Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) in vitro deney için mikroglia benzeri hücrelere farklılaşma sürecini açıklar. Ayrıca, canlı hücre görüntüleme sistemlerini kullanarak in vitro fagositoz testleri için bir substrat olarak kullanılabilecek iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan insan sinaptozomları üretmek için ayrıntılı bir prosedür de sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve In Vitro Canlı Hücre Fagositoz Analizinden Farklılaşma
Bu makalede
Özet
Özet
Mikroglia, beyin mikro ortamında homeostazı koruyan ve çoklu nörolojik hastalıklarda kilit bir oyuncu haline gelen miyeloid kökenli yerleşik bağışıklık hücreleridir. İnsan mikrogliasını sağlık ve hastalıkta incelemek, insan hücrelerinin son derece sınırlı arzı nedeniyle bir meydan okumayı temsil eder. İnsan bireylerden türetilen indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) bu bariyeri aşmak için kullanılabilir. Burada, in vitro deneyler için insan iPSC'lerinin mikroglia benzeri hücrelere (iMG'ler) nasıl ayırt edileceği gösterilmiştir. Bu iMG'ler, mikroglia benzeri morfoloji, uygun belirteçlerin ekspresyonu ve aktif fagositoz dahil olmak üzere mikroglia'nın beklenen ve fizyolojik özelliklerini sergiler. Ek olarak, insan iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan (i3LMN'ler) türetilen sinaptozom substratlarının izole edilmesi ve etiketlenmesi için belgeler sağlanmaktadır. Canlı hücreli, uzunlamasına bir görüntüleme testi, pH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiş insan sinaptozomlarının yutulmasını izlemek için kullanılır ve iMG'nin fagositik kapasitesinin araştırılmasına izin verir. Burada açıklanan protokoller, insan mikroglia biyolojisini ve mikroglia'nın hastalığa katkısını araştıran farklı alanlara geniş ölçüde uygulanabilir.
Giriş
Mikroglia, merkezi sinir sistemindeki (CNS) yerleşik bağışıklık hücreleridir ve CNS'nin geliştirilmesinde çok önemli bir rol oynar. Mikroglia, yetişkin beyninde homeostazı korumak ve travma ve hastalık süreçlerine aktif olarak yanıt vermek için de önemlidir. Kümülatif kanıtlar, mikroglia'nın çoklu nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde anahtar katkıda bulunduğunu göstermektedir 1,2. Mikroglial biyoloji hakkındaki mevcut bilgiler ağırlıklı olarak fare modellerinden türetilmiş olsa da, son çalışmalar murin ve insan mikrogliası arasındaki önemli farklılıkları aydınlatmış ve insan mikrogliasının genetiğini ve biyolojik işlevlerini incelemek için teknolojilerin geliştirilmesine duyulan ihtiyacı vurgulamıştır 3,4. Mikroglia'nın disseke edilmiş birincil dokudan izole edilmesi, mikroglia özelliklerini ciddi şekilde değiştirebilir5, bu tür hücrelerle elde edilen potansiyel olarak kafa karıştırıcı sonuçlar. Bu yöntemin genel amacı, insan iPSC'lerini iMG'lere ayırt etmek, böylece bazal koşullar altında insan mikrogliasını incelemek için bir hücre kültürü sistemi sağlamaktır. Ayrıca, tamamen insan model sistemi kullanan bir fagositoz testi, hem kalite kontrol önlemi olarak hem de hastalık bağlamında iMG disfonksiyonunu değerlendirmek için iMG'lerin işlevselliğini incelemek için bir araç olarak buraya dahil edilmiştir.
Mikroglia'nın iPSC'lerden farklılaşması için çoklu protokoller son zamanlarda literatürdeortaya çıkmıştır 6,7,8,9,10. Bazı protokollerin potansiyel dezavantajları arasında uzun veya uzun süreli farklılaşma, çoklu büyüme faktörlerinin eklenmesi ve / veya karmaşık deneysel prosedürler 6,9,10 bulunmaktadır. Burada, iPSC'lerin ilkel makrofaj öncülleri (PMP'ler) olarak adlandırılan öncü hücrelere farklılaştırılması yoluyla mikroglia ontojenisinin yönlerini özetleyen "kullanıcı dostu" bir farklılaşma yöntemi gösterilmiştir7,11. PMP'ler daha önce açıklandığı gibi oluşturulur ve bazı optimizasyonlar burada12'de sunulmuştur. PMP'ler, kan-beyin bariyeri kapanmadan önce beyni istila ederek embriyonik gelişim sırasında mikrogliaya yol açan MYB'den bağımsız yumurta sarısı kesesi kaynaklı makrofajları taklit eder13. PMP'leri iMG'lere ölümcül bir şekilde ayırt etmek için, Haenseler ve ark. ve Brownjohn ve ark. tarafından protokollere dayanan hızlı ve basitleştirilmiş bir monokültür yöntemi kullandık ve iMG'lerin mikroglia ile zenginleştirilmiş belirteçleri 7,8 sağlam bir şekilde eksprese ettiği verimli bir mikroglia farklılaşma yöntemi oluşturmak için bazı değişiklikler yaptık. Bu farklılaştırma yöntemi, iPSC'lerin kültüründe uzmanlığa sahip laboratuvarlarda ve bir insan modeli sistemi kullanarak mikroglia biyolojisini incelemeyi amaçlayan araştırma hedefleriyle çoğaltılabilir.
