA'nın aynı bölgesine bağlanmak için rekabet eden bir çift spesifik FISH probu kullanılarak birlikte boyandı. N. parisii MicroF-CF610 (kırmızı) kullanılarak boyandı ve N. ausubeli MicroSp1A-FAM (yeşil) kullanılarak boyandı. Konakçı çekirdeklerinin DAPI boyaması mavi renkte görülür. Ölçek çubuğu = 25 μm. (E) N. parisii sporları ile enfekte olmuş aseton sabit vahşi tip C. elegans ile FISH boyaması. Boyama (kırmızı) için MicroA-CF610 (kırmızı) kullanıldı. Ölçek çubuğu = 15 μm. (F) (E)'de görülen N. parisii sporlarını gösteren Nomarski görüntüsü. Ölçek çubuğu = 15 μm. (E) ve (F)'de, küçük ve büyük çubuk şeklindeki yapılar, sırasıyla N. parisii sporlarına karşılık gelen küçük ve büyük oklarla etiketlenir. Prob dizileri için Tablo 1'e bakın. (A)'da gösterilen görüntü Lažetić, V. et al. (2022)21'den uyarlanmıştır. (B) ve (C)'de gösterilen görüntüler Reddy, K. C. et al. (2019)26'dan uyarlanmıştır. (E) ve (F)'de gösterilen görüntüler Troemel, E. R. et al. (2008)8'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Prob adıProb özgüllüğüProb floroforProb sırası
EUB338-FAMBakteriyel 16S (evrensel)5' 6-floresein (FAM)GCTGCCTCCCGTAGGAGT
b002_16S_A-CF610 SerisiAlfaproteobakteri 16SCal Flor Kırmızısı 610 (CF610)TGTACCGACCCTTAACGTTC
Orsay1 KırmızıOrsay virüsü RNA1Cal Flor Kırmızısı 610 (CF610)GACATATGTGATGCCGAGAC
Orsay2 KırmızıOrsay virüsü RNA2Cal Flor Kırmızısı 610 (CF610)GTAGTGTCATTGTAGGCAGC
MikroA-CF610 SerisiNematocida parisii 18SCal Flor Kırmızısı 610 (CF610)CTCTGTCCATCCTCGGCAA
MikroB-CF610Nematocida parisii 18SCal Flor Kırmızısı 610 (CF610)CTCTCGGCACTCCTTCCTG
MicroF-CF610 SerisiNematocida parisii 18SCal Flor Kırmızısı 610 (CF610)AGACAAATCAGTCCACGAATT
MicroSp1A-FAMNematocida ausubeli 18S5' 6-floresein (FAM)CAGGTCACCCCACGTGCT

Tablo 1: FISH prob dizilerinin listesi. Tüm FISH probları, 5' ucuna tutturulmuş florofor ile ticari olarak satın alındı (özel oligonükleotid sentezi yoluyla ; Malzeme Tablosuna bakınız) ve oligonükleotidler ters fazlı HPLC ile saflaştırıldı.

Tartışma

Vahşi C. elegans doğal olarak çeşitli mikroplarla ilişkilidir. Araştırmacılar, bu mikropları tespit etmek ve tanımlamak için RNA FISH'i kullanabilir ve bütün bir hayvan bağlamında lokalizasyonları hakkında fikir edinebilirler. İstenilen veya ilginç fenotiplere sahip mikroplar bu yöntemle tanımlanabilir ve daha sonra karakterizasyon ve dizileme için izole edilebilir. Yabani C. elegans'tan çok sayıda bakteri izolatının bolluğu da RNA FISH29 ile ölçülebilir. Burada açıklanan protokolü kullanarak, konakçılarının içindeki bilinen mikroorganizmaları gözlemlemek ve etkileşimleri hakkında daha fazla bilgi edinmek de mümkündür. Daha da önemlisi, Orsay virüsü ve mikrosporidia zorunlu parazitlerdir ve konakçıdan bağımsız olarak kültürlenemez, bu nedenle FISH standart görselleştirme aracıdır. Kolonizasyon veya enfeksiyon, istenen kültürlenebilir bakterilerle tohumlanmış plakalarda yetiştirilen nematodlar kullanılarak RNA FISH aracılığıyla da ölçülebilir. C. elegans bağırsağındaki mikroorganizmaları boyamaya ek olarak, bu protokol C. tropicalis veya Oscheius tipulae 19,23 gibi diğer nematod suşları için de kullanılabilir.

