Yöntem makalesi

Apikal-Out Enteroid Modelde Lucifer Sarı Kullanarak Bağırsak Geçirgenliğinin Belirlenmesi

DOI:

10.3791/64215

⸱

27 Temmuz 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatric Surgery, Oklahoma Children's Hospital, 2Oklahoma University Health Sciences Center, 3Department of Surgery, University of Oklahoma Health Sciences Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, bağırsak geçirgenliğini belirlemek için apikal-dışarı enteroid modelinde lusifer sarısı kullanan bir yöntemi özetlemektedir. Bu yöntem, nekrotizan enterokolit gibi inflamatuar bağırsak hastalıklarını modelleyen enteroidlerde parasellüler geçirgenliği belirlemek için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enteroidler, nekrotizan enterokolit (NEC) gibi enflamatuar bağırsak hastalıklarının incelenmesinde ortaya çıkan bir araştırma aracıdır. Geleneksel olarak, epitel hücresinin apikal yüzeyinin iç lümene baktığı bazolateral çıkış (BO) konformasyonunda yetiştirilirler. Bu modelde, tedavi ve deney için enteroidlerin luminal yüzeyine erişim zordur, bu da konakçı-patojen etkileşimlerini inceleme yeteneğini sınırlar. Bunu atlatmak için, nekrotizan enterokolit için bir yenidoğan apikal-out (AO) modeli oluşturuldu. İntestinal epitel hücre geçirgenliği değişiklikleri NEC için patognomonik olduğundan, bu protokol parasellüler geçirgenliğin bir belirteci olarak lusifer sarısı (LY) kullanımını özetlemektedir. LY, bağırsak epitel bariyerini üç ana parasellüler yolun hepsinden geçirir : gözenek, sızıntı ve kısıtlamasız. Bir AO modelinde LY kullanmak, NEC'de geçirgenliğin daha geniş bir çalışmasına izin verir. IRB onayı ve ebeveyn onayını takiben, insan preterm yenidoğanlardan bağırsak dokusunun cerrahi örnekleri toplandı. Bağırsak kök hücreleri kript izolasyonu yoluyla toplandı ve enteroidleri büyütmek için kullanıldı. Enteroidler olgunluğa erişti ve daha sonra AO'yu dönüştürdü veya BO konformasyonunda bırakıldı. Bunlar ya tedavi edilmedi (kontrol) ya da lipopolisakkarit (LPS) ile tedavi edildi ve in vitro NEC'nin indüksiyonu için hipoksik koşullara maruz bırakıldı. Geçirgenliği değerlendirmek için LY kullanıldı. Apikal protein zonula oklüdens-1 ve bazolateral protein β-kateninin immünofloresan boyanması AO konformasyonunu doğruladı. LPS ve hipoksi ile tedavi edilen AO ve BO enteroidleri, kontrollere kıyasla önemli ölçüde artmış parasellüler geçirgenlik göstermiştir. Hem AO hem de BO enteroidleri, kontrollere kıyasla tedavi edilen enteroidlerin lümenine LY'nin alımının arttığını göstermiştir. Bir AO enteroid modelinde LY'nin kullanılması, parasellüler geçirgenliğin üç ana yolunun hepsinin araştırılmasına izin verir. Ek olarak, konakçı-patojen etkileşimlerinin araştırılmasına ve bunun BO enteroid modeline kıyasla geçirgenliği nasıl etkileyebileceğine izin verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enteroidler, organ kısıtlı insan bağırsak kök hücrelerinden türetilen üç boyutlu (3D) yapılardır 1,2. Tamamen epitel soyundan oluşurlar ve tüm farklılaşmış intestinal epitel hücre tipleriniiçerirler 2. Enteroidler ayrıca bir iç bölme oluşturan apikal bir luminal yüzeyden ve çevredeki ortama bakan bazolateral bir yüzeyden oluşan hücresel polariteyi korurlar. Enteroidler, üretildikleri konakçının özelliklerini korudukları için benzersiz bir modeldir3. Bu nedenle, prematüre insan bebeklerinden üretilen enteroidler, nekrotizan enterokolit (NEC) gibi öncelikle bu popülasyonu etkileyen hastalıkları araştırmak için yararlı olan bir modeli temsil eder.