iPSC türevi mikroglia, in vitro deneyler için biyolojik olarak ilgili bir insan mikroglia kaynağını temsil eder ve fagositoz da dahil olmak üzere mikroglial kanonik fonksiyonları araştırmak için önemli bir araçtır. Mikroglia, hücre kalıntılarını, toplanmış proteinleri ve bozulmuş miyelin14'ü temizledikleri beyin ve CNS'nin profesyonel fagositleridir. Mikroglia ayrıca sinapsları yutarak sinaptik yeniden şekillenmede ve patojenlerin fagositozu yoluyla dış enfeksiyonlara karşı savunmada işlev görür15,16. Bu protokolde, iMG'ler tarafından fagositoz, iMG yutulması için materyal olarak insan sinaptozomları kullanılarak değerlendirilir. Bu amaçla, insan i3LMN'lerinden türetilen sinaptozomları izole etmek için bir açıklama açıklanmaktadır. i3LMN türevi insan sinaptozomları, fagozom işleme ve in vitro bozunma sırasında asidik bölmeler içinde lokalize sinaptozomların miktarının belirlenmesine izin veren pH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiştir. Canlı hücre mikroskobu kullanan bir fagositoz testi, mikroglia yutulmasının dinamik sürecini gerçek zamanlı olarak izlemek için gösterilmiştir. Bu fonksiyonel tahlil, tam bir insan sistemi kullanarak sağlık ve hastalıkta mikroglial fagositozdaki olası kusurları araştırmak için bir temel oluşturur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler steril olmalı ve tüm adımlar steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Tüm iPSC hatlarının yanı sıra bakım ve farklılaştırma ortamları Malzeme Tablosunda açıklanmıştır. Aşağıda gösterilen mikroglia farklılaştırma yöntemi, burada açıklanan yeni değişikliklerle daha önce yayınlanmışprotokoller 7,8,12'ye dayanmaktadır.
1. Mikroglia farklılaşması
NOT: Protokole genel bir bakış Şekil 1'de özetlenmiştir.
- İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kültürü
NOT: iPSC kültür tekniklerini açıklayan daha fazla ayrıntı başka bir yerde bulunabilir17.- Çözme ve bakım
- iPSC ortamını hazırlayın, ortamı aliquot edin ve -20 ° C'de 6 aya kadar saklayın. Alikotları gece boyunca 4 ° C'de çözün ve 1 haftaya kadar kullanın. Kullanmadan önce ortamı ortam sıcaklığında en az 1 saat bekletin.
- 6 delikli bir plakanın kuyularını, kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS'de seyreltilmiş 1 mL'lik 10 μg / mL laminin 521 ekleyerek kaplayın18. Plakaları bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de en az 2 saat veya tercihen bir gece boyunca saklayın. Seyreltildikten sonra, laminini 3 ay boyunca 4 ° C'de saklayın.
- Steril suda seyrelterek 10 mM Rho kinaz inhibitörü Y27632 (ROCK İnhibitörü) stok çözeltisi hazırlayın. ROCK inhibitörü çözeltisinin tek kullanımlık alikotlarını yapın ve bunları 1 yıla kadar -20 ° C'de saklayın.
- DPBS'de 0,5 M EDTA'nın stok çözeltisini seyrelterek 0,5 mM EDTA hazırlayın.
- Dondurulmuş iPSC'lerin bir şişesini eritmek için, şişeyi çoğunlukla çözülene kadar 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin. Şişenin içeriğini derhal 4 mL iPSC ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 1 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj.
- Süpernatantı aspire edin ve kolonilerin bozulmasını önlemek için tüpün duvarına yavaşça 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1 mL iPSC ortamı ekleyerek hücreleri yeniden askıya alın.