FISH protokolünün temel avantajı, C. elegans ile ilişkili mikropları boyamak için basit, hızlı ve sağlam bir yöntem sunmasıdır. FISH boyamasından üretilen görüntüler, numune içindeki SSU'nun bol RNA'sını hedef alan FISH probları kullanılarak elde edilen yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahiptir. Tipik olarak rDNA'dan 30x veya daha yüksek rRNA seviyeleri olduğu için, rRNA'yı hedef alan problarla boyanan FISH'ten gelen sinyalin çoğu, rDNA30 yerine rRNA'dan kaynaklanmaktadır. Ayrıca, RNA FISH, enfeksiyonu veya kolonizasyonu tüm hayvan bağlamında görmeyi mümkün kılar. Bu görselleştirme, konakçı çekirdeklerinin DAPI ile birlikte boyanması ve / veya numune içindeki enfeksiyon veya kolonizasyonun lokalizasyonunu daha iyi vurgulamak için floresan işaretli C. elegans suşları kullanılarak kolaylaştırılmıştır. Örneğin, farklı dokularda GFP ekspresyonu olan C. elegans suşlarının bir paneli kullanılarak Nematocida displodere'nin doku tropizmini belirlemek için mikrosporidian spesifik FISH kullanıldı20. Ek olarak, bu protokol, araştırmacıların özel ihtiyaçları için uygun ideal koşulları belirlemelerine izin veren değişikliklere uygundur (örneğin, fiksasyon süresini ayarlamak, hibridizasyon sıcaklığını arttırmak).

FISH protokolündeki kritik bir adım, numuneleri sabitlemektir. Fiksatif ilavesini takip eden kuluçka süresi, ajanın numuneyi geçirgenleştirmesi için zaman tanımak için gereklidir. Daha uzun inkübasyon süreleri, zaman içinde PFA tarafından protein bozulması nedeniyle transgenik floresan proteinleri içeren numuneler için ideal değildir. GFP içeren numuneler için, GFP sinyalini korurken, geçirgenliğe izin vermek için en uygun sabitleme süresini belirlemek zorunludur.

FISH, C. elegans'ta bakteri, virüs veya mikrosporidia için leke yapmak için kullanılabilir. Bununla birlikte, FISH için kullanılan en iyi fiksatif ajan türü, numuneye ve aşağı akış gereksinimlerine bağlıdır. Bu protokol, bakteri ve virüsleri boyamak için birincil fiksatif ajan olarak bir PFA çözeltisi sunar. Bununla birlikte, PFA, spor duvarına nüfuz edemediği için mikrosporidian sporların görselleştirilmesi için yeterli değildir. Sporların görselleştirilmesi için bunun yerine aseton kullanılmalıdır. Bununla birlikte, PFA fiksasyonu, sporoplazmalar, merontlar ve sporontlar dahil olmak üzere mikrosporidianın diğer yaşam aşamalarının FISH etiketlemesi için etkilidir. Aseton fiksasyonu ile PFA fiksasyonu arasında diğer önemli farklılıklar görülür; aseton daha uygundur, çünkü numuneler eklendikten sonra, yıkamaya gerek kalmadan dondurucuda hızlı bir şekilde saklanabilir. Bununla birlikte, aseton, transgenik bir konakçıdaki mevcut GFP'leri hızla öldürür. PFA, konakçıdaki bazı fizyolojik yapıların korunması önemliyse, tercih edilen fiksatiftir, çünkü aseton ile sabitlenmiş hayvanlar daha fazla bozulmuş gibi görünmektedir ve bu da bazı dokuların tanımlanmasını zorlaştırmaktadır. Örnekler sabit olduğundan, bu FISH protokolü konakçı-mikrop etkileşimlerinin in vivo canlı görüntülenmesine izin vermez. Bununla birlikte, çeşitli zaman noktalarında örneklerin FISH boyanması ile takip edilen bir nabız kovalama enfeksiyonu zaman seyri, mikrobiyal enfeksiyonun bazı dinamiklerini görmenizi sağlayabilir 19,20,31.

