Leishmania major kullanarak Gözenek Oluşturan Toksinlerin Moleküler Mekanizmasını ve İşlevini Deşifre Etmek

Summary

Burada sunulan, gözenek oluşturan toksinlerin neden olduğu bağlanma, sitotoksisite ve sinyalleşmeyi belirlemek için Leishmania majör promastigotlarını kullanan bir protokoldür. Streptolizin O ile bir kavram kanıtı sağlanır. Diğer toksinler, toksin direncinin yeni mekanizmalarını tanımlamak için L. major'da bulunan genetik mutantlardan yararlanmak için de kullanılabilir.

Abstract

Gözenek oluşturan toksinlerin (PFT'ler) işlevini ve mekanizmasını anlamak zordur, çünkü hücreler PFT'lerin neden olduğu membran hasarına direnir. Biyofiziksel yaklaşımlar gözenek oluşumunu anlamaya yardımcı olurken, genellikle membran lipitlerinin ve proteinlerinin tam tamamlayıcısından yoksun indirgemeci yaklaşımlara güvenirler. Kültürlenmiş insan hücreleri alternatif bir sistem sağlar, ancak onarım mekanizmalarındaki karmaşıklıkları ve fazlalıkları, spesifik mekanizmaların tanımlanmasını zorlaştırır. Buna karşılık, kutanöz leishmaniasis'ten sorumlu insan protozoan patojeni Leishmania major, karmaşıklık ve fizyolojik ilişki arasında optimal bir denge sunar. L. major genetik olarak izlenebilir ve in vitro olarak yüksek yoğunluğa kadar kültürlenebilir ve pertürbasyonların enfeksiyon üzerindeki herhangi bir etkisi yerleşik murin modellerinde ölçülebilir. Ek olarak, L. major , membran dinamiklerini değiştirebilen memeli meslektaşlarından farklı lipitleri sentezler. Membran dinamiğindeki bu değişiklikler, en iyi karakterize toksin ailesinden, kolesterole bağımlı sitolisinlerden (CDC'ler) PFT'lerle araştırılabilir. CDC'ler Leishmania membranındaki ergosterol'e bağlanır ve L. majör promastigotları öldürebilir, bu da L. major'un PFT fonksiyonunun hücresel ve moleküler mekanizmalarını belirlemek için uygun bir model sistem olduğunu gösterir. Bu çalışma, parazit kültürü, lipit duyarlılığını değerlendirmek için genetik araçlar, membran bağlama testleri ve hücre ölümü tahlilleri dahil olmak üzere L. majör promastigotlarda PFT fonksiyonunu test etme yöntemlerini açıklamaktadır. Bu analizler, L. major'un bir dizi evrimsel olarak farklı organizma ve lipit organizasyonundaki ortaklıklar arasında PFT fonksiyonunu anlamak için güçlü bir model sistem olarak hızlı bir şekilde kullanılmasını sağlayacaktır.

Introduction

Gözenek oluşturan toksinler (PFT'ler), bakteriyel toksinlerin en büyük ailesidir¹, ancak hücreleri deldikleri ve yok ettikleri mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. En iyi çalışılan gözenek oluşturan toksinler ailesi, kolesterole bağımlı sitolisinlerdir (CDC'ler). CDC'ler öncelikle nekrotizan fasiitin etken maddesi Streptococcus pyogenes² dahil olmak üzere gram-pozitif bakteriler tarafından sentezlenir. S. pyogenes , konakçı hücrelerin plazma zarındaki sterollere monomerler olarak bağlanan, oligomerize olan ve membran^1'e ~ 20-30 nm gözenekler ekleyen CDC streptolizin O'yu (SLO) salgılar. Lipitlerin bu süreçte oynadığı rol zayıf bir şekilde belirlenmiştir.

Lipid-CDC etkileşimlerini incelemeye yönelik bir yaklaşım, kimyasal olarak tanımlanmış lipozomların kullanılmasıdır. Tanımlanmış lipozomlar, toksin bağlanmasını ve^{gözenek oluşumunu sürdürmek} için gerekli lipit eşikleri hakkında bilgi sağlarken^{, hücresel} fonksiyonları tam olarak özetlemezler. Örneğin, yeniden yapılandırılmış lipozomlar, memeli konakçılarının lipit asimetrisinden ve toksinlere yanıt olarak lipit modifikasyonlarından yoksundur⁵. Lipozomlara bir alternatif, memeli hücre hatlarını kullanmaktır. Bu hücre hatları fizyolojik olarak daha alakalı olsa da, toksin algılama ve direnç mekanizmalarında büyük ölçüde fazlalık vardır². Sonuç olarak, CDC'lere direnmek için kullanılan onarım yolları zayıf bir şekilde belirlenmiştir. Özellikle, Ca²⁺ akışı, membran onarımı^1'in birincil aktivatörüdür. Ca²⁺ akışının aşağı akışında, seramid bağımlı onarım ^{6,7 ve MEK'e} bağımlı onarım yolu⁶ dahil olmak üzere birden fazla yol^{devreye girer}. Bu yollar, taşıma için gerekli endozomal sıralama kompleksi (ESCRT)⁸ ve ek ^6,9,10 dahil olmak üzere diğer protein efektörleri ile etkileşime girer. Bu yolakların memeli hücrelerinde diseke edilmesi, veri yorumlamasını karıştıran fazlalık nedeniyle zordur.