Geleneksel enteroid model, enteroidin bir bazal membran matrisi (BMM) kubbesi içine alındığı bir bazolateral çıkış (BO) konformasyonunda yetiştirilir. BMM, enteroidin dışarıdaki bazolateral yüzey ile 3D bir yapıyı korumasını sağlar. BO enteroidleri, iki boyutlu (2D) birincil insan hücre hatları ile in vivo hayvan modelleri 2,4 arasındaki boşluğu dolduran NEC için uygun bir modeldir. NEC, enteroidleri çevreleyen ortama LPS veya bakteri gibi patojenlerin yerleştirilmesiyle enteroidlerde indüklenir, ardından hipoksik koşullara maruz kalır 2,3. BO enteroid NEC modeli ile ilgili zorluk, apikal yüzeyde in vivo olarak meydana gelen konakçı-patojen etkileşimlerinin etkili bir şekilde çalışılmasına izin vermemesidir. Bağırsak geçirgenliğindeki değişiklikler bu konakçı-patojen etkileşimlerinden kaynaklanmaktadır. Geçirgenliğin hastalığın patofizyolojik temelini nasıl etkilediğini daha iyi anlamak için, apikal yüzeyin tedavisini içeren bir model oluşturulmalıdır.

Co ve ark., olgun BO enteroidlerinin, BMM kubbelerini çıkararak ve bunları medya5'te yeniden askıya alarak apikal-out (AO) konformasyonu oluşturmaya indüklenebileceğini gösteren ilk kişilerdir. Bu makalede, AO enteroidlerinin doğru epitel polaritesini koruduğu, tüm intestinal hücre tiplerini içerdiği, intestinal epitel bariyerini desteklediği ve apikal yüzeye erişime izin verdiğigösterilmiştir 5. AO enteroidlerinin bir NEC modeli olarak kullanılması, hastalık sürecinin fizyolojik bir üremesini ve konakçı-patojen etkileşimlerinin incelenmesini sağlar.

NEC'nin patofizyolojisine önemli bir katkıda bulunanlardan biri artmış bağırsak geçirgenliğidir6. İn vitro7 bağırsak geçirgenliğini test etmenin bir yolu olarak birkaç molekül önerilmiştir. Bunlar arasında, lusifer sarısı (LY), sırasıyla 428 nm ve 540 nm'de uyarma ve emisyon zirvelerine sahip hidrofilik bir boyadır. Tüm ana parasellüler yollardan geçerken, kan-beyin ve bağırsak epitel bariyerleri 8,9 dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda parasellüler geçirgenliği değerlendirmek için kullanılmıştır. LY'nin geleneksel uygulaması, yarı geçirgen bir yüzey10 üzerinde tek katmanlı olarak yetiştirilen hücreleri kullanır. LY apikal yüzeye uygulanır ve bazolateral tarafta toplanmak için parasellüler sıkı bağlantı proteinlerinden geçer. Bazolateral bölmedeki daha yüksek LY konsantrasyonları, daha sonra bağırsak epitel hücre bariyeri parçalanması ve artan geçirgenlik10 ile birlikte sıkı bağlantı proteinlerinin azaldığını gösterir. Ayrıca, LY'nin medyaya eklendiği ve LY'nin lümen11'e alımı için bireysel enteroidlerin görüntülendiği 3D BO enteroid modellerinde de tanımlanmıştır. Bu, LY alımının görselleştirilmesi yoluyla nitel analize izin vermesine rağmen, nicel analiz sınırlıdır. Bu protokol, AO enteroidlerinde in vitro NEC enteroid modeli kullanarak parasellüler geçirgenliği değerlendirmek için LY kullanan ve 3D oryantasyonunu koruyan benzersiz bir tekniği özetlemektedir. Bu yöntem, geçirgenliğin hem kalitatif hem de nicel analizi için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Oklahoma Üniversitesi'nde Kurumsal İnceleme Kurulu onayına (IRB, #11610, 11611) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. IRB spesifikasyonlarına göre insan cerrahi örneklerini toplamadan önce ebeveyn onayı gerekiyordu. IRB onayı ve ebeveyn onayını takiben, NEC veya ostomi alımı veya atrezi onarımı gibi diğer bağırsak rezeksiyonu için ameliyat geçiren bebeklerden (düzeltilmiş gebelik yaşı (GA), hepsi 25-34 haftalık, tahmini GA'da erken doğum öyküsü olan, 2: 1 M: F olan) insan ince bağırsak dokusu elde edildi. Enteroidler jejunum veya ileumdan elde edilen dokudan üretildi.

