İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve In Vitro Canlı Hücre Fagositoz Analizinden Farklılaşma

Özet

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) in vitro deney için mikroglia benzeri hücrelere farklılaşma sürecini açıklar. Ayrıca, canlı hücre görüntüleme sistemlerini kullanarak in vitro fagositoz testleri için bir substrat olarak kullanılabilecek iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan insan sinaptozomları üretmek için ayrıntılı bir prosedür de sunuyoruz.

Özet

Mikroglia, beyin mikro ortamında homeostazı koruyan ve çoklu nörolojik hastalıklarda kilit bir oyuncu haline gelen miyeloid kökenli yerleşik bağışıklık hücreleridir. İnsan mikrogliasını sağlık ve hastalıkta incelemek, insan hücrelerinin son derece sınırlı arzı nedeniyle bir meydan okumayı temsil eder. İnsan bireylerden türetilen indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) bu bariyeri aşmak için kullanılabilir. Burada, in vitro deneyler için insan iPSC'lerinin mikroglia benzeri hücrelere (iMG'ler) nasıl ayırt edileceği gösterilmiştir. Bu iMG'ler, mikroglia benzeri morfoloji, uygun belirteçlerin ekspresyonu ve aktif fagositoz dahil olmak üzere mikroglia'nın beklenen ve fizyolojik özelliklerini sergiler. Ek olarak, insan iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan (i³LMN'ler) türetilen sinaptozom substratlarının izole edilmesi ve etiketlenmesi için belgeler sağlanmaktadır. Canlı hücreli, uzunlamasına bir görüntüleme testi, pH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiş insan sinaptozomlarının yutulmasını izlemek için kullanılır ve iMG'nin fagositik kapasitesinin araştırılmasına izin verir. Burada açıklanan protokoller, insan mikroglia biyolojisini ve mikroglia'nın hastalığa katkısını araştıran farklı alanlara geniş ölçüde uygulanabilir.

Giriş

Mikroglia, merkezi sinir sistemindeki (CNS) yerleşik bağışıklık hücreleridir ve CNS'nin geliştirilmesinde çok önemli bir rol oynar. Mikroglia, yetişkin beyninde homeostazı korumak ve travma ve hastalık süreçlerine aktif olarak yanıt vermek için de önemlidir. Kümülatif kanıtlar, mikroglia'nın çoklu nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde anahtar katkıda bulunduğunu göstermektedir ^1,2. Mikroglial biyoloji hakkındaki mevcut bilgiler ağırlıklı olarak fare modellerinden türetilmiş olsa da, son çalışmalar murin ve insan mikrogliası arasındaki önemli farklılıkları aydınlatmış ve insan mikrogliasının genetiğini ve biyolojik işlevlerini incelemek için teknolojilerin geliştirilmesine duyulan ihtiyacı vurgulamıştır ^3,4. Mikroglia'nın disseke edilmiş birincil dokudan izole edilmesi, mikroglia özelliklerini ciddi şekilde değiştirebilir⁵, bu tür hücrelerle elde edilen potansiyel olarak kafa karıştırıcı sonuçlar. Bu yöntemin genel amacı, insan iPSC'lerini iMG'lere ayırt etmek, böylece bazal koşullar altında insan mikrogliasını incelemek için bir hücre kültürü sistemi sağlamaktır. Ayrıca, tamamen insan model sistemi kullanan bir fagositoz testi, hem kalite kontrol önlemi olarak hem de hastalık bağlamında iMG disfonksiyonunu değerlendirmek için iMG'lerin işlevselliğini incelemek için bir araç olarak buraya dahil edilmiştir.

Mikroglia'nın iPSC'lerden farklılaşması için çoklu protokoller son zamanlarda literatürde^{ortaya çıkmıştır} 6,7,8,9,10. Bazı protokollerin potansiyel dezavantajları arasında uzun veya uzun süreli farklılaşma, çoklu büyüme faktörlerinin eklenmesi ve / veya karmaşık deneysel prosedürler ^6,9,10 bulunmaktadır. Burada, iPSC'lerin ilkel makrofaj öncülleri (PMP'ler) olarak adlandırılan öncü hücrelere farklılaştırılması yoluyla mikroglia ontojenisinin yönlerini özetleyen "kullanıcı dostu" bir farklılaşma yöntemi ^{gösterilmiştir7,11}. PMP'ler daha önce açıklandığı gibi oluşturulur ve bazı optimizasyonlar burada^12'de sunulmuştur. PMP'ler, kan-beyin bariyeri kapanmadan önce beyni istila ederek embriyonik gelişim sırasında mikrogliaya yol açan MYB'den bağımsız yumurta sarısı kesesi kaynaklı makrofajları taklit eder¹³. PMP'leri iMG'lere ölümcül bir şekilde ayırt etmek için, Haenseler ve ark. ve Brownjohn ve ark. tarafından protokollere dayanan hızlı ve basitleştirilmiş bir monokültür yöntemi kullandık ve iMG'lerin mikroglia ile zenginleştirilmiş belirteçleri ^7,8 sağlam bir şekilde eksprese ettiği verimli bir mikroglia farklılaşma yöntemi oluşturmak için bazı değişiklikler yaptık. Bu farklılaştırma yöntemi, iPSC'lerin kültüründe uzmanlığa sahip laboratuvarlarda ve bir insan modeli sistemi kullanarak mikroglia biyolojisini incelemeyi amaçlayan araştırma hedefleriyle çoğaltılabilir.