Onarım yollarını incelemek için karmaşıklığı basitlikle dengelemenin bir yolu, Leishmania cinsindeki protozoan patojenler gibi daha basit organizmaların kullanılmasıdır. Leishmania sp. insanlarda ve diğer hayvanlarda leishmaniasis'e neden olur. Leishmaniasis, türlere ve diğer faktörlere bağlı olarak kutanöz leishmaniasis'ten (kendi kendini sınırlayan cilt lezyonları) ölümcül viseral leishmaniasis'e (hepatosplenomegali) kadar değişir¹¹. Kutanöz leishmaniasisin etken maddesi olan Leishmania major, insanlara bir kum sineği vektörü aracılığıyla bulaşır ve Leishmania fonksiyonunu ve enfeksiyonunu anlamak için kullanılır¹². Ek olarak, Leishmania sp. dijenik^12'dir. Amastigotlar olarak adlandırılan hücre içi memeli makrofaj parazitleri ve kum sineği^12'de serbest yüzen, kamçılı promastigotlar olarak bulunurlar. L. majör promastigotlar, M199 gibi serum takviyeli ortamlarda yüksek yoğunluklu^13'e kadar kültürlenebilir. Promastigotlar ayrıca genetik olarak da izlenebilir; lipid biyosentez yollarını hedefleyenler de dahil olmak üzere birçok gen nakavtı vardır¹³. Bu nakavtlar, Balb / c farelerinin enfeksiyonu yoluyla büyüme ve enfeksiyon ve lezyon gelişimindeki farklılıklar açısından değerlendirilebilir¹³.

Leishmania kültürünün göreceli kolaylığına ve lipit biyosentez nakavtlarının aralığına ek olarak, parazit memelilerden daha basit bir genoma sahiptir. Leishmania'nın en iyi karakterize edilen türü, kusurlu lipit metabolizmasına sahip mutantlar gibi birçok mevcut genetik araca sahip olan L. major'dur ¹⁴. Özellikle, birçok onarım proteini yoktur. L. major, ekler gibi önemli memeli onarım proteinleri için bugüne kadar tanımlanmış homologlara sahip değildir. Bu, memeli sistemlerinin karmaşıklığı olmadan evrimsel olarak korunmuş onarım yollarının karakterizasyonunu sağlar. Bununla birlikte, Leishmania'da onarım yolları bugüne kadar karakterize edilmemiştir. Aynı zamanda, MEK yolu⁶ gibi onarımla ilgili anahtar sinyal yolakları Leishmania ^sp.15,16'da korunmaktadır^, ancak homologların doğrulanması gerekmektedir. Mitojenle aktive edilen protein kinaz (MAPK) yolu, memeli hücrelerinde hücre içi sağkalım ve termostabiliteye katkıda bulunduğu ve metasiklogenezi kontrol ettiği L. mexicana'da iyi çalışılmıştır¹⁶. Leishmania sp.'de, 15 MAPK'dan 10'u¹⁷ olarak karakterize edilmiştir. LmMAPK9 ve LmMAPK13'ün, korunmuş fosforilasyon dudak dizisindeki kimliğe dayanarak memeli ERK1/2'ye en çok benzeyen olduğu tahmin edilmektedir. Fosforilasyon dudak dizisi hem memeli ERK1/2 hem de LmMAPK9 ve LmMAPK13 için TEY'dir. Bununla birlikte, Leishmania MAPK'ların sekizinde TDY fosforilasyon motifi¹⁵ vardır. Leishmania sp., LmxMKK¹⁸ ve MEKK ile ilişkili kinaz (MRK1)^19'da en az iki MEK homologu tanımlanmıştır. Bu, Leishmania'da tanımlanan içgörülerin memeli sistemlerine dönüşebileceğini düşündürmektedir. Memeli sistemlerine tercüme edilmedikleri yerlerde, leishmaniasis tedavisi için terapötik hedefleri temsil ederler.

L. majör promastigotların membran onarımını ve toksinlerle etkileşimlerini incelemek için kullanılması için, orta verimli tekniklere ihtiyaç vardır. Yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme, etiketli proteinlerin ve membranların gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlarken, düşük verimdir ve hücresel sağkalımı ölçmeyebilir. Orta verimli canlılık testleri, akış sitometrisi ile ölçülen boya alımını, mitokondriyal aktivitenin ölçümünü veya laktat dehidrogenaz (LDH) gibi hücresel proteinlerin salınımını içerir. Memeli hücrelerinde, LDH analizleri hücre ölümünü nicel olarak ölçmez²⁰. Ayrıca, LDH salınımı veya mitokondriyal aktivite gibi popülasyon bazlı tahliller, sağlam tek hücreli veya multiparametrik analize izin vermez²⁰. Buna karşılık, akış sitometrisine dayalı analizler multiparametrik tek hücreli analizi mümkün kılar²⁰. Bununla birlikte, bu testler toksin biyolojisini veya L. majör promastigotlardaki toksinlere verilen yanıtları anlamak için uygulanmamıştır.

Bu çalışmada SLO, L. majör'ün sfingolipid null mutantının plazma membran pertürbasyonunu iki farklı tamponda anlamak için bir araç olarak kullanılmıştır - L. majör promastigotları ve daha basit Tyrode tamponunu kültürlemek için rutin olarak kullanılan M199 ortamı . Orta verimli bir akış sitometri testi tarif edilir ve toksin doz-yanıt eğrileri oluşturmak için kullanılır. Akış sitometrik tahlilinden elde edilen veriler, LC₅₀ değerlerini belirlemek için lojistik bir eğriye modellenir. Bu bilgiyle, MAPK antikorlarının batı lekelenmesi kullanılarak doğrulanabilmesi için sublitik bir SLO dozu belirlenebilir.