- Kaplanmış kuyucukların her birine 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1,5 mL iPSC ortamı ekleyin ve yeniden askıya alınan kolonileri damla damla ortamı içeren kuyucuklara aktarın.
NOT: Kültür bakımı için adım 1.1.1.6'dan 5-7 damla kullanın, ancak her iPSC hattı için optimum tohumlama yoğunluğunu ayarlayın. - Plakayı yan yana ve arkadan öne doğru manuel olarak karıştırarak kuyucuklardaki hücreleri eşit olarak dağıtın. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, ROCK inhibitörü olmadan taze iPSC ortamı ekleyerek ortamı tamamen değiştirin.
- Bakım için, hücreler% 80 akıcılığa ulaşana kadar ortamı her gün değiştirin.
NOT: Kullanılan iPSC ortamı esnek bir besleme programına izin veriyorsa, hücreler ortamı değiştirmeden 2 gün boyunca muhafaza edilebilir. Bunu geçiş başına bir kez ile sınırlamanız ve yalnızca hücrelerin% 50'den az birleşik olması durumunda tavsiye edilir.
- Bölme
- Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL DPBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan) ile yıkayın.
- Hücreleri yerinden çıkarmak için, 1 mL 0.5 mM EDTA ekleyin ve hücre kolonilerinin kenarları kuyunun yüzeyinden kalkıncaya kadar oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin. Hücreleri DPBS ile tekrar yıkayın ve 1 mL iPSC ortamı ekleyin.
- Hücre kolonilerini, bir hücre kaldırıcı kullanarak hafifçe kazıyarak ayırın. Kolonileri rahatsız etmemek için kuyunun her alanını sadece bir kez kazıyın.
NOT: Kolonileri kuyudan çıkarmak için alternatif yöntemler başka bir yerde bulunabilir17. - 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak hücreleri toplayın ve 1,5 mL iPSC ortamı içeren önceden kaplanmış kuyucuklara (adım 1.1.1.2'de belirtildiği gibi) 1:6 oranında (hücrelerden ortama) damla damla aktarın.
- Çözme ve bakım
- Mikroglia benzeri hücrelere (iMG'ler) iPSC farklılaşması
NOT: Küçük moleküller ve büyüme faktörleri, DPBS'de steril filtrelenmiş% 0.1 sığır serum albümininde, nihai konsantrasyondan 1.000 kat daha yüksek bir stok konsantrasyonuna çözülür. Erken geçişlerde iPSC'leri iMG'lere ayırmanız önerilir. iPSC hatlarının rutin karyotiplemesi önerilir.- Standart kaplama çözümü hazırlayın
- Hücre dışı matris kaplama reaktifinin stok çözeltisini gece boyunca 4 °C'de buz üzerinde çözün.
- Mikrosantrifüj tüplerini ve filtre pipet uçlarını 4 °C'de önceden soğutun.
- Aliquot 250 μL konsantre hücre dışı matris kaplama reaktifi her tüpün içine yerleştirilir ve hemen buzun üzerine yerleştirilir. Alikotları -20 ° C'de saklayın.
- Kaplama çözeltisini hazırlamak için, hücre dışı matris kaplama reaktiflerinden birini gece boyunca 4 ° C'de buz üzerinde çözün.
- İnsan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (DMEM-F12 olarak adlandırılır) büyümesi için optimize edilmiş 50 mL buz gibi soğuk DMEM-F12'yi önceden soğutulmuş bir konik tüpe ekleyin ve buz üzerinde tutun.
- Buz gibi soğuk DMEM-F12'yi birden çok kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 1 mL'lik bir pipet ucunu soğutun ve ardından hücre dışı matris kaplama reaktifinin 250 μL'sini DMEM-F12 ortamını içeren konik tüpe aktarmak için hemen pipet ucunu kullanın.
NOT: Standart kaplama çözeltisi 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.
- Embriyoid cisim (EB) oluşumu
- 4 °C'de 4 güne kadar muhafaza edilebilen EB ortamını hazırlayın.