iPSC türevi mikroglia, in vitro deneyler için biyolojik olarak ilgili bir insan mikroglia kaynağını temsil eder ve fagositoz da dahil olmak üzere mikroglial kanonik fonksiyonları araştırmak için önemli bir araçtır. Mikroglia, hücre kalıntılarını, toplanmış proteinleri ve bozulmuş miyelin^14'ü temizledikleri beyin ve CNS'nin profesyonel fagositleridir. Mikroglia ayrıca sinapsları yutarak sinaptik yeniden şekillenmede ve patojenlerin fagositozu yoluyla dış enfeksiyonlara karşı savunmada işlev görür^15,16. Bu protokolde, iMG'ler tarafından fagositoz, iMG yutulması için materyal olarak insan sinaptozomları kullanılarak değerlendirilir. Bu amaçla, insan i³LMN'lerinden türetilen sinaptozomları izole etmek için bir açıklama açıklanmaktadır. i³LMN türevi insan sinaptozomları, fagozom işleme ve in vitro bozunma sırasında asidik bölmeler içinde lokalize sinaptozomların miktarının belirlenmesine izin veren pH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiştir. Canlı hücre mikroskobu kullanan bir fagositoz testi, mikroglia yutulmasının dinamik sürecini gerçek zamanlı olarak izlemek için gösterilmiştir. Bu fonksiyonel tahlil, tam bir insan sistemi kullanarak sağlık ve hastalıkta mikroglial fagositozdaki olası kusurları araştırmak için bir temel oluşturur.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler steril olmalı ve tüm adımlar steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Tüm iPSC hatlarının yanı sıra bakım ve farklılaştırma ortamları Malzeme Tablosunda açıklanmıştır. Aşağıda gösterilen mikroglia farklılaştırma yöntemi, burada açıklanan yeni değişikliklerle daha önce yayınlanmış^{protokoller 7,8,12'ye} dayanmaktadır.

1. Mikroglia farklılaşması

NOT: Protokole genel bir bakış Şekil 1'de özetlenmiştir.

1. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kültürü
   NOT: iPSC kültür tekniklerini açıklayan daha fazla ayrıntı başka bir yerde bulunabilir¹⁷.
   1. Çözme ve bakım
      1. iPSC ortamını hazırlayın, ortamı aliquot edin ve -20 ° C'de 6 aya kadar saklayın. Alikotları gece boyunca 4 ° C'de çözün ve 1 haftaya kadar kullanın. Kullanmadan önce ortamı ortam sıcaklığında en az 1 saat bekletin.
      2. 6 delikli bir plakanın kuyularını, kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS'de seyreltilmiş 1 mL'lik 10 μg / mL laminin 521 ekleyerek kaplayın¹⁸. Plakaları bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de en az 2 saat veya tercihen bir gece boyunca saklayın. Seyreltildikten sonra, laminini 3 ay boyunca 4 ° C'de saklayın.
      3. Steril suda seyrelterek 10 mM Rho kinaz inhibitörü Y27632 (ROCK İnhibitörü) stok çözeltisi hazırlayın. ROCK inhibitörü çözeltisinin tek kullanımlık alikotlarını yapın ve bunları 1 yıla kadar -20 ° C'de saklayın.
      4. DPBS'de 0,5 M EDTA'nın stok çözeltisini seyrelterek 0,5 mM EDTA hazırlayın.
      5. Dondurulmuş iPSC'lerin bir şişesini eritmek için, şişeyi çoğunlukla çözülene kadar 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin. Şişenin içeriğini derhal 4 mL iPSC ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 1 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj.
      6. Süpernatantı aspire edin ve kolonilerin bozulmasını önlemek için tüpün duvarına yavaşça 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1 mL iPSC ortamı ekleyerek hücreleri yeniden askıya alın.
      7. Kaplanmış kuyucukların her birine 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1,5 mL iPSC ortamı ekleyin ve yeniden askıya alınan kolonileri damla damla ortamı içeren kuyucuklara aktarın.
         NOT: Kültür bakımı için adım 1.1.1.6'dan 5-7 damla kullanın, ancak her iPSC hattı için optimum tohumlama yoğunluğunu ayarlayın.
      8. Plakayı yan yana ve arkadan öne doğru manuel olarak karıştırarak kuyucuklardaki hücreleri eşit olarak dağıtın. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, ROCK inhibitörü olmadan taze iPSC ortamı ekleyerek ortamı tamamen değiştirin.
      9. Bakım için, hücreler% 80 akıcılığa ulaşana kadar ortamı her gün değiştirin.
         NOT: Kullanılan iPSC ortamı esnek bir besleme programına izin veriyorsa, hücreler ortamı değiştirmeden 2 gün boyunca muhafaza edilebilir. Bunu geçiş başına bir kez ile sınırlamanız ve yalnızca hücrelerin% 50'den az birleşik olması durumunda tavsiye edilir.
   2. Bölme
      1. Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL DPBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan) ile yıkayın.
      2. Hücreleri yerinden çıkarmak için, 1 mL 0.5 mM EDTA ekleyin ve hücre kolonilerinin kenarları kuyunun yüzeyinden kalkıncaya kadar oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin. Hücreleri DPBS ile tekrar yıkayın ve 1 mL iPSC ortamı ekleyin.
      3. Hücre kolonilerini, bir hücre kaldırıcı kullanarak hafifçe kazıyarak ayırın. Kolonileri rahatsız etmemek için kuyunun her alanını sadece bir kez kazıyın.
         NOT: Kolonileri kuyudan çıkarmak için alternatif yöntemler başka bir yerde bulunabilir¹⁷.
      4. 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak hücreleri toplayın ve 1,5 mL iPSC ortamı içeren önceden kaplanmış kuyucuklara (adım 1.1.1.2'de belirtildiği gibi) 1:6 oranında (hücrelerden ortama) damla damla aktarın.
2. Mikroglia benzeri hücrelere (iMG'ler) iPSC farklılaşması
   NOT: Küçük moleküller ve büyüme faktörleri, DPBS'de steril filtrelenmiş% 0.1 sığır serum albümininde, nihai konsantrasyondan 1.000 kat daha yüksek bir stok konsantrasyonuna çözülür. Erken geçişlerde iPSC'leri iMG'lere ayırmanız önerilir. iPSC hatlarının rutin karyotiplemesi önerilir.
   1. Standart kaplama çözümü hazırlayın
      1. Hücre dışı matris kaplama reaktifinin stok çözeltisini gece boyunca 4 °C'de buz üzerinde çözün.
      2. Mikrosantrifüj tüplerini ve filtre pipet uçlarını 4 °C'de önceden soğutun.
      3. Aliquot 250 μL konsantre hücre dışı matris kaplama reaktifi her tüpün içine yerleştirilir ve hemen buzun üzerine yerleştirilir. Alikotları -20 ° C'de saklayın.
      4. Kaplama çözeltisini hazırlamak için, hücre dışı matris kaplama reaktiflerinden birini gece boyunca 4 ° C'de buz üzerinde çözün.
      5. İnsan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (DMEM-F12 olarak adlandırılır) büyümesi için optimize edilmiş 50 mL buz gibi soğuk DMEM-F12'yi önceden soğutulmuş bir konik tüpe ekleyin ve buz üzerinde tutun.
      6. Buz gibi soğuk DMEM-F12'yi birden çok kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 1 mL'lik bir pipet ucunu soğutun ve ardından hücre dışı matris kaplama reaktifinin 250 μL'sini DMEM-F12 ortamını içeren konik tüpe aktarmak için hemen pipet ucunu kullanın.
         NOT: Standart kaplama çözeltisi 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.
   2. Embriyoid cisim (EB) oluşumu
      1. 4 °C'de 4 güne kadar muhafaza edilebilen EB ortamını hazırlayın.
      3. 
         
      4. 
         
   3. 3. 
         
      5. 
         
      6. 
         
      7. 
         
      8. 
         
   4. 2. 
         
      3. 
         

1. 
   
   1. 
      
   5. 
      
   14. 
       
   23. 
       
2. 
   
   3. 
      
   4. 
      
   5. 
      
3. 4. 
      
4. 4. 
      
   5. 3. 
         
      8. 
         