Protocol

RG2 patojeni Leishmania majör ve rekombinant DNA'nın kullanımı ve kullanımı için tüm uygun kılavuzlar ve standart mikrobiyolojik, güvenlik ve hücre kültürü uygulamaları kullanılmıştır. Canlı L. major ile yapılan tüm deneyler, BSL-2 sertifikalı bir laboratuvarda bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirildi. Çalışma, Texas Tech Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından denetlendi.

NOT: Güvenlik açısından bakıldığında, canlı L. majör promastigotlar Risk Grubu 2 patojenleridir. Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nden (IBC) uygun muhafaza, önlemler ve gözetim kullanarak ele alın. Toksik maddeleri ve kimyasalları, toksik maddeler için kurumsal prosedürlere uygun olarak kullanın. Rekombinant toksinler kullanılıyorsa, rekombinant DNA çalışması için IBC onayı ve gözetimi gerekebilir.

1. L. majör promastigotların yetiştirilmesi ve hazırlanması

1. Daha önce homolog rekombinasyon veya CRISPR tabanlı yöntemler kullanılarak tanımlandığı gibi L. majör genetik mutantları elde etmek veya yapmak ve doğrulamak^13,21. Nakavtın özgüllüğünü sağlamak için bir plazmid üzerine tekrar eklenen gen ile tamamlanan nakavtları kullanın.
2. Kültür vahşi tip L. majör ve spt2^- promastigotlar 27 ° C'de tam M199 ortamında. Epizomal eklenti hücrelerini (spt2^-/+SPT2) tam M199 artı 10 μg/mL G418'de kültürleyin (bkz. Tablo 1 ve Malzeme Tablosu).
   NOT: L. majör hücrelerle yapılan deneyleri içeren tüm deney düzeneği, BSL2 sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.
3. Promastigotları, daha önce 23 yapılan L. majör büyüme eğrisi tahlilleri ile belirlendiği gibi, log fazına (2-8 x 10⁶ hücre / mL) ulaşana kadar tam M199 orta^22'de yetiştirin. Sitotoksisite için her bir kuyucuk için 1 x 10 5 hücre, artı boyama kontrolü için⁵ x 10⁵ hücre planlayın. Batı lekesi için, kuyu başına 2 x 10⁷ hücre planlayın.
   NOT: İki teknik replikasyonla sitotoksisite testi yapın.
4. Uygun hücre yoğunluğunu doğrulamak için, eşit miktarda fiksatif (1x PBS'de% 3.7 paraformaldehit) ile promastigotların bir alikotunu (10-40 μL) karıştırın. Sabit numunenin 10 μL'sini hemasitometrenin her iki tarafına yükleyin.
   DİKKAT: Formaldehit toksik bir kimyasaldır. Tehlikeli kimyasallar için kurumsal politikalara uygun olarak kullanın.
5. 20x büyütmede mikroskop kullanarak hücre sayımı yapın. Hemasitometrenin ortasındaki 25 küçük karedeki tüm hücreleri sayın. Her iki taraftaki kareler için tekrarlayın ve sayımların ortalamasını alın.
   NOT: Sayımlar arasındaki fark >10 ise, yeniden sayım ve ortalama. Ortalama sayım <10 veya >100 ise, seyreltmeyi değiştirin ve yeniden sayım yapın ve ardından aşağıdaki formülü kullanarak kültür yoğunluğunu hesaplayın:
   (Eq 1)
   Örneğin, 25 karede ortalama 250 Leishmania varsa, kültür yoğunluğu 5 x 10⁶ hücre / mL'dir.
6. Saydıktan sonra, 5 x 10⁶ hücreyi 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve hücreleri peletlemek için oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın.
7. 10 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatantı atın ve hücre peletini kısaca vorteksleyin. Aynı tüpe 5 mL 1x PBS ekleyin ve 3-6x'i hafifçe ters çevirerek hücreleri yıkayın. Hücreleri peletlemek için oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın.
8. Süpernatantı 10 mL'lik bir pipet kullanarak atın ve 5 x 10 6 hücreli peleti, 1 x 10⁶ hücre/mL'lik bir nihai konsantrasyon vermek için 5 mL'lik bir pipetle yapılan deneyler için kullanılan 5 mL ortamda (örneğin, M199 veya 1x Tyrode tamponu) yeniden askıya alın.