- Standart kaplama çözümü hazırlayın
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolü kullanarak iMG'ler oluşturmak için, iyi tanımlanmış kenarlara sahip kompakt koloni morfolojisi gösteren farklılaşmamış iPSC'lerle başlamak önemlidir (Şekil 2A). EB oluşum bölümünde açıklandığı gibi tutulan ayrışmış iPSC'ler, farklılaşmanın 4. gününe kadar boyut olarak büyüyecek olan EB'ler olarak adlandırılan küresel agregalar oluşturacaktır (Şekil 2B). EB'ler PMP üretimi için uygun koşullarda toplandıktan ve kaplandıktan sonra, Matrigel kaplı plaka...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan farklılaşma protokolü, iPSC türevli mikroglia benzeri hücreleri ~ 6-8 hafta içinde yüksek saflıkta ve immünofloresan deneyleri ve daha fazla sayıda hücre gerektiren diğer tahlilleri gerçekleştirmek için yeterli verimde elde etmek için etkili bir yöntem sağlar. Bu protokol, 1 haftada 1 × 106 iMG'ye kadar verim vermiştir, bu da protein ve RNA ekstraksiyonuna ve karşılık gelen aşağı akış analizlerine (örneğin, RNASeq, qRT-PCR, batı lekesi, kütle spektrometrisi) izin verir. Bununla birlikte, bu pr...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, motor nöron farklılaşması için WTC11 hNIL iPSC hattını sağladığı için Michael Ward'a ve mikroglia farklılaşması için kullanılan KOLF2.1J WT klonu B03 iPSC hattını tedarik ettiği için Jackson Laboratuvarlarına teşekkür eder. Ayrıca, protokollerin uygulanması sırasındaki desteği için Dorothy Schafer'e, canlı hücre görüntüleme sistemine yardımları için Anthony Giampetruzzi ve John Landers'a, revizyonlar sırasındaki teknik katkıları için Hayden Gadd'e ve bu çalışmadaki işbirliği için Jonathan Jung'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, UMASS Chan Tıp Fakültesi'nden Dan ve Diane Riccio Sinirbilim Fonu ve Angel Fund, Inc. tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| < güçlü > immünofloresan analizi için antikorlar< / güçlü > | |||
| anti-IBA1 tavşan antikoru | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 seyreltme |
| anti-P2RY12 tavşan antikoru | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 seyreltme |
| anti-TMEM119 tavşan antikoru | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 seyreltme |
| Western blot analizi için antikorlar< / güçlü > | |||
| anti-β -Tubulin tavşan antikoru | Abcam | ab6046 | 1:500 seyreltme |
| anti-Sinaptofizin (SYP) tavşan antikoru | Abclonal | A6344 | 1: 1.000 seyreltme |
| anti-PSD95 fare antikoru | Milipore | MAB1596 | 1:500 seyreltme |
| Borat tamponu bileşenler< / güçlü > | |||
| borik asit (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodyum bikarbonat (NaHCO< alt > 3 < / alt >) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodyum klorür (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodyum tetraborat (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Hücre kültürü malzemeleri< / güçlü> | |||
| 6 kuyucuklu plakalar | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 &; m Hücre Süzgeçleri | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Doku Kültürü İşlem Görmüş | CELLTREAT | 229620 | |
| Hücre Kaldırıcı, Çift Uçlu, Düz Bıçaklı & Dar Bıçak, Steril | CELLTREAT | 229305 | |
| Düşük Yapışma Yuvarlak Tabanlı 96 Kuyulu Plaka | Corning | 7007 | |
| Primaria 24 Kuyulu Düz Alt Yüzey Modifiye Çok Kuyulu Hücre Kültürü Plakası | Corning | 353847, | |
| Primaria 6 Kuyulu Hücre Şeffaf Düz Tabanlı Yüzey Modifiye Çok Kuyulu Kültür Plakası | Corning | 353846 | |
| Primaria 96 Kuyulu Şeffaf Düz Alt Mikroplaka | Corning | 353872 | |
| Hücre ayrışma reaktifleri< / güçlü> | |||
| Accutase | Alt | motor nöron farklılaşması için kullanılan | Corning 25058CI |
| reaktifleri TrypLE reaktifi | Life Technologies | 12-605-010 | mikroglia farklılaşması için kullanılan ayrışma reaktifleri |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Hücre kültürü için kaplama reaktifleri< / güçlü> | |||
| Matrigel GFR Membran Matris | Corning & Trade; | 354230 | Hücre dışı matris kaplama reaktifi olarak adlandırılır |
| CellStick Laminin-521 | STEMCELL Teknolojisi | 77004 | Laminin olarak anılır 521 |
| Poli-D-Lizin | Sigma | P7405 | Sigma'da 0.1 mg / mL'ye sulandırılır |
| ; P3655 | Borat tamponunda 1 mg / mL'ye sulandırılır | ||
| <>iPSC ortamının bileşenleri< / em>< / güçlü> | |||
| nbsp; mTeSR Plus Kiti | STEMCELL Teknolojisi | 100-0276 | ><> |
| <>> | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | hazırlamak için son konsantrasyon 50 ng/mL |
| iPSC media | final konsantrasyonu 1x | ||
| ROCK inhibitörü Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | son konsantrasyon 10 & mikro; M |
| SCF | PeproTech | 300-07 | nihai konsantrasyon 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | nihai konsantrasyon 50 ng/mL |
