Mevcut protokol, mavi-LED aydınlatma tekniğini kullanarak TLC plakasındaki bileşiklerin verimini tahmin etmek için bir yöntem geliştirdi. Bu yaklaşımın avantajları, güvenli, etkili, ucuz olması ve araştırmacının aynı anda birden fazla örneği ölçmesine izin vermesidir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
TLC Plakasındaki Bileşiklerin Veriminin Mavi-LED Aydınlatma Tekniği ile Tahmin Edilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
İnce tabaka kromatografisi (TLC), bilinmeyen numunelerin verimini ölçmek için organik kimya araştırmalarında yaygın olarak kullanılan erişilebilir bir analitik tekniktir. Bu çalışma, mavi-LED aydınlatıcıyı kullanarak bir TLC plakasındaki numunelerin verimini tahmin etmek için etkili, ucuz ve güvenli bir yöntem geliştirdi. Aspergillus terreus'tan ekstrakte edilen Lovastatin, bu çalışmada kullanılan örnek bileşiktir. Lovastatin verimini değerlendirmek için lovastatin standardına dayanan regresyon modelleri kullanılmıştır. Üç yöntem karşılaştırıldı: biyotahlil, UV algılama ve mavi-LED aydınlatma. Sonuç, mavi-LED aydınlatma yönteminin UV algılama ve biyotahlil yöntemlerinden önemli ölçüde daha fazla zaman etkili olduğunu göstermiştir. Ek olarak, mavi-LED aydınlatma, biyotahlil yöntemindeki biyolojik tehlikeler (örneğin, mikrobiyal enfeksiyon) ve UV algılama yönteminde ultraviyole maruziyeti endişesi nedeniyle nispeten güvenli bir seçenekti. GC, HPLC ve HPTLC gibi bağımsız olarak çalışmadan önce özel cihazlar ve uzun süreli eğitim gerektiren pahalı yöntemlerle karşılaştırıldığında, mavi-LED aydınlatıcıyı kullanmak, bir TLC plakasından numunelerin verimini tahmin etmek için ekonomik bir seçenekti.
Giriş
İnce tabaka kromatografisi (TLC), organik kimya alanında kalitatif ve kantitatif bir teknik olarak yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3. TLC'nin başlıca avantajları, hızlı algılama, esnek numune gereksinimleri sağlaması ve özel ekipman gerektirmemesidir4. Bugüne kadar, birçok gelişmiş yaklaşım oluşturulmuş olmasına rağmen, TLC hala bir karışımdaki bilinmeyen numuneleri tanımlamak için ana yöntemdir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın zorluğu, özellikle sınırlı bütçeli laboratuvarlar geliştirmek için numune verimini ölçmek için güvenli ve ucuz ekipman eksikliğidir. Bu nedenle bu çalışma, numunelerin verimini tahmin etmek için TLC ile birleşen verimli, güvenli ve ucuz bir yöntem geliştirmeyi amaçlamıştır.
Yüksek performanslı TLC (HPTLC), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve gaz kromatografisinin (GC) aksine, katı numune gereksinimleri, zaman alıcı ve numune hazırlama1,5 için çok adımlı katılım, TLC çeşitli avantajlar göstermiştir. İlk olarak, numune hazırlama için, HPLC ve GC ham ekstraktı tespit edemez, çünkü ham ekstrakt HPLC ve GC sütununu tıkayabilir. İkincisi, numuneler UV açısından uygun olmadığında (HPLC analizi için önemli) veya düşük uçuculukta (GC analizi için önemli), bu numunelere TLC uygulanabilir ve görselleştirme reaktifinin kullanılması, izole edilmiş numuneleri ince tabakalar üzerinde görünür kılar 6,7,8. Üçüncüsü, genel kullanıcılar için, HPLC ve GC genellikle TLC'ye kıyasla bağımsız olarak çalışmadan önce nispeten uzun bir ön eğitim gerektirir. Ek olarak, yüksek performanslı TLC (HPTLC) olarak bilinen nicel TLC analizi, son derece hassas bir tarayıcıyla TLC plakasındaki bilgileri dijitalleştirebilir. Bununla birlikte, HPTLC sisteminin maliyeti nispeten pahalıdır. Bu nedenle, TLC plakasındaki numuneleri ölçmek için uygun maliyetli ve hızlı bir yaklaşım geliştirmek önemli bir konudur.