1. İnsan bebek kaynaklı enteroid kültürler: tüm dokudan kript izolasyonu ve kaplama

  1. Önceki rapor4'ü takiben kültür medyası, şelatlama arabelleği #1 ve şelatlama arabelleği #2 (Tablo 1) hazırlayın. Şelatlama tamponlarını 4 °C'de saklayın ve 48 saat içinde kullanın.
  2. İnsan minigut medyasını hazırlayın (Tablo 1). Stoğu -20 ° C'de saklayın ve kullanmadan önce 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.
  3. %50 L-WRN şartlandırılmış ortam (CM) hazırlayın (Tablo 1). Stoğu 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
    NOT: Şartlandırılmış ortam için% 100 L-WRN tabanı, Miyoshi ve ark.12 tarafından bir protokolde tanımlanmıştır.
  4. Bir önceki rapor4'ü takiben cerrahi örneklerden elde edilen ince bağırsak dokusu örneklerinden enteroidler üretin. 0.75-2.5 g'lık bir bağırsak dokusundan 24 delikli bir plakada dört kuyucuk enteroid plakası.
    NOT: Enteroidler, 30 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamında, 4 ° C'de 50 mL'lik bir konik tüpte 48 saate kadar saklanan dokudan başarıyla üretilebilir.
  5. BMM kubbelerinin polimerizasyonuna izin vermek için 24 kuyucuklu plakayı 37 °C, %5 CO2 inkübatöre 15-20 dakika baş aşağı yerleştirin4.
  6. Her bir kuyucuğa 0.5 μL Y-27632, ROCK inhibitörü (RI, Malzeme Tablosuna bakınız) ile 500 μL% 50 L-WRN CM (adım 1.3'te açıklandığı gibi) ekleyin. 2-3 gün sonra, RI olmadan% 50 L-WRN CM ile değiştirin.

2. AO enteroidlerinin üretimi

  1. BMM'ye gömülü enteroidleri% 50 L-WRN CM4 ile 7-10 gün boyunca büyütün.
  2. Ortamı çıkarın ve bir kutucuğa 500 μL hücre kurtarma çözeltisi (CRS , bkz. Kubbeyi kazıyın, pipeti birkaç kez yukarı ve aşağı kazıyın, ardından CRS / enteroid / BMM çözeltisini bir sonraki kuyucuğa ekleyin.
  3. Kubbeyi kazıyın, pipeti birkaç kez yukarı ve aşağı kazıyın ve çözeltiyi bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. İkinci kutucuğa 500 μL CRS ekleyin, yukarı ve aşağı pipet verin, ardından ilk oyuğa ekleyin. Bu çözeltiyi aynı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  4. Adım 2.3'ü tekrarlayın, tüm kuyu içeriği CRS'de olana kadar iki kuyuyu bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
    NOT: İkiden fazla kuyu, büyük miktarlarda AO enteroidleri üretiyorsa, daha büyük bir 15 mL konik tüp içinde toplanabilir. Kuyu başına 500 μL CRS oranının korunması, BMM'nin tam çözünürlüğünü sağlamak için önemlidir.
  5. BMM'yi çözündürmek için mikrosantrifüj tüplerini (adım 2.3) havuzlanmış CRS / enteroid / BMM çözeltisi ile 4 ° C'de 1 saat boyunca bir rotatör üzerine yerleştirin.
  6. Çözeltiyi 4 ° C'de 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin, ardından süpernatantı bir mikropipetle çıkarın ve peleti geride bırakın.
  7. Enteroid peleti, mikrosantrifüj tüpü başına% 50 L-WRN CM'lik 1 mL'de (adım 1.3'te hazırlandığı gibi) yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan enteroid/ortam çözeltisinin 500 μL'sini ultra düşük ataşmanlı 24 delikli doku kültürü plakalarının her bir kuyucuğuna nazikçe pipetleyin (bkz.
  8. Denemeden önceki 3 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.