2. Sitotoksisite testi

1. Deneysel hazırlık
   1. Toksini daha önce tarif edildiği gibi arındırın²⁴ veya toksini bir satıcıdan satın alın. Aliquot tek kullanımlık alikotlara dönüştürülür ve 1 yıla kadar -80 ° C'de saklanır. Birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçının.
   2. İnsan kırmızı kan hücrelerini kullanarak her toksin için hemolitik aktiviteyi belirleyin (bakınız Malzeme Tablosu)²⁴.
      NOT: Hemolitik aktivite kullanılır, çünkü saflaştırma, mutasyonlar vb. nedeniyle aktivitedeki farklılıkları kontrol eder. Eritrositlerin tür seçimi hemolitik aktiviteyi değiştirebilir (örneğin; intermedilysin insan kırmızı kan hücrelerini gerektirir).
   3. Her durum için iki teknik replikasyon, doz-yanıt eğrisi için yedi seyreltme ve toksin içermeyen bir kontrol planlayın.
      NOT: Vahşi tip (WT), spt2- ve spt2-/+SPT2 promastigotları ile, bir ^V-dip 96 delikli plakada iki tedavi test edilebilir. Örneğin, medyaya duyarlılık karşılaştırılabilir (Şekil 1). V-alt plaka yerine, 1.2 mL mikrotitre tüpleri (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılabilir. Sitometredeki edinme süreleri nedeniyle, aynı anda birden fazla plaka çalıştırılması önerilmez.
   4. Gerekli test koşullarına ve deneyin amacına bağlı olarak hangi tahlil tamponunun kullanılacağını belirleyin.
      NOT: Bu örnekte, iki tahlil tamponu karşılaştırılmıştır: M199 ve Tyrode'un tamponu, canlılık boyası propidium iyodür (PI) ile desteklenmiştir. Serumdaki kolesterol CDC aktivitesine müdahale edecektir²⁴.
   5. Tedavi edilen genotiplerin koşullarına ve sayısına bağlı olarak ihtiyaç duyulan toksin miktarını hesaplayın. P spesifik lizisin seyreltme eğrisinin yarısına kadar indiğinden emin olun.
      NOT: CDC'ler için, iki katlı seri seyreltme, daha sonraki lojistik modelleme için iyi bir aralık sağlayacaktır. Spt2^- promastigotlar için 4.000 HU/mL SLO önerilen başlangıç seyreltmesidir. Aktif olmayan toksinlerin kullanıldığı yerlerde, bunun yerine en yüksek doza eşdeğer bir kütle kullanılabilir.
   6. Kuyu başına 200 μL'lik bir son hacim planlayın ve pipet hatasını hesaba katmak için küçük bir hacim ekstrası (50-100 μL) ekleyin.
      NOT: Her biri çift olarak yapılan üç genotipte, seri seyreltme için altı örnek olacaktır.
   7. Aşağıdaki formülü kullanarak gereken toplam toksin miktarını belirleyin:
      (Eq 2)
      ActivityMax'in kullanılan en yüksek konsantrasyon olduğu durumlarda (HU / mL); TotalFinalVolume toplam hacimdir (altı örnek için, 200 x 6 + 100 = 1.300 μL); ActivityStock, toksin stoğunun (HU/mL) aktivitesidir; ve VolStockToxin, ihtiyaç duyulan toksin stoğunun hacmidir.
   8. Deney için gereken yeterli tahlil arabelleğini hazırlayın. Bazal ortamı bir canlılık boyası ve Ca 2+ seviyelerini kontrol etmek için gereken herhangi bir Ca²⁺ veya EGTA ile^destekleyin . Karıştırmak için vorteks.
      NOT: Örneğin, her 10 mL Tirod tamponu için, sırasıyla 10 μg / mL ve 2 mM'lik nihai konsantrasyonlar vererek, 50 μL 2 mg / mL PI ve₂₀₀ μL 100 mM CaCl 2 ekleyin.
   9. Canlılık boya PI'nin, Cy5 veya AlexaFluor647-konjuge toksinler^20,25 kullanan floresan bağlama testleri gibi kullanılan diğer problarla çakışmadığından emin ^olun.
   10. 2x toksin çözeltisi yapmak için toksin seyreltmelerini planlayın. 1,5 mL santrifüj tüplerine tahlil tamponu ekleyin ve buz üzerinde soğutun. Toksini sadece tahlil başlamadan hemen önce ekleyin.
       NOT: Bu örnekte, üst seyreltme için 1,3 mL tahlil tamponu eklenecek ve 2x toksin çözeltisini hazırlamak üzere seri seyreltmeler için 650 μL eklenecektir.
2. Deney
   1. Adım 1.8'den itibaren 0,5 mL işlenmiş promastigotları ayrı bir tüpte "Lekesiz kontrol" olarak ayırın.
      NOT: Bu örnek, akış sitometresinde geçit ayarlamak için kullanılacaktır.
   2. Kalan promastigotlara 10 μg / mL'lik son konsantrasyona 2 mg / mL PI ekleyin. 3 s. için vorteks.