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak iMG'ler oluşturmak için, iyi tanımlanmış kenarlara sahip kompakt koloni morfolojisi gösteren farklılaşmamış iPSC'lerle başlamak önemlidir (Şekil 2A). EB oluşum bölümünde açıklandığı gibi tutulan ayrışmış iPSC'ler, farklılaşmanın 4. gününe kadar boyut olarak büyüyecek olan EB'ler olarak adlandırılan küresel agregalar oluşturacaktır (Şekil 2B). EB'ler PMP üretimi için uygun koşullarda toplandıktan ve kaplandıktan sonra, Matrigel kaplı plaka...

Tartışma

Burada açıklanan farklılaşma protokolü, iPSC türevli mikroglia benzeri hücreleri ~ 6-8 hafta içinde yüksek saflıkta ve immünofloresan deneyleri ve daha fazla sayıda hücre gerektiren diğer tahlilleri gerçekleştirmek için yeterli verimde elde etmek için etkili bir yöntem sağlar. Bu protokol, 1 haftada 1 × 10⁶ iMG'ye kadar verim vermiştir, bu da protein ve RNA ekstraksiyonuna ve karşılık gelen aşağı akış analizlerine (örneğin, RNASeq, qRT-PCR, batı lekesi, kütle spektrometrisi) izin verir. Bununla birlikte, bu pr...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
< güçlü > immünofloresan analizi için antikorlar< / güçlü >
anti-IBA1 tavşan antikoru	Wako Chemical USA	NC9288364	1:350 seyreltme
anti-P2RY12 tavşan antikoru	Sigma-Aldrich	HPA014518	1:50 seyreltme
anti-TMEM119 tavşan antikoru	Sigma-Aldrich	HPA051870	1:100 seyreltme
Western blot analizi için antikorlar< / güçlü >
anti-β -Tubulin tavşan antikoru	Abcam	ab6046	1:500 seyreltme
anti-Sinaptofizin (SYP) tavşan antikoru	Abclonal	A6344	1: 1.000 seyreltme
anti-PSD95 fare antikoru	Milipore	MAB1596	1:500 seyreltme
Borat tamponu bileşenler< / güçlü >
borik asit (100 mM)	Sigma	B6768
Sodyum bikarbonat (NaHCO< alt > 3 < / alt >) BioXtra	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodyum klorür (75 mM)	Sigma	S7653
Sodyum tetraborat (25 mM)	Sigma	221732
Hücre kültürü malzemeleri< / güçlü>
6 kuyucuklu plakalar	Greiner Bio-One	657160
40 &; m Hücre Süzgeçleri	Falcon	352340
100 mm x 20 mm Doku Kültürü İşlem Görmüş	CELLTREAT	229620
Hücre Kaldırıcı, Çift Uçlu, Düz Bıçaklı & Dar Bıçak, Steril	CELLTREAT	229305
Düşük Yapışma Yuvarlak Tabanlı 96 Kuyulu Plaka	Corning	7007
Primaria 24 Kuyulu Düz Alt Yüzey Modifiye Çok Kuyulu Hücre Kültürü Plakası	Corning	353847,
Primaria 6 Kuyulu Hücre Şeffaf Düz Tabanlı Yüzey Modifiye Çok Kuyulu Kültür Plakası	Corning	353846
Primaria 96 Kuyulu Şeffaf Düz Alt Mikroplaka	Corning	353872
Hücre ayrışma reaktifleri< / güçlü>
Accutase	Alt	motor nöron farklılaşması için kullanılan	Corning 25058CI
reaktifleri TrypLE reaktifi	Life Technologies	12-605-010	mikroglia farklılaşması için kullanılan ayrışma reaktifleri
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
Hücre kültürü için kaplama reaktifleri< / güçlü>
Matrigel GFR Membran Matris	Corning & Trade;	354230	Hücre dışı matris kaplama reaktifi olarak adlandırılır
CellStick Laminin-521	STEMCELL Teknolojisi	77004	Laminin olarak anılır 521
Poli-D-Lizin	Sigma	P7405	Sigma'da 0.1 mg / mL'ye sulandırılır
		; P3655	Borat tamponunda 1 mg / mL'ye sulandırılır
<>iPSC ortamının bileşenleri< / em>< / güçlü>
nbsp; mTeSR Plus Kiti	STEMCELL Teknolojisi	100-0276	><>
<>>
BMP-4	Fisher Scientific	PHC9534	hazırlamak için son konsantrasyon 50 ng/mL
iPSC media			final konsantrasyonu 1x
ROCK inhibitörü Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	son konsantrasyon 10 & mikro; M
SCF	PeproTech	300-07	nihai konsantrasyon 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	nihai konsantrasyon 50 ng/mL
PMP baz ortamının bileşenleri
GlutaMAX	Gibco	35050061	son konsantrasyon 1x
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)	Gibco	15140122	nihai konsantrasyon 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	nihai konsantrasyon 1x