Protokol boyunca bir diğer kritik adım, hibridizasyondan önce ve sonra numunelerin tamamen yıkanmasıdır. Hibridizasyondan önce, solucanları mikrofüj tüplerine toplarken, NGM plakalarındaki fazla bakteri veya diğer mikroplar solucan örneği ile birlikte taşınabilir. PBS-T ile üç yıkama standarttır; Bununla birlikte, özellikle ağır kirlenmiş, vahşi izole C. elegans kullanıldığında, dış mikroorganizmaları yeterince ortadan kaldırmak için daha fazla yıkama gerekli olabilir. FISH'ten sonra monte edilen numuneleri görüntülerken, numunenin arka planında büyük miktarda sinyal üreten bazı artık FISH probu olabilir. Yıkama sıcaklığı ve yıkama sayısı, fazla ve spesifik olarak bağlanmamış probun giderilmesi için önemlidir. Arka plan floresansını azaltmak için, bir saat boyunca 1 mL WB ile bir yıkama yerine, her 30 dakikada bir 1 mL WB ile iki veya üç yıkama yapmak mümkündür. Farklı FISH probları farklı yıkama sıcaklıkları gerektirebilir. Tipik olarak, yıkama sıcaklığı hibridizasyon sıcaklığının 2 ° C üzerindedir, ancak çok fazla arka plan floresansı varsa (yüksek gürültü) bu arttırılabilir.

FISH protokolü, türe özgü mikrobiyal RNA'yı hedeflemek için tasarlanmış floresan probları kullanır, ancak FISH probları diğer yüksek kopyalı transkriptler için tasarlanabilir. Diğer FISH probları farklı erime sıcaklıklarına sahip olabilir, bu nedenle inkübasyon adımlarının tarif edilenden daha yüksek veya daha düşük bir sıcaklıkta yapılması gerekebilir. FISH boyama, konakçı içindeki mikrobiyal kolonizasyonun veya enfeksiyonun mekansal dağılımını tanımlayabilir ve konakçı-mikrop ve mikrop-mikrop etkileşimlerinin karakterizasyonuna izin verebilir. Bir sınırlama, aynı anda sadece birkaç geleneksel floroforun kullanılabilmesidir, bu da aynı anda FISH yoluyla tespit edilebilecek farklı mikroorganizmaların sayısını azaltır. Bu, C. elegans'taki karmaşık mikrobiyom çalışmaları için kullanımını sınırlar. Bununla birlikte, çok renkli rRNA hedefli FISH, farklı mikrobiyal grup etiketlerinin sayısını artırabilen kanonik olmayan floroforlarla etiketlenmiş probları kullanır15. Diğer bir sınırlama, yakından ilişkili türler, özellikle de bakteriler arasında, oldukça benzer SSU dizilerine sahip olanları ayırt etmenin zor olmasıdır. Bununla birlikte, mikrosporidia türleri arasındaki aşırı dizi farklılaşması, bu protokolle farklılaşmalarını kolaylaştırmaya yardımcı olur (Şekil 3)32,33.

Genel olarak, bu FISH protokolü C. elegans içindeki mikroorganizmaları tespit etmek için bir teknik tanımlamaktadır. Araştırmacıların, bozulmamış bir hayvan bağlamında kolonizasyon ve enfeksiyonu tespit etmek ve ölçmek ve ayrıca konakçı içindeki benzersiz mikrobiyal davranışı veya morfolojiyi tanımlamak için şeffaf ve genetik olarak izlenebilir bir model sistemi kullanmalarını sağlar. Bu makalenin ön baskı versiyonu inceleme34 sırasında yayınlanmıştır.

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Dr. Marie-Anne Félix'e bize vahşi nematod suşları sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NSF tarafından KARİYER Hibe 2143718 ve California State Üniversitesi tarafından RJL'ye CSUPERB Yeni Araştırmacı Ödülü altında, ERT'ye R01 AG052622 ve R01 GM114139 altında NIH ve VL'ye Amerikan Kalp Derneği Bursu ile desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 SDSInvitrogenAM9822
AsetonFisher ScientificA-11-1
DAPI (Vectashield) ile Antifade montaj serumuVectalabNC9524612
EDTAFisher ScientificS311-500
FISH probları (bakınız Tablo 1)LGC Biyoarama TeknolojileriFISH probları ticari olarak özel oligonükleotid sentezi yoluyla satın alındı
KClFisher ScientificP217
KH2< / sub>PO4< / sub>Fisher ScientificP-286
Na2< / sub>HPO4< / sub>Fisher ScientificS375-500
NaClFisher ScientificS-671
NH4ClFisher ScientificA-661
ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimi50-980-487DİKKAT: PFA kanserojendir. Uygun şekilde kullanın
Termal karıştırıcıEppendorf5384000020
Tris tabanıFisher ScientificBP152
Triton X-100Fisher ScientificBP-151
Tween-20Fisher ScientificBP337-500