      NOT: İşlenen promastigotlara PI eklendikten sonra, bu hücreler sadece 2.5 saatlik bir süre boyunca kullanılabilir. 2.5 saat sonra, hücreler ölmeye başlar ve sonuçlar hatalı hale gelir.
   3. V tabanlı 96 kuyucuklu plakanın veya 1,2 mL mikrotitre tüplerinin her bir kuyucuğuna 1 x 10⁵ (100 μL/kuyucuk içinde) işlenmiş promastigotlar ekleyin (Şekil 1). Plakayı veya tüp rafını, görüntülemeden yaklaşık 45° açıyla buzun üzerine yerleştirin. Leishmania promastigotlarını kullanırken işi bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
   4. Her toksinsiz kontrole (son sıra) PI ile 100 μL tahlil tamponu ekleyin. Renkli olarak daha koyu görünen toplam hacmi 200 μL olan tüpleri görsel olarak tanımlayarak kontrolün doğru şekilde eklendiğini doğrulayın.
   5. Toksin alikotlarını -80 ° C'den çıkarın, buz üzerinde çözün ve gerektiğinde havuzlayın. Adım 2.1.5'te hesaplanan toksin hacmini en yüksek seyreltmeye ekleyin (adım 2.1.10'da hazırlanır). Ardından, toksini seri olarak seyreltin (Şekil 1). Pipet, karıştırmayı sağlamak için en az 8 kat yukarı ve aşağı pinet.
      NOT: CDC'ler oda sıcaklığında hızla inaktive olduğu için buz üzerinde çalışın.
   6. En düşük toksin konsantrasyonundan başlayarak, doğru sıraya hızlı bir şekilde 100 μL toksin ekleyin (Şekil 1 ve Şekil 2) ve tüm toksin hücrelere eklenene kadar devam edin.
   7. Plakayı sızdırmazlık bandı ile kapatın. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kuluçka döneminden sonra, plakayı paketleyin ve akış sitometresine taşıyın.
3. Veri toplama
   1. Akış sitometresini (bkz. Malzeme Tablosu) ve satın alma yazılımını üreticinin talimatlarına göre ve tesis politikasına göre ayarlayın. Sitometre üzerinde önceden eğitim almadan akış sitometrisi prosedürünü uygulamayın.
      NOT: Bu örnekte, 4 lazerli Attune NxT kullanılmıştır. PI, YL-1 kanalında toplandı (561 nm lazer tarafından uyarıldı, 577 LP'den geçirildi, 600 DLP'den yansıtıldı ve 585/16 bandpass'tan filtrelendi), ancak PI'nin geniş spektrumu diğer kanallarda toplanmaya izin verdi.
   2. Lekesiz L. majör promastigot numunesini kullanarak, ileri ve yan saçılma için kapıları ve seçilen boyalara göre ilk floresan parametrelerini ayarlayın.
   3. Otofloresansı kontrol etmek için nokta grafikleri için istenirse ekstra bir parametre ekleyin (örneğin, "leke yok") (Şekil 3).
      NOT: Bu örnekte, BL-1 kanalı (488 nm lazer tarafından uyarılmış, 495 DLP ve 503 LP'den geçirilmiş, 555 DLP'den yansıtılmış ve 530/30 bant geçişi ile filtrelenmiş) kullanılmıştır.
   4. Tek lekeli kontrolleri kullanarak, canlılık boyası (bu çalışmada PI) ve floresan olarak etiketlenmiş toksinler için kapıları ayarlayın. Mikro tıkanmalar için zamana karşı ileri saçılımı izleyin.
      NOT: PI, lekesiz kontrollerin üzerindeki tüm hücreleri loş bir şekilde boyayacaktır. Ölü hücreler, popülasyonlar arasında geçici olarak geçirgen hale getirilmiş hücrelerle kolayca ayrılabilecektir.
   5. Sitometredeki her örnek için >10.000 kapılı olay elde edin.
      NOT: En hassastan en az hassasa doğru okunması önerilir, ancak okuma sırasının numune sonuçları üzerindeki etkisini belirlemek için edinme sırası tersine çevrilebilir.
   6. Verileri kaydedin ve analiz için gerektiği gibi dışa aktarın.
4. Veri analizi
   NOT: Bu çalışmada, Çözücü eklentili Excel (bkz. Malzeme Tablosu) veri analizi için kullanılmıştır (bkz. Ek Dosya 1).
   1. Kapı toplamı, tek hücreli L. majör promastigotlar ileri ve yan saçılma ve gerektiğinde zaman üzerinde geçiş yaparak (Şekil 3). Akış sitometresi için önerilen yükseklik veya alanı kullanın.
      NOT: Burada kullanılan akış sitometresi için, alan yerine yükseklik önerilen parametredir.