3. AO enteroid konformasyonunun tam montajlı immünofloresan boyama ile doğrulanması

  1. Enteroidlerin 3 gün boyunca ortam süspansiyonunda inkübasyonunu takiben, enteroid / medya süspansiyonunu bir kuyucuktan bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
  2. Enteroid/ortam süspansiyonunu 200 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı bir mikropipetle çıkarın.
  3. Enteroidleri 20 μL BMM'de yeniden askıya alın. Pipet 10 μL enteroid süspansiyonu mikroskop üzerine kaydırır ve yaklaşık 1 cm x 1 cm kare ince bir tabaka halinde yayar. Kalan 10 μL enteroid süspansiyonu ile aynı slaytın ayrı bir bölümünde tekrarlayın, böylece iki enteroid / BMM süspansiyonu lekesi olur.
  4. Enteroid/BMM yaymalarının oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca katılaşmasına izin verin.
  5. Duman davlumbazında çalışırken, sürgüyü bir boyama kavanozuna yerleştirin ve enteroid / BMM yaymasını örtene kadar% 4 paraformaldehit ile doldurun (10 slayt kapasiteli bir cam vitray kavanoz kullanılıyorsa bir slayt için ~ 30 mL). Fiksasyonun gerçekleşmesi için 30 dakika (oda sıcaklığında) bekleyin.
    DİKKAT: %4 paraformaldehit tehlikelidir ve göz hasarına/tahrişine, cilt tahrişine ve kansere neden olabilir. Kullanırken daima bir duman başlığı altında çalışın. Kullanırken koruyucu eldiven ve kişisel koruyucu ekipman giyin. Onaylı bir atık imha kabına atın.
  6. % 4 paraformaldehiti uygun bir atık kabına atın. Boyama kavanozuna veya PBS enteroid/BMM yaymalarını kaplayana kadar 30 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. RT'de 3 dakika bekletin ve ardından PBS'yi paraformaldehit atık şişesine atın. Toplam üç yıkama için bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
  7. PBS'de seyreltilmiş 30 mL'lik %0,5 Triton X-100 ile yeni bir boyama kavanozunu doldurun. Enteroid/BMM yaymalı slaytı Triton çözeltisine yerleştirin ve RT'de 20 dakika geçirgenleşmesine izin verin.
  8. PBS'de seyreltilmiş %0,5 Triton X-100'ü atın. Boyama kavanozuna 30 mL PBS ekleyin ve 3 dakika bekletin. PBS'yi dekantasyon yaparak atın.
  9. Enteroid / BMM yaymalarının etrafındaki slaytı nazikçe silin, onları bozmamaya dikkat edin. Hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak (bariyerli PAP kalemi, bakınız Malzeme Tablosu), enteroid/BMM yaymalarının her birinin etrafına bir daire çizin. Sekonder antikorun yükseldiği hayvana özgü% 20'lik bir serum yapın (bakınız Malzeme Tablosu).
  10. Mikroskop slaytını laboratuvar tezgahına düz bir şekilde yerleştirin. Hidrofobik bariyer kalemi tarafından halkalanan enteroid/BMM yaymalarının her birine adım 3.9'dan itibaren 100 μL spesifik %20 serum pipetleyerek slaytı 4 °C'de 1 saat boyunca bloke edin.
  11. PBS'de seyreltilmiş sırasıyla 1:100 ve 1:200 β-katenin ve ZO-1 primer antikorlarının seyreltilmesiyle 100 μL'lik bir çözelti hazırlayın.
    NOT: Her birincil antikor, görüntülendiklerinde farklı immünofloresan kanallara sahip olmalarını sağlamak için farklı bir hayvandan olmalıdır. Bu çalışmada bir fare β-katenin antikoru ve bir tavşan ZO-1 antikoru kullanılmaktadır (bakınız Malzeme Tablosu).
  12. % 20 serumu çıkarmak için tezgahın üzerindeki slayda dokunun ve enteroid / BMM yaymalarını bozmamaya dikkat ederek yavaşça kurulayın. Enteroid/BMM yaymalarından birine 100 μL β-katenin/ZO-1 primer antikor solüsyonu pipeti. Pipet, primer antikor olmaksızın 100 μL PBS'yi negatif kontrol olarak diğer enteroid/BMM üzerine smear eder.
  13. Nemlendirilmiş bir kap oluşturmak için plastik bir kabın tabanını ıslak bir kağıt havluyla hizalayın. Sürgüyü kabın içine yerleştirin, enteroid/BMM yaymalarını kaplayan çözeltileri bozmamaya dikkat edin. Kapağı kapatmak için kabın üzerine yerleştirin ve gece boyunca 4 ° C'de düz bir şekilde saklayın.
    NOT: Kızağın kurumasına izin vermeyin. Kurulaşmayı önlemek için kabın kapalı olduğundan emin olun.
  14. Devam etmeye hazır olduktan sonra, enteroid / BMM yaymalarından birincil antikorları ve PBS'yi çıkarmak için sayaç üzerindeki slayta dokunun.
  15. Slaytı bir boyama kavanozuna yerleştirip 30 mL PBS ile doldurarak veya PBS enteroid/BMM yaymalarını kaplayana kadar bir yıkama adımı uygulayın. Oda sıcaklığında 3 dakika bekletin. PBS'yi atın ve toplam üç yıkama için bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
  16. İki farklı immünofloresan kanal için 200 μL sekonder antikor hazırlayın, her antikor PBS'de 1:1000 seyreltmeye sahiptir (bkz. Çözümü ışıktan uzak tutun.
  17. Enteroid/BMM yaymalarının her birine 100 μL sekonder antikor çözeltisi pipetin. Karanlıkta yerleştirin ve RT'de 1 saat bekletin.
  18. İkincil antikorları çıkarmak için sayaç üzerindeki slayta dokunun. Adım 3.15'te belirtilen yıkama adımlarını tekrarlayın ve tüm yıkamaların karanlıkta yapıldığından emin olun.
  19. Enteroid/BMM yaymalarının her birine 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI'li Floroshield, Malzeme Tablosuna bakınız) montaj ortamı damlatın ve her iki lekenin de yeterince örtülmesini sağlamak için bir örtü slip uygulayın. Kabarcıkları kapak kapağının altına hapsetmekten kaçının. Mikroskop altında görüntülemeye hazır olana kadar slaytı karanlıkta tutun.
    NOT: Slaytların anında görüntülenmesi en uygun sonuçları verir; Bununla birlikte, slaytlar 4 ° C'de nemlendirilmiş bir kapta düz bir şekilde saklanabilir ve DAPI'nin eklenmesinden sonra 1 haftaya kadar görüntülenebilir.

