ATAC-seq, transkripsiyon faktörlerinin aracılık ettiği kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikleri haritalamak için hiperaktif mutant transpozaz Tn5'i kullanan bir DNA dizileme yöntemidir. ATAC-seq, kanser hücrelerinde fenotipik değişikliklerin altında yatan moleküler mekanizmaların keşfedilmesini sağlar. Bu protokol, kanser hücreleri de dahil olmak üzere epitel hücre tiplerinde ATAC-seq için optimizasyon prosedürlerini özetlemektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kanser Epigenetiği Araştırmaları için ATAC-Seq Optimizasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişimli kromatin testi, hiperaktif Tn5 transpozaz kullanılarak deoksiribonükleik asit (DNA) erişilebilirliğini araştırır. Tn5, erişilebilir kromatin bölgelerinde yüksek verimli dizileme için adaptörleri keser ve bağlar. Ökaryotik hücrelerde, genomik DNA, transkripsiyonel makineye fiziksel bir bariyer görevi gören DNA, histonlar ve diğer proteinlerden oluşan bir kompleks olan kromatine paketlenir. Dışsal sinyallere yanıt olarak, transkripsiyon faktörleri, gen aktivasyonu için transkripsiyonel makinelere erişimi sağlamak için kromatin yeniden şekillendirme komplekslerini işe alır. Bu nedenle, açık kromatin bölgelerinin tanımlanması, kanser progresyonu gibi biyolojik olaylar sırasında arttırıcı ve gen promotör aktivitelerini izlerken yararlıdır. Bu protokolün kullanımı kolay olduğundan ve düşük hücre girişi gereksinimine sahip olduğundan, ATAC-seq, kanser hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde açık kromatin bölgelerini tanımlamak için yaygın olarak benimsenmiştir. Başarılı veri toplama için, ATAC-seq kütüphaneleri hazırlanırken birkaç parametrenin dikkate alınması gerekir. Bunlar arasında, hücre lizis tamponunun seçimi, Tn5 enziminin titrasyonu ve hücrelerin başlangıç hacmi, kanser hücrelerinde ATAC-seq kütüphanesinin hazırlanması için çok önemlidir. Optimizasyon, yüksek kaliteli veriler oluşturmak için gereklidir. Burada, epitel hücre tipleri için ATAC-seq optimizasyon yöntemlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz.
Giriş
Kromatin erişilebilirliği, genom çapında bir ölçekte gen ekspresyonunun düzenlenmesi için anahtar bir gerekliliktir1. Kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikler sıklıkla kanser 2,3,4 dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarıyla ilişkilidir. Yıllar geçtikçe, araştırmacıların kromatin erişilebilirliğinin bölgelerini haritalayarak kromatin manzarasını araştırmalarını sağlamak için çok sayıda teknik geliştirilmiştir. Bunlardan bazıları DNase-seq (DNase I aşırı duyarlı bölgeler dizilimi)5, FAIRE-seq (düzenleyici elemanların form....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Deneye başlamadan önce hazırlıklar
- Lizis tampon stoğu hazırlayın.
NOT: Optimum nükleer izolasyon tamponu her hücre tipi için farklı olabilir. Hem orijinal kağıt8'de kullanılan hipotonik tamponu hem de her hücre tipi için CSK tamponu12,13'ü tripan mavisi boyama kullanarak test etmenizi öneririz.- Hipotonik tampon (Greenleaf tamponu) hazırlamak için 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 ve% 0.1 NP-40 karıştırın.