Kaynaklar

  1. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  2. Balla, K. M., Troemel, E. R. Caenorhabditis elegans as a model for intracellular pathogen infection. Cellular Microbiology. 15 (8), 1313-1322 (2013).
  3. Dimov, I., Maduro, M. F. The C. elegans intestine: organogenesis, digestion, and physiology. Cell and Tissue Research. 377 (3), 383-396 (2019).
  4. Bossinger, O., Fukushige, T., Claeys, M., Borgonie, G., McGhee, J. D. The apical disposition of the Caenorhabditis elegans intestinal terminal web is maintained by LET-413. Developmental Biology. 268 (2), 448-456 (2004).
  5. Szumowski, S. C., Botts, M. R., Popovich, J. J., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. The small GTPase RAB-11 directs polarized exocytosis of the intracellular pathogen N. parisii for fecal-oral transmission from C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 8215-8220 (2014).
  6. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  7. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).
  8. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6 (12), 2736-2752 (2008).
  9. Felix, M. A., et al. Natural and experimental infection of Caenorhabditis nematodes by novel viruses related to nodaviruses. PLoS Biology. 9 (1), 1000586(2011).
  10. Osman, G. A., et al. Natural infection of C. elegans by an oomycete reveals a new pathogen-specific immune response. Current Biology. 28 (4), 640-648 (2018).
  11. Zhang, G. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLOS Pathogens. 12 (12), 1006093(2016).
  12. Clark, L. C., Hodgkin, J. Commensals, probiotics and pathogens in the Caenorhabditis elegans model. Cell Microbiology. 16 (1), 27-38 (2014).
  13. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  14. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  15. Michael, L., Markus, S., Petra, P., Holger, D. A multicolor fluorescence in situ hybridization approach using an extended set of fluorophores to visualize microorganisms. Frontiers in Microbiology. 10, 1383(2019).
  16. Fuchs, B. M., et al. Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes. Applied and Environmental Microbiology. 64 (12), 4973-4982 (1998).
  17. O'Neil, D., Glowatz, H., Schlumpberger, M. Ribosomal RNA depletion for efficient use of RNA-seq capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 4-19 (2013).
  18. Franz, C. J., et al. Santeuil and Le Blanc viruses primarily infect intestinal cells in Caenorhabditis nematodes. Virology. 448, 255-264 (2014).
  19. Tran, T. D., Ali, M. A., Lee, D., Luallen, R. J. Bacterial filamentation as a mechanism for cell-to-cell spread within an animal host. Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).
  20. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLOS Pathogens. 12 (6), 1005724(2016).
  21. Lažetić, V., et al. et al The transcription factor ZIP-1 promotes resistance to intracellular infection in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 13 (1), 1-16 (2022).
  22. Félix, M. -A., et al. Species richness, distribution and genetic diversity of Caenorhabditis nematodes in a remote tropical rainforest. BMC Evolutionary Biology. 13 (1), 10(2013).
  23. Morgan, E., Longares, J. F., Félix, M. A., Luallen, R. J. Selective cleaning of wild Caenorhabditis nematodes to enrich for intestinal microbiome bacteria. Journal of Visualized Experiments. (174), e62937(2021).
  24. Sowa, J. N., et al. The Caenorhabditis elegans RIGI homolog DRH-1 mediates the intracellular pathogen response upon viral infection. Journal of Virology. 94 (2), 01173(2020).
  25. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLOS Pathogens. 10 (6), 1004200(2014).
  26. Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLoS Pathogens. 15 (1), 1007528(2019).
  27. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  28. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PloS One. 14 (4), 0216011(2019).
  29. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38(2016).
  30. Fu, R., Gong, J. Single cell analysis linking ribosomal (r)DNA and rRNA copy numbers to cell size and growth rate provides insights into molecular protistan ecology. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 64 (6), 885-896 (2017).
  31. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  32. Cuomo, C. A., et al. Microsporidian genome analysis reveals evolutionary strategies for obligate intracellular growth. Genome Research. 22 (12), 2478-2488 (2012).
  33. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8 (1), 14023(2017).
  34. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RNA FISHBa rsak MikrobiyomuBa rsak EnfeksiyonuParaformaldehit FiksasyonuAseton FiksasyonuFISH ProblarKonak Mikrop Etkile imleri

İlgili makaleler