TLC verim ölçümü için benzer yöntemler geliştirilmiştir; Örneğin, Johnson9, bir bilgisayara bağlı düz yataklı bir tarayıcı kullanarak TLC plakasındaki numunelerin miktarının belirlenmesine izin veren bir teknik bildirmiştir. 2001 yılında, El-Gindy ve ark.10, bileşiği optik yoğunlukla tespit etmek için kullanılan TLC-dansitometrik yöntemini geliştirdi ve teknik Elkady ve ark.11 tarafından da uygulandı. 2007 yılında Hess2, UV ışığı ile birleştirilmiş bir dijital kamera kullanarak TLC plakası üzerindeki bir bileşiğin verimini tespit etmek için uygulanan dijital olarak geliştirilmiş TLC (DE-TLC) yöntemini sundu. Hess ayrıca HPTLC ve DE-TLC yöntemi arasındaki maliyet farklarını karşılaştırdı ve DE-TLC yönteminin uygun maliyetli olması nedeniyle lise ve üniversite laboratuvarlarında kullanılabileceği sonucuna vardı2. Bununla birlikte, TLC-densitometrik yöntemin maliyeti hala pahalıydı ve ultraviyole ışığın çalışması, kullanıcıların ultraviyole radyasyona maruz kalabileceği durumlarda yeterli ön eğitim gerektiriyordu. Bu nedenle, TLC ile uyumlu, numune verimini ölçmek için verimli, güvenli ve ucuz bir yöntem geliştirmek arzu edilir.
Bu çalışma, mavi-LED aydınlatıcıyı kullanarak bir TLC plakası üzerindeki numuneyi tespit etmek için bir protokol tanımladı ve bantların boyutlarını ölçmek ve ardından bileşik verimini belirlemek için yüksek güvenilirliğe (yüksek R-kare değeri) sahip bir regresyon modeli geliştirdi. Son olarak, mavi-LED aydınlatma yönteminin nispeten güvenli olduğu bulunmuştur (vs. UV algılama yöntemi), ucuz (vs. GC, HPLC ve HPTLC) ve verim ölçümü için etkili (biyotahlil yöntemine karşı) yaklaşım.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Mevcut protokol örnek olarak lovastatin kullanılarak açıklanmıştır. Lovastatin, bir haftalık Aspergillus terreus'tan çıkarıldı.
1. Bileşik ekstraksiyon
NOT: Bileşik ekstraksiyonu ile ilgili ayrıntılar için lütfen Şekil 1'e bakınız.
- Kültür Aspergillus terreus patates dekstroz agar üzerinde (PDA, bakınız Malzeme Tablosu) 30 °C'de orta.
- Kültürü 24 saat boyunca 40 °C'de kurutun. Kurutulmuş kültürü sterilize cımbız kullanarak 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 15 mL etil asetat ekleyin.
- Karışımı 1 dakika boyunca vorteksleme yaparak kuvvetlice çalkalayın ve 200 rpm'de çalkalayarak 40 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- 1 saat boyunca 40 ° C'de 40 kHz ultrasonik banyo ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak karışımı sonikleştirin.
- Karışımı oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj yapın ve 11 μm filtre kağıdından süzün.
- Filtrasyonu bir ayırma hunisinde eşit miktarda steril su ile çıkarın.
- Faz ayırmadan sonra, organik tabakayı toplayın ve ardından döner bir evaporatörde buharlaştırın (bkz. Kalıntıyı 2 mL etil asetat içinde çözün.
2. Ham ekstraktın normal faz (NP) adsorpsiyon sütunu ile ayrılması
- Kolonu sabit faz olarak NP silika jel ile paketleyin ve mobil faz olarak n-hekzan: etil asetat: trifloroasetik asit (H: E: T; 80: 20: 0.1, v / v / v) kullanın.
- Ekstraktın 2 mL'sini (adım 1) kolona yükleyin ve ekstraktı ertelemek için mobil faz çözücüyü 1 mL / dak akış hızında ekleyin.
NOT: Akış hızı bir stopcock kullanılarak manuel olarak kontrol edildi. - Lovastatinin varlığını doğrulamak için atık suyu TLC ile doğrulayın ve ardından çözücü çıkarılana kadar 45 ° C'de döner bir evaporatörde buharlaştırın. Bu adım yaklaşık 20-25 dakika sürer.
