TLC Plakasındaki Bileşiklerin Veriminin Mavi-LED Aydınlatma Tekniği ile Tahmin Edilmesi

İnce tabaka kromatografisi (TLC), organik kimya alanında kalitatif ve kantitatif bir teknik olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ^1,2,3. TLC'nin başlıca avantajları, hızlı algılama, esnek numune gereksinimleri sağlaması ve özel ekipman gerektirmemesidir⁴. Bugüne kadar, birçok gelişmiş yaklaşım oluşturulmuş olmasına rağmen, TLC hala bir karışımdaki bilinmeyen numuneleri tanımlamak için ana yöntemdir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın zorluğu, özellikle sınırlı bütçeli laboratuvarlar geliştirmek için numune verimini ölçmek için güvenli ve ucuz ekipman eksikliğidir. Bu nedenle bu çalışma, numunelerin verimini tahmin etmek için TLC ile birleşen verimli, güvenli ve ucuz bir yöntem geliştirmeyi amaçlamıştır.

Yüksek performanslı TLC (HPTLC), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve gaz kromatografisinin (GC) aksine, katı numune gereksinimleri, zaman alıcı ve numune hazırlama^1,5 için çok adımlı katılım^, TLC çeşitli avantajlar göstermiştir. İlk olarak, numune hazırlama için, HPLC ve GC ham ekstraktı tespit edemez, çünkü ham ekstrakt HPLC ve GC sütununu tıkayabilir. İkincisi, numuneler UV açısından uygun olmadığında (HPLC analizi için önemli) veya düşük uçuculukta (GC analizi için önemli), bu numunelere TLC uygulanabilir ve görselleştirme reaktifinin kullanılması, izole edilmiş numuneleri ince tabakalar üzerinde görünür kılar ^6,7,8. Üçüncüsü, genel kullanıcılar için, HPLC ve GC genellikle TLC'ye kıyasla bağımsız olarak çalışmadan önce nispeten uzun bir ön eğitim gerektirir. Ek olarak, yüksek performanslı TLC (HPTLC) olarak bilinen nicel TLC analizi, son derece hassas bir tarayıcıyla TLC plakasındaki bilgileri dijitalleştirebilir. Bununla birlikte, HPTLC sisteminin maliyeti nispeten pahalıdır. Bu nedenle, TLC plakasındaki numuneleri ölçmek için uygun maliyetli ve hızlı bir yaklaşım geliştirmek önemli bir konudur.

TLC verim ölçümü için benzer yöntemler geliştirilmiştir; Örneğin, Johnson⁹, bir bilgisayara bağlı düz yataklı bir tarayıcı kullanarak TLC plakasındaki numunelerin miktarının belirlenmesine izin veren bir teknik bildirmiştir. 2001 yılında, El-Gindy ve ark.10, bileşiği optik yoğunlukla tespit etmek için kullanılan TLC-dansitometrik yöntemini geliştirdi ve teknik Elkady ve ^ark.11 tarafından da uygulandı. 2007 yılında Hess², UV ışığı ile birleştirilmiş bir dijital kamera kullanarak TLC plakası üzerindeki bir bileşiğin verimini tespit etmek için uygulanan dijital olarak geliştirilmiş TLC (DE-TLC) yöntemini sundu. Hess ayrıca HPTLC ve DE-TLC yöntemi arasındaki maliyet farklarını karşılaştırdı ve DE-TLC yönteminin uygun maliyetli olması nedeniyle lise ve üniversite laboratuvarlarında kullanılabileceği sonucuna vardı². Bununla birlikte, TLC-densitometrik yöntemin maliyeti hala pahalıydı ve ultraviyole ışığın çalışması, kullanıcıların ultraviyole radyasyona maruz kalabileceği durumlarda yeterli ön eğitim gerektiriyordu. Bu nedenle, TLC ile uyumlu, numune verimini ölçmek için verimli, güvenli ve ucuz bir yöntem geliştirmek arzu edilir.