   2. Ölü hücreleri "PI yüksek" olarak tanımlayın ve kapılayın. Ara hücreleri "PI düşük" olarak kapatın. PI yüksek hücreler ölü hücreler iken, PI düşük hücreler geçici olarak geçirgenleştirilir²⁶.
      NOT: PI yüksek hücreleri tipik olarak negatif hücrelerden 2-3 günlük bir kayma gösterir.
   3. Verileri Excel'e verin. Öldürmeyi belirlemek için örnek adı/kimliği ve %PI yüksekliğini edinin.
      NOT: Floresan toksinler kullanılmışsa, canlı, geçici geçirgenleştirilmiş ve negatif popülasyonların medyan floresan yoğunluğuna (MFI) ihtiyaç duyulacaktır. Geçici geçirgenlik için %PI düşük ihraç edilebilir.
   4. İki teknik çoğaltma arasındaki her koşul için ortalama %PI yüksekliğini belirleyin.
      NOT: Floresan toksinler için ortalama MFI gerekiyorsa, bunu da hesaplayın.
   5. Aşağıdaki formülü^24,25 kullanarak %PI yüksekliğinden %Specific Lysis değerini hesaplayın:
      (Eq 3)
      PIhighxpt'nin deneysel durum için %PI yüksek olduğu; ve PIhighctl, toksin kontrolü için %PI yüksekliğindedir.
   6. Doz-yanıt eğrisi için toksin konsantrasyonuna karşı %Spesifik Lizis grafiği (Şekil 4).
   7. Lojistik modelleme için Excel'de doz-yanıt eğrisini düzenleyin. Toksin konsantrasyonu ve ortalama %Spesifik Lizis, deneysel detaylar ve/veya ham %PI yüksek hesaplamalar ile birlikte dahil edilir (Tablo 2).
   8. Çözücü eklentisinin etkin olduğunu doğrulayın.
      Not: Excel'in masaüstü sürümünde Çözücü'yü etkinleştirmek için Dosya > Seçenekleri > eklentileri'ne gidin ve Çözücü kutusunu işaretleyin. Excel'i yeniden başlatın.
   9. Dört sütunu daha "modellenmiş", "artıklar", "parametreler" ve "parametre değerleri" olarak etiketleyin. İlk sütunların deneysel parametrelere, toksin konsantrasyonuna ve %Spesifik Lizise karşılık geldiğini doğrulayın (Tablo 2).
   10. "Parametreler" sütununa şu parametreleri ekleyin: L, k, c, SUM ve LC50. "Parametre değerleri" sütununa şu değerleri girerek L, k ve c parametrelerini başlatın: 100, 0,05, 1.000.
   11. "Modellenmiş" sütununda, aşağıdaki formülü kullanarak lojistik modeli oluşturun:
       (Eq 4)
       L, k ve c'yi "parametre değerleri" sütununda bu parametreleri içeren hücrelere ayarlayın.
       X'i toksin konsantrasyonunu içeren hücreye ayarlayın.
       NOT: Tablo 2, G4 hücresi için formül aşağıdaki gibidir: =$J$3/(1+EXP(-$J$4*(D4-$J$5)))
   12. Bu denklemi, toksin kontrolü dışındaki tüm %Specific Lysis değerlerine uygulayın.
   13. "Artıklar" sütununda, aşağıdaki denklemi kullanarak modellenen sayı ile gerçek spesifik lizis arasındaki farkın karesini hesaplayın:
       (Ek. 5)
       burada y, deneysel %Spesifik Lizis'tir; ve m, 2.4.10-2.4.11 adımlarında hesaplanan "modellenmiş" sütundaki karşılık gelen değerdir.
   14. "SUM" öğesinin yanındaki "parametre değerleri" sütununda, artıklar sütunundaki tüm değerleri toplayın.
   15. "LC50" nin yanındaki "parametre değerleri" sütununda, LC_50'yi belirlenen değerlerden hesaplamak için denklemi başlatın. Bu, m = 50 olduğunda x için Eq 4'ü çözüyor.
       (Eq 6)
       Tablo 2 için Excel formülü aşağıdaki gibidir: =J5-(LN(J3/(50)-1))/J4
   16. Veri sekmesinden Çözücü'yü açın. Hesaplanan artıkların toplamını içeren hücre olması için Set Target'ı seçin. Min olarak ayarlayın.
   17. L, k ve c parametre değerleri için değişken hücrelerini değiştirin.
       NOT: "Kısıtlanmamış Değişkenleri Negatif Olmayan Yap" seçeneği işaretli bırakılırsa çözücü daha iyi davranabilir.
   18. Negatif k değerleri için, k'yi pozitife değiştirmek için k'den -1'i hesaba katarak Eq 4 ve Eq 6'yı değiştirin. GRG Doğrusal olmayan çözme yöntemini kullanın. Çöz'ü tıklayın.
   19. Eğriyi kontrol edin ve LC_50'nin Eq 6 kullanılarak otomatik olarak hesaplandığını kontrol edin (Tablo 2). Hem %Specific lizis hem de toksin konsantrasyonuna karşı modellemeyi grafiksel olarak çizerek uyumu doğrulayın.
       NOT: Eğri için R² hesaplanarak da kontrol edilebilir.