4. Deneysel NEC'nin indüksiyonu

  1. AO enteroidlerinin kullanımdan önce en az 72 saat boyunca süspansiyonda olduğundan emin olun.
  2. Her bir kuyucuktan gelen tüm enteroid/ortam süspansiyonunu nazikçe bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
    NOT: Çok sayıda kuyu işlendiğinde birden fazla kuyu 15 mL'lik bir konik tüp halinde toplanabilir. Bu protokol için tedavi grubu başına en az üç kuyu önerilir.
  3. RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
  4. Kuyucuk başına 500 μL %50 LWRN CM'ye 10 μL 5 mg/mL lipopolisakkarit (LPS, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin (son konsantrasyon 100 μg/mL LPS).
  5. Tedavi grubu olarak belirlenen AO enteroidleri% 50 LWRN + LPS ve aliquot 500 μL süspansiyonda 24 kuyucuklu ultra düşük bir bağlantı plakasına yeniden askıya alın. Tedavi edilmemiş kontroller olarak belirlenen AO enteroidlerini, kuyu başına% 50 LWRN CM'nin 500 μL'sinde yeniden askıya alın. Bu süspansiyonun Aliquot 500 μL'si ayrı bir 24 kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasına.
  6. LPS ile muamele edilmiş AO enteroidlerinde, üreticinin talimatlarına göre% 1O2,% 5 CO 2 ve% 94N 2 ile modüler bir inkübatör odası (MIC) aracılığıyla hipoksi indükleyin (bkz. Enteroidleri 24 saat boyunca hipoksi ve LPS ile tedavi edin.
  7. Tedavi edilmemiş ve LPS + hipoksi ile tedavi edilmiş kültürleri, hala MIC odasında, 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.