| PMP baz ortamının bileşenleri | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | son konsantrasyon 1x |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | nihai konsantrasyon 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | nihai konsantrasyon 1x |
| PMP tam ortam bileşenleri | |||
| 55 mM 2-merkaptoetanol | Gibco | 21985023 | nihai konsantrasyon 55 &mikro; M |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | nihai konsantrasyon 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | nihai konsantrasyon 100 ng/mL |
| PMP baz ortamı<> | son konsantrasyon 1x | ||
| iMG temel ortamının bileşenleri | |||
| Gelişmiş DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | son konsantrasyon 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | son konsantrasyon 1x |
| N2 takviyesi, 100x | Gibco | 17502-048 | son konsantrasyon 1x |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL) | Gibco | 15140122 | son konsantrasyon 100 U / mL |
| < güçlü > iMG tam ortamının bileşenleri< / em>< / güçlü> | |||
| 55 mM 2-merkaptoetanol | Gibco | 21985023 | nihai konsantrasyon 55 & mikro; M |
| IL-34 | PeproTech veya Biologend | 200-34 veya 577904 | nihai konsantrasyon 100 ng/mL |
| iMG baz ortam | final konsantrasyonu 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | nihai konsantrasyon 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | nihai konsantrasyon 50 ng/mL |
| < güçlü > İndüksiyon baz ortamının bileşenleri< / güçlü >< / em > | |||
| son | Gibco | ile 11330032 | son konsantrasyon 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | son konsantrasyon 1x |
| N2 takviyesi, 100x | Gibco | 17502-048 | final konsantrasyon 1x |
| Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | son konsantrasyon 1x |
| < güçlü > Komple indüksiyon ortamının bileşenleri< / güçlü>< / em > | |||
| Bileşik E | Calbiochem | 565790 | nihai konsantrasyon 0.2 & mu; M ve stok reaktifini 1: 1 etanol ve DMSO |
| Doksisiklin | Sigma | D9891 | nihai konsantrasyon 2 & mu içinde 2 mM'ye yeniden oluşturun; g/mL ve DPBS İndüksiyon baz ortamında stok reaktifini 2 mg resulandırın |
| < / em > | son konsantrasyon 1x | ||
| ROCK inhibitörü Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | son konsantrasyon 10 & mu; M |
| Nöron ortamının bileşenleri | |||
| B-27 Plus Nöronal Kültür Sistemi | Gibco | A3653401 | son konsantrasyonu ortam ve destek için 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | son konsantrasyon 1x |
| N2 takviyesi, 100x | Gibco | 17502-048 | son konsantrasyon 1x |
| Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | nihai konsantrasyon Bu |
| çalışmada kullanılan 1xiPSC hatları | |||
| KOLF2.1J: WT klonu B03 | Jackson Laboratuvarları | ||
| WTC11 hNIL | Ulusal Sağlık | ||
| Sinapttozom izolasyon reaktifleri | |||
| BCA Protein Test Kiti | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Sinaptik Protein Ekstraksiyon Reaktifi | Thermo Scientific | 87793 | Sinaptozomların izolasyonu için hücre lizis reaktifine atıfta bulunulur |
| Fagositoz tahlil boyaları< / güçlü> | |||
| NucBlue Live Ready reaktifi | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Kırmızısı, süksinimidil ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | pH'a duyarlı boya |
| < güçlü > diğer hücre kültürü reaktifleri< / güçlü > | |||
| Tripan Mavisi,% 0.4 Çözelti | olarak adlandırılır AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Sığır serum albümini (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | steril suda 40 mM'ye sulandırılır |
| Cytochalasin D | Sigma | nihai konsantrasyon 10 & mikro; | |
| Kalsiyum ve magnezyum ile M DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS | Corning | 21-031-CV | DPBS Nakavt olarak anılır |
| DMEM / F-12 | Gibco | 12660012 | İnsan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin büyümesi için optimize edilmiş DMEM-F12 olarak adlandırılır |
| Laminin Fare Proteini, Doğal | Gibco | 23017015 | Laminin |
| < güçlü > Yazılım ve Ekipman< / güçlü > | |||
| Santrifüj | olarak adlandırılır Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 canlı hücre görüntüleme okuyucu | Biotek | ||
| Gen5 Mikroplaka Okuyucu ve Görüntüleyici Yazılımı | Biotek | sürüm 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | tüp çalkalayıcı olarak bakın | |
| Su sonikatörü | Elma | Modu Transsonic 310 |
Kaynaklar
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254(2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065(2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098(2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486(2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144(2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545(2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138(2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808(2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