3. Toksine meydan okuyan L. majör promastigotların protein analizi

1. Bölüm 1'de açıklandığı gibi L. majör promastigotları hazırlayın.
2. 2 x 10⁷ WT, spt2- ve spt2-/+SPT2 L. majör promastigotları, 5 mL'lik bir pipet (örneğin, serumsuz M199) kullanarak istenen tahlil tamponunun 2 mL'sinde yeniden askıya alın. Son bir sublitik konsantrasyona toksin ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Örneğin, spt2^- promastigotlar için bir sublitik SLO dozu 500 HU / mL'dir.
3. Diğer genotipleri ve toksinsiz kontrolleri dahil edin.
4. Hücreleri peletlemek için promastigotları 10 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı 10 mL'lik bir pipet kullanarak atın. Hücre peletini parçalamak için hücre peletini içeren kapalı tüpü, biyogüvenlik kabininin ızgarası gibi düzensiz bir yüzey boyunca üç kez hızlı bir şekilde çalıştırın.
   NOT: Hücre peleti çıplak gözle neredeyse görünmezdir.
5. Kullanımdan hemen önce 2-merkaptoetanol ile 1x SDS-PAGE numune tamponunu yeniden oluşturun ve hücre peletine eklenmeden önce 10 dakika boyunca 95 ° C'ye ısıtın. Hücre peletini sıcak 1x SDS-PAGE numune tamponunda yeniden askıya alın ve yukarı ve aşağı pipetleyerek, iyice karıştırın. Yeniden askıya alınmış hücre peletini 10 dakika boyunca 95 °C'de 1x numune tamponunda ısıtın.
   NOT: Numune tamponunda çözündürme işleminden sonra, gerekirse numuneleri -20 °C'de uzun süreli olarak saklayın.
6. Çözücü jeli hazırlayın. Amonyum persülfat (APS) ve TEMED dışındaki tüm bileşenleri 15 dakika boyunca gazdan arındırın.
7. Jeli dökmeden hemen önce APS ve TEMED'i ekleyin. Çözücü jeli suyla dikkatlice örtün. Çözünen jelin polimerize olmasına izin verin, ~ 30-45 dakika.
8. Suyu boşaltın ve istifleme jelini hazırlayın. İstifleme jelini ekleyin, kabarcıkları önlemeye özen gösterin. İlgili sayıda kuyucuk içeren bir tarak yerleştirin ve 5 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin. Artık istifleme jeli kullanarak polimerizasyonu izleyin.
9. SDS-PAGE'i çalıştırmak için jeli monte edin ve hazneye rezervuar tamponu ekleyin.
10. Kuyucuk başına her numunenin 10 μL'sini veya protein merdiveninin 8 μL'sini yükleyin. Numuneler çözme jeline girene kadar 180 V'ta çalıştırın ve ardından voltajı ~ 160 V'a düşürün ve boya cephesi plakanın kenarından ~ 0,5 cm olana kadar çalıştırın.
    NOT: Numunelerin dibe ulaşması için gereken süre 1-1,5 saat arasında değişebilir. Voltaj düşürülerek süre uzatılabilir. Voltajı asla sıfıra indirmeyin. Daha yüksek voltajlar jelin "gülümsemesini" artırabilir ve plakaları çatlatabilir.
11. Jeli Coomassie boyasına (protein boyama için) veya 1x transfer tamponuna (batı lekelenmesi için) aktarın. Coomassie boyama için, gece boyunca lekeleyin ve sonra boyama, görüntü ve kurutma.
12. Batı lekesi için, transfer sistemini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
13. Islak transfer için soğuk 1x transfer tamponu ve ıslak öncesi pedler, filtre kağıdı ve nitroselüloz kullanın. Burada kullanılan Bio-rad Protean III sistemi için (bakınız Malzeme Tablosu) filtre kağıdı 10 cm x 7,5 cm boyutlarında kesilebilir. Nitroselülozu 9 cm x 6.75 cm'ye kesin.
    NOT: Nitroselüloz oldukça yanıcıdır. Açık alevlerden ve diğer potansiyel tutuşma kaynaklarından kaçının.
14. Transfer kasetini pedler, filtre kağıdı ve nitroselüloz ile yerleştirin. Hava kabarcıklarını açın. Jeli dikkatlice ekleyin.
15. Filtre kağıdını ekleyin ve hava kabarcıklarını sürün. Pedi ekleyin, kaseti kapatın ve tutucuya doğru yönde yerleştirin (nitroselülozun kırmızı terminale baktığından emin olun). Yan tarafa bir karıştırma çubuğu ve bir buz torbası ekleyin ve rezervuarı soğuk 1x transfer tamponu ile doldurun. 90 dakika boyunca 110 V'ta aktarın.
    NOT: Transfer sırasında oluşan ısı, transferi olumsuz yönde etkileyebilir. İyi bir aktarım sağlamak için her zaman soğuk 1x aktarım arabelleği kullanın.
16. Nitroselülozu çıkarın ve ~ 5 dakika boyunca Ponceau çözeltisi ile lekeleyin. Ultra saf su ile durulayın. Protein merdivenini kurşun kalemle işaretleyin ve lekeyi gerektiği gibi kesin. Artık aktarım arabelleğini kullanarak lekeyi temizleyin.
    NOT: Ponceau birçok kez yeniden kullanılabilir.
17. Nitroselülozu 25 mL% 5 BSA'da 4 ° C'de 1x TBST'de, gece boyunca çalkalayarak bloke edin. Daha sonra, bloke edici çözeltiyi atın ve 1x TBST'de% 1 BSA'da birincil antikor (1: 1.000) ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de çalkalayın.
    NOT: Birincil antikor -20 ° C'de kaydedilebilir ve birkaç kez tekrar kullanılabilir.
18. Nitroselülozu 3x'i 1x TBST'de her biri 10 dakika boyunca çalkalayarak yıkayın. Yıkamayı atın ve 1x TBST'de% 1 BSA'da 10 mL HRP konjuge sekonder antikor (1: 10.000) ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat çalkalayın. Nitroselülozu 3x'i 1x TBST'de her biri 10 dakika boyunca çalkalayarak yıkayın.
19. Nitroselülozu görüntülemeden hemen önce ECL reaktifini hazırlayın. Görüntülemeden hemen önce, TBST'yi boşaltın ve ECL reaktifini nitroselüloza ekleyin. 1 dakika çalkalayın. Jeli görüntüleyin.

Results

Tyrode tamponunda SLO'ya karşı promastigot hassasiyetinin M199'a kıyasla artması
L. majör promastigotların SLO duyarlılığı farklı tahlil tamponları arasında karşılaştırıldı. Vahşi tip, spt2^- ve spt2^-/+SPT2 promastigotları, bir akış sitometresinde analizden önce 30 dakika boyunca serumsuz M199 veya Tyrode tamponunda SLO ile 30_{dakika boyunca} zorlandı. Analiz için uygun parazitler ileri/yan saçılma profilleri ile tanımlanan tek hücrelerdi (