5. LY kullanılarak parasellüler geçirgenliğin ölçülmesi

  1. Her bir kuyucuktan enteroid/ortam süspansiyonunu nazikçe bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. 37 °C su banyosunda sıcak DPBS ve %50 LRWN CM.
  2. Enteroid/ortam süspansiyonunu RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
  3. Medyayı kaldırın. Enteroidleri ılık 500 μL DPBS ile yıkayın.
  4. RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Süpernatantı bir mikropipetle çıkarın.
  5. 5.3-5.4 arasındaki adımları toplam iki kez olmak üzere bir kez daha yineleyin.
  6. Yıkadıktan sonra, 450 μL sıcak% 50 LWRN CM ekleyin (adım 1.3'te hazırlandığı gibi).
  7. Her bir oyuğa 50 μL 2.5 mg / mL LY (son konsantrasyon 0.25 μg / μL'dir, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve karıştırmak için yavaşça döndürün. 37 °C, %5 CO 2 inkübatöre2 saat bekletin.
  8. Her bir kuyucuktan enteroid/ortam süspansiyonunu nazikçe bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
  9. RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın, ardından enteroid peleti geride bırakarak süpernatanı çıkarın.
  10. Enteroidleri 500 μL ılık DPBS ile yıkayın.
  11. RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın, ardından enteroid peleti geride bırakarak süpernatantı çıkarın.
  12. Toplam dört yıkama için 5.10-5.11 arasındaki adımları üç kez daha yineleyin.
  13. Her peleti 1.000 μL soğuk DPBS ile yeniden askıya alın ve enteroidleri ayırmak için pipeti kuvvetli bir şekilde yukarı ve aşağı doğru kuvvetlice uygulayın.
  14. DPBS cinsinden seyreltilmiş LY standart eğrisi için standartlar hazırlayın (100 ng / mL; 50 ng / mL; 25 ng / mL; 12.5 ng / mL; 6.25 ng / mL; 3.13 ng / mL; 1.57 ng / mL; 0 ng / mL).
  15. Pipet, 96 delikli bir plaka üzerinde üçlü olarak kuyucuk başına her numunenin 150 μL'si.
  16. Floresansı okuyabilen bir plaka okuyucuda 428 nm'lik bir uyarma zirvesinde ve 536 nm'lik bir emisyon zirvesinde floresanı ölçün (bkz. İstatistiksel yazılım kullanarak (bakınız Malzeme Tablosu), standart eğriyi enterpolasyon yaparak ve dört parametreli bir eğri kullanarak konsantrasyonları hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AO konformasyonu
72 saat boyunca P LWRN ortamında asılı kalan enteroidler AO konformasyonu varsayar (Şekil 1). Bu, apikal proteinin enteroid bütün montajları, zonula oklüdens-1 (ZO-1) ve bazolateral protein, β-katenin (Şekil 1) kullanılarak immünofloresan boyama ile doğrulandı. AO enteroidleri, enteroidin dış, apikal yüzeyinde ZO-1 (yeşil) gösterirken, β-katenin (kırmızı) iç, bazolateral yüzeydedir (Şekil 1A