- Kalıntıyı 1 mL etil asetat içinde çözün ve daha sonra% 1'lik eşit hacimli trifloroasetik asit ile karıştırın.
- Karışımı oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj edin ve organik tabakayı yeni bir cam tüp içinde toplayın.
3. İnce tabakalı kromatogram (TLC) plakaların hazırlanması ve yüklenmesi
- Bir kılcal pipet kullanarak TLC plakasının taban çizgisine 5 μL numune ve lovastatin standartlarını (bkz. Malzeme Tablosu) yerleştirin ve TLC plakasının yanlarında 1 cm'lik bir kenarlık bırakın.
- TLC plakasını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir davlumbazda kurulayın.
- Plakayı forseps ile nazikçe mobil faz çözücüyü içeren doymuş bir cam hazneye yerleştirin. Odayı bir cam kapakla örtün ve plakanın tamamen gelişmesine izin verin.
- Solvent hattı plakanın üstünden 1 cm'ye ulaştığında plakayı odadan çıkarın.
4. Mavi-LED aydınlatıcı ile analiz
- Çözücü çizgisini bir kalemle işaretleyin. Plakayı davlumbazda oda sıcaklığında 10 dakika kurutun.
- Kuruduktan sonra, plakayı hemen% 10H2SO4 çözücüye batırın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca davlumbazda kurutun.
- Kahverengi lekeler görünene kadar plakayı ısıtma paneline yerleştirin. Plakanın aşırı ısınmadığından emin olun, çünkü bu lovastatinin görselleştirilmesini zorlaştırabilir.
- Plakayı mavi-LED aydınlatıcıya aktarın ve uyumlu bir ücretsiz yazılım (MiBio Fluo) kullanarak tarayın ( bkz.
5. Regresyon modeli ile verim tahmini
- ImageJ yazılımını kullanarak bantların boyutunu ölçün (bkz.
- 1 mg / mL, 0.75 mg / mL, 0.5 mg / mL ve 0.25 mg / mL dahil olmak üzere lovastatin standartlarının azalan konsantrasyonlarına dayanan veri analizi ve grafik yazılımı kullanarak bir regresyon modeli oluşturun (bkz.
- Örneklerin verimini tahmin etmek için regresyon modelini uygulayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu çalışmada, bileşiklerin verimini tahmin etmek için mavi-LED aydınlatma yöntemi sunulmuş ve bu yöntem biyotahlil ve UV ile saptanan yöntemlerle doğrulanarak karşılaştırılmıştır (Tablo 1). Regresyon modelleri, numunelerin verimini tahmin etmek için sırasıyla üç yöntem için bantların boyutlarına ve standartların konsantrasyonuna dayanarak geliştirilmiştir. İlk olarak, biyotahlil yönteminin sonuçlarında, inhibisyon bölgesinin boyutları ile lovastatin standartları arasındaki R-karesi 0.99 idi ve örnek veri...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada, HPTLC, HPLC ve GC yöntemi gibi pahalı ve özel ekipman kullanmadan bileşikleri ölçmek için yeni bir yaklaşım olan mavi-LED aydınlatıcı tanımlanmıştır ve yöntem, nicelleştirme performansını değerlendirmek için biyotahlil ve UV tarafından tespit edilen yöntemlerle karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak, mavi-LED aydınlatma yönteminin, TLC plakası üzerinde hedeflenen bileşiklerin verimini ölçmek için kullanılan nispeten güvenli ve etkili bir protokol olduğu sonucuna varılmıştır.
Önceki ça...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MOST 108-2320-B-110-007-MY3) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Amerikan bakteriyolojik Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Mavi-LED aydınlatıcı | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Santrifüj | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Kompakt UV lambası | UVP | UVGL-25 | |
| Etil Asetat | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filtre Kağıdı 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Ücretsiz | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standardı | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hekzan | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Patates dekstroz suyu H | STBIO MEDIA | ||
| 110533 Döner buharlaştırıcı | EYELA | SB-1000 | |
| Sülfürik asit | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silika jel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifloroasetik asit | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonik titreşim makinesi | DELTA | DC600 |
Kaynaklar
- Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078(2014).
- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
- Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
- Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
- Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
- Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
- Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
- Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
- Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
- El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
- Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
- Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
