Kemoterapi ilaçlarının hücre kültüründe veya murin tümör modellerinde indüklediği yaşlanan kanser hücrelerinin floresan, akım sitometrik nicelleştirilmesi için bir protokol sunulmuştur. İsteğe bağlı prosedürler arasında ko-immün boyama, büyük parti veya zaman noktası analizini kolaylaştırmak için numune fiksasyonu ve akış sitometrik sıralama ile canlı yaşlanan hücrelerin zenginleştirilmesi yer almaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Akış Sitometrisi ile Yaşlanan Tümör Hücrelerinin Tanımlanması ve Zenginleştirilmesi için Uzak Kırmızı Floresan Yaşlanma İlişkili β-Galaktosidaz Probu
Bu makalede
Özet
Özet
Hücresel yaşlanma, normalde yaşlanan hücrelerde yıllar içinde tahakkuk eden, ancak çeşitli kanser tedavilerinin neden olduğu hasara yanıt olarak tümör hücrelerinde hızla ortaya çıkabilen biyolojik hasarın neden olduğu proliferatif bir arrest durumudur. Tümör hücresi yaşlanması genellikle istenmeyen olarak kabul edilir, çünkü yaşlanan hücreler ölüme dirençli hale gelir ve tümör malignitesini ve tedavi direncini şiddetlendirirken tümör remisyonunu bloke eder. Bu nedenle, yaşlanan tümör hücrelerinin tanımlanması, kanser araştırma topluluğuna sürekli ilgi duymaktadır. Birçoğu iyi bilinen yaşlanma belirteci olan yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz (SA-β-Gal) aktivitesine dayanan çeşitli yaşlanma testleri mevcuttur.
Tipik olarak, SA-β-Gal testi, sabit hücreler üzerinde kromojenik bir substrat (X-Gal) kullanılarak, "mavi" yaşlanan hücrelerin ışık mikroskobu ile yavaş ve öznel sayımı ile gerçekleştirilir. C12-FDG (yeşil) ve DDAO-Galaktosid (DDAOG; uzak kırmızı) dahil olmak üzere hücre geçirgen, floresan SA-β-Gal substratları kullanılarak geliştirilmiş analizler, canlı hücrelerin analizini mümkün kıldı ve akış sitometreleri de dahil olmak üzere yüksek verimli floresan analiz platformlarının kullanılmasına izin verdi. C12-FDG, SA-β-Gal için iyi belgelenmiş bir probdur, ancak yeşil floresan emisyonu, lipofussin agregalarının birikmesi nedeniyle yaşlanma sırasında ortaya çıkan içsel hücresel otofloresan (AF) ile örtüşür. Uzak kırmızı SA-β-Gal probu DDAOG kullanılarak, yeşil hücresel otofloresan, yaşlanmayı doğrulamak için ikincil bir parametre olarak kullanılabilir ve tahlil için güvenilirlik katar. Kalan floresan kanallar, hücre canlılığı boyama veya isteğe bağlı floresan immünoetiketleme için kullanılabilir.
Akış sitometrisini kullanarak, yaşlanan tümör hücrelerinin tanımlanması için çift parametreli bir test olarak DDAOG ve lipofussin otofloresansının kullanımını gösteriyoruz. Canlı yaşlanan hücrelerin yüzdesinin kantitasyonu gerçekleştirilir. İstenirse, ilgilenilen hücre yüzey antijenlerini değerlendirmek için isteğe bağlı bir immünoetiketleme adımı eklenebilir. Tanımlanan yaşlanan hücreler ayrıca akış sitometrik olarak sıralanabilir ve aşağı akış analizi için toplanabilir. Toplanan yaşlanan hücreler hemen lize edilebilir (örneğin, immünotahliller veya 'omik analizler için) veya daha fazla kültürlenebilir.
Giriş
Yaşlanan hücreler normalde normal biyolojik yaşlanma sırasında organizmalarda yıllar içinde birikir, ancak radyasyon ve kemoterapi de dahil olmak üzere çeşitli kanser tedavilerinin neden olduğu hasara yanıt olarak tümör hücrelerinde hızla gelişebilir. Artık çoğalmamasına rağmen, tedaviye bağlı yaşlanan (TIS) tümör hücreleri tedavi direncine katkıda bulunabilir ve nüksetmeyi tetikleyebilir 1,2,3. TIS hücreleri tarafından salgılanan faktörler, immün kaçamağı veya metastazı teşvik ederek tümör malignitesini şiddetlendirebilir 4,5
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Açıklanan tüm hayvan çalışmaları, Chicago Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Stok çözümlerinin hazırlanması ve depolanması
NOT: Hücreler akış halinde sıralanacaksa, tüm çözeltiler steril teknikler kullanılarak hazırlanmalı ve 0,22 μm'lik bir filtre cihazından filtrelenmelidir.