Discussion

Bu çalışmada, PFT'lerin moleküler mekanizmalarını ve fonksiyonlarını incelemek için kullanılan yöntemler, insan patojeni Leishmania major'u model bir sistem olarak kullanarak tanımlanmıştır. Tek hücreli canlılığı ölçmek için orta verimli bir akış sitometrisi tabanlı sitotoksisite testi geliştirilmiştir. LC₅₀ değerleri lojistik modelleme kullanılarak doz-yanıt eğrisinden hesaplanabildiğinden, canlılık popülasyon düzeyinde nicelikseldir. Bir ilke kanıtı olarak, ortam seçiminin SLO'ya karşı vahşi tip ve ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.2 mL mikrotitre (Marsh) tüpleri	Fisher	02-681-376	Sitotoksisite deneyi
1.5 mL mikrosantrifüj tüpü	Fisher	05-408-129	Toksin dilüsyonları
15 mL santrifüj tüpü ve nbsp;	Avantor VWR (Radnor, PA)	89039-666	Hücreleri ve ortamı tutmak için
1x Fosfat tamponlu salin (PBS)	Fisher	BP399	Hücre işleme için
%3 H2O2	Walmart ve nbsp; (Fayetteville, AR)	N/A
ECL 5x M199	için Cell-gro	11150067	L. major promastigotlar için bazal büyüme ortamı
Biyogüvenlik kabini	Baker		Steril koşullarda hücreleri kültürlemek için
Sığır serum albümini (BSA)	Fisher	BP1605-100	Fraksiyon V kabul edilebilir saflık
CaCl2	Fisher	BP510-100	Stok konsantrasyonu 100 mM
Santrifüj	Termo Fisher	Heraeus Megafuge 40R	Kültürden hücreleri peletlemek için
Cy5 Mono-reaktif boya paketi	Cytiva (Marlborough, MA)	PA25031	Toksinler için florofor etiketi
Dijital kuru banyo	Benchmark	BSH1002	Protein örneklerini denatüre etmek için
EGTA	Amresco	0732-100G	Stok konsantrasyonu 0.5 M
Excel	Microsoft (Redmond, VA)		Veri analizi yazılım
Akış sitometresi (4 lazerli Attune NxT)	Veri toplama için Fisher
FlowJo	BD (Ashland, OR)		Yazılım
Formaldehit	Fisher	BP531-500	Hücreleri saymak için fiksatif
G418	Fisher	BP673-1	Hücreler için seçim maddesi
Hellmanex III	Sigma	Z805939	Seyreltik 1:4 sitometreyi temizlemek için
Hemasitometre	Fisher	0267151B	Hücreleri saymak için
İnsan kırmızı kan hücreleri	Zen-bio (Durham, NC)	SER-10MLRBC	Toksin aktivitesini doğrulamak için
Buz kovası
Işık mikroskobu	Nikon	Eclipse 55i	Hücreleri görselleştirmek için
Nitroselüloz	Fisher	88018	Sondalama için antikorlar yoluyla proteinler
Pipetatörler ve uçlar	Avantor VWR		Reaktifleri dağıtmak için
Güç kaynağı	Bio-Rad		SDS-PAGE'i çalıştırmak ve transferler için
Propidyum iyodür	Biotium	40016	Stok konsantrasyonu 2 mg/mL su içinde
Protein merdiveni	Bio-Rad	161-0373	Proteinlerin moleküler ağırlığını belirlemek için
SDS-PAGE Koşusu Aparat (Mini Protean III)	Bio-Rad	165-3302	Proteinleri boyutlarına göre ayırmak için
Sızdırmazlık bandı	R& D	DY992	Plakaları hücrelerle kapatmak için
Streptolizin O C530A plazmit eki			pBAD-gIII vektörüne klonlanmış (Referans: 7)
Streptolizin O C530A toksin	Laboratuvarı saflaştırılmış		Spesifik aktivite  4.34 x 105 HU/mg
Sallanan kova rotoru	Thermo Fisher	75003607	Hücreleri santrifüjlemek için
V-alt plaka	Greiner Bio-one	651206	Sitotoksisite deneyi için
Vortex	Benchmark	BV1000	Hücreleri karıştırmak için
Western blot görüntüleme sistemi (Chemi-doc)	Bio-Rad		Western blot ile proteinleri görselleştirmek için
Western Blot Transfer Aparatı (Mini Protean III)	Bio-Rad	170-3930	Transferi proteinlerden nitroselüloza
Whatman Filtre kağıdı	GE Healthcare Life Sciences	3030-700	Proteinlerin nitroselüloza transferinde kullanılır
Antikor
Anti-ERK antikoru	Hücre Sinyalleme Teknolojileri	Kedi # 9102S	Tavşan (1:1000 seyreltme)
Anti-lipofosfoglikan (LPG) antikoru	CreativeBioLabs	Cat# WIC79.3	Mouse (1: 1000)
Anti-MEK antikoru	Hücre Sinyal Teknolojileri	Kedi # 9122L	Tavşan (1:1000)
Anti-fare IgG, HRP eşleniği	Jackson Immunoresearch	Kedi # 715-035-151	Eşek (1:10000)
Anti-fosfoERK antikoru	Hücre Sinyal Teknolojileri	Cat# 9101S	Rabbit (1:1000)
Anti-pMEK antikoru	Hücre Sinyal Teknolojileri	Kedi # 9121S	Tavşan (1:1000)
Anti-tavşan IgG, HRP eşleniği	Jackson Immunoresearch	Kedi # 711-035-152	Eşek (1: 10000)
Anti-tubulin antikoru	Sigma Kedi	# T5168	Fare (1: 2000)
Leishmania majör < / em >Genotipler			Reference: 13
Epizomal geri dönüş (spt2-/+SPT2)			Δ spt2::HYG/Δ spt2: PAC / + pXG-SPT2
Serin palmitoiltransferaz alt birim 2 nakavt (< güçlü>spt2< / em >< sup> < / sup>< / güçlü >)			& Delta; spt2::HYG/Δ spt2::P AC
Vahşi tip (WT)			LV39 klonu 5 (Rho/SU/59/P)