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak geçirgenliği karmaşıktır ve epitel bariyer fonksiyonunu yansıtır. Bağırsak bariyeri, transsellüler ve parasellüler transporta aracılık eden tek bir epitel hücresi tabakasından oluşur14. Parasellüler geçirgenlik, epitel hücreleri arasındaki boşluğu kapatan sıkı bağlantı proteinlerine dayanır14. Bu parasellüler taşıma içinde, moleküllerin geçebileceği üç ayrı yol vardır: gözenek, sızıntı ve sınırsız15. Gözenek yolu, küçük yüklü iyonlara geçirg...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu makalede bahsedilen herhangi bir üründe veya kavramda mülkiyet veya ticari çıkar sağlamadıklarını bildirmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rochester Üniversitesi Tıp Merkezi'nden Ashley Nelson'a enteroid modelimize verdiği araçsal yardım için teşekkür ederiz. Oklahoma Üniversitesi Çocuk Cerrahisi Bölümü'ne de bu projeye verdikleri destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Oklahoma Yetişkin Kök Hücre Araştırmaları Merkezi ve Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Cerrahi Bölümü'ne verilen Presbiteryen Sağlık Vakfı Hibe #20180587 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
[leu] 15-gastrin 1Millipore SigmaG9145-.1MG
100 ve mikro; m steril hücre süzgeciCorning431752
%100 LWRN şartlandırılmış ortamMiyoshi ve ark.12
24 kuyulu doku kültürü plakasıizlenerek3526
96 oyuklu siyah, şeffaf alt plakaGreiner Bio-One655090
A-83-01R& D Sistemleri2939/10
Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan ikincil ab, 1:1000InvitrogenA-11034
Alexa Fluor 594 keçi anti-fare ikincil ab, 1:1000InvitrogenA-11032
Amfoterisin BThermo Fisher Scientific15290026
Anti-zonula okcludens-1 tavşan birincil ab, 1:200Hücre Sinyali#D6L1E
Anti-β-katenin fare birincil ab, 1:100Hücre Sinyali#14-2567-82
B-27 takviyesi eksi A VitaminiThermo Fisher Scientific17504-044
Bariyer PAP kalemiBilimsel Cihaz Laboratuvarı9804-02
BMM (Matrigel)CorningCB-40230C
Hücre Geri Kazanım ÇözeltisiCorning354270
Diseksiyon makası
DMEMThermo Fisher Scientific11-965-118
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific11320-082
DPBSThermo Fisher Scientific14-190-144
Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)Millipore SigmaGF144
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Millipore SigmaEDS-500G
EVOS m7000 Görüntüleme sistemiInvitrogenAMF7000
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gemini Bio-Products100-525
DAPIMillipore SigmaF6057-20mL
Forseps
GentamisinThermo Fisher Scientificile Fluoroshield15-750-060
Cam lameller
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050-061
GraphPad Prizma 9Dotmatics
İnsülinThermo Fisher Scientific12585014
Lipopolisakkarit (LPS)Millipore SigmaL2630-25MG
Lucifer Sarı CH, Lityum TuzuInvitrogenL453
Modüler kuluçka odasıBillups Rothenberg Inc.MIC101
N-2 takviyesiThermo Fisher Scientific17502-048
N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit (HEPES)Thermo Fisher Scientific15630-080
N-AsetilsisteinMillipore SigmaA9165-5G
NikotinamidMillipore SigmaN0636-100G
Penisilin-StreptomisinThermo Fisher Scientific15140-148
Soğutmalı sallanan kova santrifüjü
Soğutmalı masa üstü mikrosantrifüj
RPMI 1640 OrtaThermo Fisher Scientific11875093
SB202190Millipore SigmaS7067-5MG
SpectraMax iD3 mikroplaka okuyucuMoleküler cihazlar
Tüp Revolver DöndürücüThermoFisher Scientific88881001
Ultra düşük ataşman 24 oyuklu doku kültürü plakasıCorning3473
Y-27632, ROCK inhibitörü (RI)Tocris1254
şirket içinde üretilmiştir Corning

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492(2020).
  2. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761(2021).
  3. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  4. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194(2019).
  5. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  6. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  7. Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960(2017).
  8. Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186(2021).
  9. Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900(2019).
  10. Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
  11. Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383(2019).
  12. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  13. Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
  14. Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
  15. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
  16. Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677(2021).
  17. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  18. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871(2018).
  19. Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330(2021).
  20. Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Apikal D EnteroidlerParasell ler Ge irgenlikNekrotizan EnterokolitLipopolisakkarit UygulamasHipoksi nd ksiyonuFloresan Plaka Okuyucumm nofloresan Boyama

İlgili makaleler