- DMSO'da 5 mg / mL'de bir DDAO-Galaktosid stok çözeltisi hazırlayın. Tüp başına 50 μL'de (veya istenen hacimde) Aliquot. Karanlıkta 1 yıla kadar −20 °C'de saklayın.
- DMSO'da 1 mM'de bir Bafilomisin A1 stok çözeltisi hazırlayın. Tüp başına 50 μL'de (....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
SA-β-Gal tarafından yaşlanmanın tespiti için DDAOG'un X-Gal ve C12-FDG ile karşılaştırılabilirliğini göstermek için çeşitli deneyler yapılmıştır. İlk olarak, X-Gal, ETO tarafından indüklenen yaşlanan B16-F10 melanom hücrelerini boyamak için kullanıldı (Şekil 2A). ETO-ile tedavi edilen hücrelerin bir alt kümesinde yoğun bir mavi renk gelişirken, diğer hücreler daha az yoğun mavi boyama sergiledi. Morfoloji, ETO-ile tedavi edilen hücrelerin çoğunda genişledi. ETO-ile muamele edilmiş.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Son on yılda, akış sitometrisi, tümör immünolojisinin ortaya çıkan popülaritesi, daha düşük maliyetli akış sitometrelerinin geliştirilmesi ve akademik kurumlarda paylaşılan enstrümantasyon tesislerinin iyileştirilmesi nedeniyle kanser araştırmalarında daha yaygın bir tahlil platformu haline gelmiştir. Çok renkli analizler artık standarttır, çünkü çoğu yeni enstrüman menekşe, mavi-yeşil ve kırmızıdan kırmızıya optik dizilerle donatılmıştır. Bu nedenle, bu DDAOG protokolünün çok çeşitli akış sitometreleri ile uyumlu olması.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların bu çalışma için beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Chicago Üniversitesi'ndeki Sitometri ve Antikor Çekirdek Tesisi'ne akış sitometrisi enstrümantasyonu konusundaki desteği için teşekkür ederiz. Chicago Üniversitesi'ndeki Hayvan Araştırma Merkezi, hayvan barınağı sağladı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Bafilomisin A1 | Araştırma Ürünleri Uluslararası | B40500 | |
| Bleomisin sülfat ve nbsp; | Cayman | 13877 | |
| Sığır serum albümini (BSA) | ABD Biyolojik | A1380 | |
| Calcein Menekşe 450 canlılık boyası | ThermoFisher Scientific | 65-0854-39 | eBioscience |
| DPP4 antikoru, PE konjugat | Biolegend | 137803 | Klonu H194-112 |
| Hücre hattı: A549 insan akciğer adenokarsinomu | Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu | CCL-185 | |
| Hücre hattı: B16-F10 fare melanomu | Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu | CRL-6475 | |
| Hücre kazıyıcı | Corning | 3008 | |
| Hücre süzgeçleri, 100 ve mikro; m | Falcon | 352360 | |
| DDAO-Galaktozit | Yaşam Teknolojileri | D6488 | |
| DMEM ortamı 1x | Yaşam Teknolojileri | 11960-069 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| DNAse I | Sigma | DN25 | |
| Doksorubisin, hidroklorür enjeksiyonu (USP) | Pfizer | NDC 0069-3032-20 | |
| Doksorubisin, PEGile lipozomal (USP) | Güneş İlaç | NDC 47335-049-40 | |
| EDTA 0.5 M | Yaşam Teknolojileri | 15575-038 | |
| Etoposit | Cayman | 12092 | |
| FBS | Omega | FB-11 | |
| Fc reseptör bloke edici reaktif | Biolegend | 101320 | Anti-fare CD16/32 |
| Akış sitometresi (hücre analizörü) | Becton Dickinson (BD) | Çeşitli | LSRFortessa |
| Akış sitometresi (hücre sıralayıcı) | Becton Dickinson (BD) | Çeşitli | FACSAria |
| GlutaMax 100x | HEPES | ||
| Teknolojileri | Lonza | BW17737 | |
| Liberaz TL | Sigma | 5401020001 | Roche |
| Paraformaldehit %16 | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15710 | |
| Penisilin / Streptomisin 100x | Yaşam Teknolojileri | 15140122 | |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) 1x | Corning | MT21031CV | Dulbecco'nun PBS'si (kalsiyum ve magnezyum olmadan) |
| Gökkuşağı kalibrasyon parçacıkları, ultra kit | SpheroTech | UCRP-38-2K | 3.5-3.9 & mikro; m, 2E6/mL |
| RPMI-1640 orta 1x | Yaşam Teknolojileri | 11875-119 | |
| Sodyum klorür %0,9 (USP) | Baxter Healthcare Corporation | 2B1324 | |
| Sitometre veri toplama yazılımı, "FACSDiva" | Becton Dickinson (BD) | n/a | Lisans için BD ile iletişime geçin |
| Sitometre veri analizi için yazılım, "FlowJo" | TreeStar | n/a | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-114 |
Kaynaklar
- Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
- Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: fri....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