- CSK tamponu hazırlamak için 10 mM BORULAR pH 6.8, 100 mM NaCl, 300 mM sakaroz, 3 mM MgCl2 ve %0.1 T....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Başarılı ve yüksek kaliteli ATAC-seq verileri elde etmek için, deneysel koşulları optimize etmek önemlidir. ATAC-seq kütüphanesi hazırlığı beş ana adıma ayrılabilir (Şekil 1), yani hücre lizisi, tagmentasyon (Tn5 ile parçalanma ve adaptör yerleştirme), genomik DNA saflaştırma, PCR amplifikasyonu ve veri analizi. İlk işlem olarak, hücre lizisi (nükleer izolasyon) tamponu önce her hücre tipi için optimize edilmelidir. Meme kanseri hücrelerini lize etmek için orijinal ATAC-seq kağıt
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
ATAC-seq, açık ve aktif kromatin bölgelerini haritalamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kanser hücresi ilerlemesi sıklıkla genetik değişiklikler ve epigenetik yeniden programlama tarafından yönlendirilir, bu da kromatin erişilebilirliğinin ve gen ekspresyonunun değişmesine neden olur. Bu yeniden programlamanın bir örneği, tümör metastazı30 sırasında anahtar hücresel yeniden programlama süreçleri olduğu bilinen epitel-mezenkimal geçiş (EMT) ve ters süreci olan mezenkimal - epitel geçişi (MET).......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, bu makalede açıklanan araştırmalarla ilgili ilgili veya maddi finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
UND Genomics Core tesisine olağanüstü teknik yardım için minnettarız.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri [P20GM104360 - M.T., P20 GM104360 - AD] ve Kuzey Dakota Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Fakültesi, Biyomedikal Bilimler Bölümü [MT'ye] tarafından sağlanan başlangıç fonları tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 & mikro; L XL İpucuBir ipucu | USA Scientific | 1120-3810 | Filtrelenmiş ve düşük tutma |
| 100 &mikro; L XL TipOne RPT uçları | USA Scientific | 1182-1830 | Filtrelenmiş ve düşük tutma |
| 100 &mikro; L XL İpucuBir ipucu | USA Scientific | 1120-1840 | Filtrelenmiş ve düşük tutmalı. Eğimli Sınıf |
| 15 mL Konik Santrifüj Tüpleri | Corning | 352096 | |
| 20 & mikro; L TipOne RPT uçları | USA Scientific | 1183-1810 | Filtreli ve düşük tutma |
| 200 &mikro; L TipOne RPT uçları | USA Scientific | 1180-8810 | Filtreli ve düşük retansiyonlu |
| 50 mL Santrifüj Tüpleri | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agaroz | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetik Analiz Sınıfı |
| Bu çalışmada kullanılan tüm hücre hatları ATCC, | ATCC | ||
| Allegra X-30R Santrifüj | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP boncukları | Beckman Coulter | A63881 | Boncuk saflaştırma kiti |
| CellDrop Hücre Sayacı | DeNovix | CellDrop FL | Hücre sayacı |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, susuz ve ge; %99 (titrasyon) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Etanol %100 | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Susuz; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilizasyon Ürünleri |
| Fetal Sığır Serumu - TET Test Edilmiş | Ar-Ge D Sistemleri | S10350 | Üçlü 0.1 ve mikro; m filtreli |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4,5 g/L D-glikoz; [+] L-Glutamin; [-] Sodyum piruvat |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Tripsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (% 0.25), fenol kırmızısı |
| Gliserol IBI | Bilimsel | 56-81-5 | |
| Glisin | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Florometre | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Saflaştırma kiti | Qiagen | 28004 | DNA saflaştırma kiti |
| NaCl | IBI Bilimsel | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥ %98 (asidimetrik), peletler (susuz) |
| NEBNext Yüksek Sadakatli 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Örnek Hazırlama | Kiti Illumina | FC-121-1030 | 2x TD ve Tn5 Transpozaz |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | Moleküler biyoloji için | MilliporeSigma | I8896 |
| PCR Tespit Sistemi | BioRad | 1855484 | CFX384 Gerçek Zamanlı Sistem. C1000 Dokunmatik Termal Döngüleyici |
| BORULAR | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Sertifikalı, hücre kültürü için uygun |
| Qubit dsDNA HS Test kiti | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nükleik asit kantitasyon kiti |
| Quibit Test Tüpleri | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodyum Asetat | Ev | Yapımı-pH | 5.2 |
| Sükroz | IBI Bilimsel | 57-50-1 | |
| SYBR Altın | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Yeşil Supermix, 1,25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Termal Döngüleyici | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0,2 mL PCR 8 Tüplü Şeritler | USA Scientific | 1402-4700 | Esnek içermeyen, doğal, polipropilen |
| TempPlate 384 KUYULU PCR | PLAKASI ABD Scientific | 1438-4700 | Tek çentik. Doğal polipropilen |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Sınıf |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Çift İndeks Sıralama Astar Kiti | Illumina | PE-121-1003 | çift uçlu |
| Tripan Mavi Leke | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Ara-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viskoz sıvı |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | steril filtreli, BioReagent, hücre kültürü için uygun |
Kaynaklar
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