PMP tam ortam bileşenleri
55 mM 2-merkaptoetanol	Gibco	21985023	nihai konsantrasyon 55 &mikro; M
IL-3	PeproTech	200-03	nihai konsantrasyon 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	nihai konsantrasyon 100 ng/mL
PMP baz ortamı<>			son konsantrasyon 1x
iMG temel ortamının bileşenleri
Gelişmiş DMEM/F12	Gibco	12634010	son konsantrasyon 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	son konsantrasyon 1x
N2 takviyesi, 100x	Gibco	17502-048	son konsantrasyon 1x
Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL)	Gibco	15140122	son konsantrasyon 100 U / mL
< güçlü > iMG tam ortamının bileşenleri< / em>< / güçlü>
55 mM 2-merkaptoetanol	Gibco	21985023	nihai konsantrasyon 55 & mikro; M
IL-34	PeproTech veya Biologend	200-34 veya 577904	nihai konsantrasyon 100 ng/mL
iMG baz ortam			final konsantrasyonu 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	nihai konsantrasyon 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	nihai konsantrasyon 50 ng/mL
< güçlü > İndüksiyon baz ortamının bileşenleri< / güçlü >< / em >
son	Gibco	ile 11330032	son konsantrasyon 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	son konsantrasyon 1x
N2 takviyesi, 100x	Gibco	17502-048	final konsantrasyon 1x
Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 100x	Gibco	11140050	son konsantrasyon 1x
< güçlü > Komple indüksiyon ortamının bileşenleri< / güçlü>< / em >
Bileşik E	Calbiochem	565790	nihai konsantrasyon 0.2 & mu; M ve stok reaktifini 1: 1 etanol ve DMSO
Doksisiklin	Sigma	D9891	nihai konsantrasyon 2 & mu içinde 2 mM'ye yeniden oluşturun; g/mL ve DPBS İndüksiyon baz ortamında stok reaktifini 2 mg resulandırın
< / em >			son konsantrasyon 1x
ROCK inhibitörü Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	son konsantrasyon 10 & mu; M
Nöron ortamının bileşenleri
B-27 Plus Nöronal Kültür Sistemi	Gibco	A3653401	son konsantrasyonu ortam ve destek için 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	son konsantrasyon 1x
N2 takviyesi, 100x	Gibco	17502-048	son konsantrasyon 1x
Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 100x	Gibco	11140050	nihai konsantrasyon Bu
çalışmada kullanılan 1xiPSC hatları
KOLF2.1J: WT klonu B03	Jackson Laboratuvarları
WTC11 hNIL	Ulusal Sağlık
Sinapttozom izolasyon reaktifleri
BCA Protein Test Kiti	Thermo Scientific Pierce	23227
dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma	D2650
Syn-PER Sinaptik Protein Ekstraksiyon Reaktifi	Thermo Scientific	87793	Sinaptozomların izolasyonu için hücre lizis reaktifine atıfta bulunulur
Fagositoz tahlil boyaları< / güçlü>
NucBlue Live Ready reaktifi	Invitrogen	R37605
pHrodo Kırmızısı, süksinimidil ester	ThermoFisher Scientific	P36600	pH'a duyarlı boya
< güçlü > diğer hücre kültürü reaktifleri< / güçlü >
Tripan Mavisi,% 0.4 Çözelti	olarak adlandırılır AMRESCO INC	K940-100ML
Sığır serum albümini (BSA)	Sigma	22144-77-0
BrdU	Sigma	B9285	steril suda 40 mM'ye sulandırılır
Cytochalasin D	Sigma		nihai konsantrasyon 10 & mikro;
Kalsiyum ve magnezyum ile M DPBS	Corning	21-030-CV
Kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS	Corning	21-031-CV	DPBS Nakavt olarak anılır
DMEM / F-12	Gibco	12660012	İnsan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin büyümesi için optimize edilmiş DMEM-F12 olarak adlandırılır
Laminin Fare Proteini, Doğal	Gibco	23017015	Laminin
< güçlü > Yazılım ve Ekipman< / güçlü >
Santrifüj	olarak adlandırılır Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 canlı hücre görüntüleme okuyucu	Biotek
Gen5 Mikroplaka Okuyucu ve Görüntüleyici Yazılımı	Biotek	sürüm 3.03
Multi-Therm Heat-Shake	Benchmark		tüp çalkalayıcı olarak bakın
Su sonikatörü	Elma	Modu Transsonic 310