Bu çalışma, mavi-LED aydınlatıcıyı kullanarak bir TLC plakası üzerindeki numuneyi tespit etmek için bir protokol tanımladı ve bantların boyutlarını ölçmek ve ardından bileşik verimini belirlemek için yüksek güvenilirliğe (yüksek R-kare değeri) sahip bir regresyon modeli geliştirdi. Son olarak, mavi-LED aydınlatma yönteminin nispeten güvenli olduğu bulunmuştur (vs. UV algılama yöntemi), ucuz (vs. GC, HPLC ve HPTLC) ve verim ölçümü için etkili (biyotahlil yöntemine karşı) yaklaşım.

Mevcut protokol örnek olarak lovastatin kullanılarak açıklanmıştır. Lovastatin, bir haftalık Aspergillus terreus'tan çıkarıldı.

1. Bileşik ekstraksiyon

NOT: Bileşik ekstraksiyonu ile ilgili ayrıntılar için lütfen Şekil 1'e bakınız.

1. Kültür Aspergillus terreus patates dekstroz agar üzerinde (PDA, bakınız Malzeme Tablosu) 30 °C'de orta.
2. Kültürü 24 saat boyunca 40 °C'de kurutun. Kurutulmuş kültürü sterilize cımbız kullanarak 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 15 mL etil asetat ekleyin.
3. Karışımı 1 dakika boyunca vorteksleme yaparak kuvvetlice çalkalayın ve 200 rpm'de çalkalayarak 40 ° C'de 1 saat inkübe edin.
4. 1 saat boyunca 40 ° C'de 40 kHz ultrasonik banyo ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak karışımı sonikleştirin.
5. Karışımı oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj yapın ve 11 μm filtre kağıdından süzün.
6. Filtrasyonu bir ayırma hunisinde eşit miktarda steril su ile çıkarın.
7. Faz ayırmadan sonra, organik tabakayı toplayın ve ardından döner bir evaporatörde buharlaştırın (bkz. Kalıntıyı 2 mL etil asetat içinde çözün.

2. Ham ekstraktın normal faz (NP) adsorpsiyon sütunu ile ayrılması

1. Kolonu sabit faz olarak NP silika jel ile paketleyin ve mobil faz olarak n-hekzan: etil asetat: trifloroasetik asit (H: E: T; 80: 20: 0.1, v / v / v) kullanın.
2. Ekstraktın 2 mL'sini (adım 1) kolona yükleyin ve ekstraktı ertelemek için mobil faz çözücüyü 1 mL / dak akış hızında ekleyin.
   NOT: Akış hızı bir stopcock kullanılarak manuel olarak kontrol edildi.
3. Lovastatinin varlığını doğrulamak için atık suyu TLC ile doğrulayın ve ardından çözücü çıkarılana kadar 45 ° C'de döner bir evaporatörde buharlaştırın. Bu adım yaklaşık 20-25 dakika sürer.
4. Kalıntıyı 1 mL etil asetat içinde çözün ve daha sonra% 1'lik eşit hacimli trifloroasetik asit ile karıştırın.
5. Karışımı oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj edin ve organik tabakayı yeni bir cam tüp içinde toplayın.

3. İnce tabakalı kromatogram (TLC) plakaların hazırlanması ve yüklenmesi

1. Bir kılcal pipet kullanarak TLC plakasının taban çizgisine 5 μL numune ve lovastatin standartlarını (bkz. Malzeme Tablosu) yerleştirin ve TLC plakasının yanlarında 1 cm'lik bir kenarlık bırakın.
2. TLC plakasını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir davlumbazda kurulayın.
3. Plakayı forseps ile nazikçe mobil faz çözücüyü içeren doymuş bir cam hazneye yerleştirin. Odayı bir cam kapakla örtün ve plakanın tamamen gelişmesine izin verin.
4. Solvent hattı plakanın üstünden 1 cm'ye ulaştığında plakayı odadan çıkarın.

4. Mavi-LED aydınlatıcı ile analiz

1. Çözücü çizgisini bir kalemle işaretleyin. Plakayı davlumbazda oda sıcaklığında 10 dakika kurutun.
2. Kuruduktan sonra, plakayı hemen% 10_H2SO₄ çözücüye batırın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca davlumbazda kurutun.
3. Kahverengi lekeler görünene kadar plakayı ısıtma paneline yerleştirin. Plakanın aşırı ısınmadığından emin olun, çünkü bu lovastatinin görselleştirilmesini zorlaştırabilir.
4. Plakayı mavi-LED aydınlatıcıya aktarın ve uyumlu bir ücretsiz yazılım (MiBio Fluo) kullanarak tarayın ( bkz.

5. Regresyon modeli ile verim tahmini

1. ImageJ yazılımını kullanarak bantların boyutunu ölçün (bkz.
2. 1 mg / mL, 0.75 mg / mL, 0.5 mg / mL ve 0.25 mg / mL dahil olmak üzere lovastatin standartlarının azalan konsantrasyonlarına dayanan veri analizi ve grafik yazılımı kullanarak bir regresyon modeli oluşturun (bkz.
3. Örneklerin verimini tahmin etmek için regresyon modelini uygulayın.

Bu çalışmada, bileşiklerin verimini tahmin etmek için mavi-LED aydınlatma yöntemi sunulmuş ve bu yöntem biyotahlil ve UV ile saptanan yöntemlerle doğrulanarak karşılaştırılmıştır (Tablo 1). Regresyon modelleri, numunelerin verimini tahmin etmek için sırasıyla üç yöntem için bantların boyutlarına ve standartların konsantrasyonuna dayanarak geliştirilmiştir. İlk olarak, biyotahlil yönteminin sonuçlarında, inhibisyon bölgesinin boyutları ile lovastatin standartları arasındaki R-karesi 0.99 idi ve örnek verimi regresyon modeli tarafından öngörülen 0.56 mg idi (Şekil 2). İkincisi, UV tespit yönteminde, lovastatin standartları ile TLC plakasındaki bantların boyutu arasındaki R-karesi 0.97 idi ve regresyon modeli tarafından öngörülen numunenin verimi 0.53 mg idi (Şekil 3). Özellikle, bandın kenarları bulanıktı ve nispeten düşük sinyal yoğunluğu bantları gözlendi (Şekil 3A). Üçüncüsü, mavi-LED aydınlatma yönteminde, lovastatin standartları ile TLC plakasındaki bantların boyutu arasındaki R-karesi 0.98 idi ve örnek verimi regresyon modeli tarafından öngörülen 0.54 mg idi (Şekil 4). Mavi-LED aydınlatıcı kullanılarak tahmin edilen verim, biyotahlil yöntemine (kontrol olarak ayarlanmış) daha yakındı. Bandın boyutu lovastatin miktarı ile orantılıydı ve berrak bantlar mavi-LED aydınlatma yöntemiyle elde edildi. Ek olarak, biyotahlil, UV algılamalı ve mavi-LED aydınlatma yöntemlerinin çalışma saatleri sırasıyla yaklaşık 24 saat, 2 saat ve 1 saat idi; (Not: çalışma saati, lovastatinin verim incelemesi için harcanan toplam süre anlamına gelir).

Şekil 1: Protokolün çalışma akışı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Biyotahlil yöntemi. (A) Neurospora crassa'ya karşı lovastatin biyotahlili (30 °C'de 24 saat boyunca inkübe edilir). Denemenin sonunda, 90 mm'lik agar plakaları görünür ışık altında fotoğraflandı. (B) Altı lovastatin standardının konsantrasyonları şunlardı: No. 1 (1 mg / mL), No. 2 (0.75 mg / mL), No. 3 (0.5 mg / mL) ve No. 4 (0.25 mg / mL). 5 numaralı örneklem ×0.25'e (1:4) seyreltildi. 6 numaralı örnek, 0.5× (1:2) kadar seyreltildi. İnhibisyon bölgesi boyutu (mm2) görüntüleme yazılımı ile ölçüldü. (C) Standartların inhibisyon bölgesi boyutuna dayalı veri analizi ve grafik yazılımı kullanılarak bir regresyon modeli geliştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: UV ışığına maruz kalan ince tabaka kromatogram (TLC) plakası. (A) TLC analizinde mobil faz olarak n-hekzan:etil asetat (2:3 v/v) kullanılmış ve TLC plakası geliştiriciye batırıldıktan sonra UV ışığına (365 nm) maruz bırakılmıştır (H2SO4). (B) Altı lovastatin standardının konsantrasyonları şunlardı: No. 1 (1 mg / mL), No. 2 (0.75 mg / mL), No. 3 (0.5 mg / mL) ve No. 4 (0.25 mg / mL). 5 numaralı örneklem ×0.25'e (1:4) seyreltildi. 6 numaralı örnek, 0.5× (1:2) kadar seyreltildi. İnhibisyon bölgesi boyutu (mm2) görüntüleme yazılımı ile ölçüldü. (C) TLC plakası üzerindeki lovastatin standart bantlarının boyutuna dayalı veri analizi ve grafik yazılımı kullanılarak bir regresyon modeli geliştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Mavi-LED aydınlatıcı tarafından taranan ince katmanlı kromatogram (TLC) plakası. (A) TLC analizinde mobil faz olarak n-hekzan:etil asetat (2:3 v/v) kullanıldı ve TLC plakası mavi-LED aydınlatıcı tarafından tarandı. (B) Altı lovastatin standardının konsantrasyonları şunlardı: No. 1 (1 mg / mL), No. 2 (0.75 mg / mL), No. 3 (0.5 mg / mL) ve No. 4 (0.25 mg / mL). 5 numaralı örneklem ×0.25'e (1:4) seyreltildi. 6 numaralı örnek, 0.5× (1:2) kadar seyreltildi. İnhibisyon bölgesi boyutu (mm2) görüntüleme yazılımı ile ölçüldü. (C) TLC plakası üzerindeki lovastatin standart bantlarının boyutuna dayalı veri analizi ve grafik yazılımı kullanılarak bir regresyon modeli geliştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan üç tespit yönteminin karşılaştırılması.

Tablo 2: Önceki yöntemler ile mevcut çalışmanın karşılaştırılması.

Ek Şekil 1: Ampisilinli ince tabakalı kromatogram (TLC) plakası mavi-LED aydınlatma yöntemi ile taranmıştır. (A) Etil asetat: metanol (9: 13 v / v), TLC analizinde mobil faz olarak kullanıldı ve TLC plakası mavi-LED aydınlatıcı tarafından tarandı. (B) Dört ampisilin standardının konsantrasyonu şunlardı: No. 1 (100 mg / mL), No. 2 (75 mg / mL), No. 3 (50 mg / mL) ve No. 4 (25 mg / mL). Bantların boyutu görüntüleme yazılımı ile ölçüldü. (C) TLC plakasındaki ampisilin standart bantlarının boyutuna dayanan veri analizi ve grafik yazılımı kullanılarak bir regresyon modeli geliştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Mavi-LED aydınlatma yöntemi ile taranan aframisin içeren ince tabakalı kromatogram (TLC) plakası. (A) Metanol: Su (6: 5 v / v) TLC analizinde mobil faz olarak kullanılmış ve TLC plakası mavi-LED aydınlatıcı tarafından taranmıştır. (B) Dört aframisin standardının konsantrasyonu şunlardı: No. 1 (50 mg / mL), No. 2 (40 mg / mL), No. 3 (30 mg / mL) ve No. 4 (20 mg / mL). Bantların boyutu görüntüleme yazılımı ile ölçüldü. (C) TLC plakasındaki apramisin standart bantlarının boyutuna dayalı veri analizi ve grafik yazılımı kullanılarak bir regresyon modeli geliştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.