Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler kullanılarak biyomühendislik yapılan üç boyutlu kalp dokuları, doğal kardiyak nişin temel yönlerini özetlerken, sağlıklı ve hastalıklı insan miyokardını in vitro incelemek için umut verici modeller olarak ortaya çıkmıştır. Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerden üretilen yüksek içerikli tasarlanmış kardiyak dokuların üretilmesi ve analiz edilmesi için bir protokolü açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tasarlanmış Kardiyak Dokuların Veri Toplamasını ve Model Verimini İyileştirmek için Bir Biyoreaktör Tasarlama
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Kalp yetmezliği, dünya çapında önde gelen ölüm nedeni olmaya devam etmekte ve insan kalbinin daha iyi klinik öncesi modellerine acil bir ihtiyaç yaratmaktadır. Doku mühendisliği, temel bilim kardiyak araştırmaları için çok önemlidir; in vitro insan hücre kültürü, hayvan modellerinin türler arası farklılıklarını ortadan kaldırırken, daha doku benzeri bir 3D ortam (örneğin, hücre dışı matris ve heteroselüler eşleşme ile), in vivo koşulları, plastik Petri kapları üzerindeki geleneksel iki boyutlu kültürden daha büyük ölçüde simüle eder. Bununla birlikte, her model sistem, örneğin özel olarak tasarlanmış biyoreaktörler ve fonksiyonel değerlendirme cihazları gibi özel ekipman gerektirir. Ek olarak, bu protokoller genellikle karmaşıktır, emek yoğundur ve küçük, hassas dokuların başarısızlığından muzdariptir.
Bu makale, doku fonksiyonunun uzunlamasına ölçümü için indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler kullanılarak sağlam bir insan mühendisliği kalp dokusu (hECT) model sistemi oluşturmak için bir süreci açıklamaktadır. Doğrusal şerit geometrisine sahip altı hECT paralel olarak kültürlenir ve her bir hECT, PDMS raflarına bağlı bir çift kuvvete duyarlı polidimetilsiloksan (PDMS) direğinden asılır. Her gönderi, kullanım kolaylığını, verimi, doku tutmayı ve veri kalitesini artıran yeni bir özellik olan siyah bir PDMS kararlı gönderi izleyici (SPoT) ile sınırlandırılmıştır. Şekil, sehimler sonrası sapmaların güvenilir optik takibine izin vererek, mutlak aktif ve pasif gerilimle gelişmiş seğirme kuvveti izlemeleri sağlar. Kapak geometrisi, direklerden kayan hECT'lerden kaynaklanan doku yetmezliğini ortadan kaldırır ve PDMS raf imalatından sonra ikinci bir adımı içerdiklerinden, SPoT'ler, biyoreaktör üretim sürecinde büyük değişiklikler yapılmadan mevcut PDMS post-based tasarımlarına eklenebilir.
Sistem, fizyolojik sıcaklıklarda hECT fonksiyonunun ölçülmesinin önemini göstermek için kullanılır ve veri toplama sırasında stabil doku fonksiyonunu gösterir. Özetle, in vitro uygulamalar için tasarlanmış kalp dokularının biyolojik uygunluğunu, verimliliğini ve titizliğini ilerletmek için temel fizyolojik koşulları yeniden üreten son teknoloji bir model sistemi açıklıyoruz.
Giriş
Tasarlanmış kardiyak doku modelleri, geleneksel iki boyutlu hücre kültürü ile elde edilmesi zor olan doğal kardiyak nişin çeşitli yönlerini özetlemek için çok çeşitli geometriler ve konfigürasyonlarda gelir. En yaygın konfigürasyonlardan biri, dokunun kendi kendine birleşmesini indüklemek ve dokuya tanımlanmış bir ön yük ve ortaya çıkan seğirme kuvvetlerinin bir okumasını sağlamak için her iki ucunda esnek ankrajlar bulunan doğrusal doku şerididir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol, tanımlanmamış bir iPSC hattı olan SkiPS 31.3'ü (orijinal olarak 45 yaşındaki sağlıklı bir erkekten alınan dermal fibroblastlar kullanılarak yeniden programlanmıştır)47
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıdaki protokolü takiben, kardiyomiyositler daha önce grubumuz 9,15 tarafından kullanılan sağlıklı bir iPSC hattından üretildi ve kültürde 8-61 gün sonra hEKT'lere üretildi. Şekil 9A
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Literatürde yayınlanmış çok sayıda lineer mühendislik kardiyak doku modeli vardır ve bunların bazıları Tablo 1'de tanımlanmıştır. Bazı modeller doku kuvvetinin doğrudan ölçülmesini içerir, ancak bunlar tipik olarak yapının ayrı bir kas banyosunaaktarılmasını gerektirir 38. Çoğu model, dokular her iki uçta, en yaygın olarakPDMS direkleri 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 <.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
KDC, Novoheart'ın kurucu ortağı ve Baş Bilim Sorumlusudur ve holding şirketi Medera Biopharmaceutical'da hisse sahibidir. Novoheart, bu çalışmanın finansmanına, planlanmasına veya yürütülmesine katkıda bulunmadı; ancak, çalışma sonuçlarının Novoheart ve Medera üzerinde potansiyel olarak finansal bir etkisi olabilir. Diğer yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar, bu yöntemle ilgili önceki çalışmaları için Dr. Timothy Cashman'a teşekkür eder. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (R01-HL132226 ve K01 HL133424) ve Leducq Vakfı Uluslararası Mükemmellik Ağları Programı (CURE-PLaN) tarafından finanse edilerek desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0,25 mm çap 304 Paslanmaz Çelik Tel | McMaster Carr | 6517K61 | |
| % 0.25 tripsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1.7 mL Mikrotüpler | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm tabaklar (20 mm boyunda) | Corning | 353003 | |
| 10 mL Serolojik Pipet | Drummond | 6-000-010 | |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | steril damıtılmış suda 1:10 seyreltin |
| 10X Modifiye Kartal Orta | Sigma Aldrich | M0275 | |
| 20 - 200 μ L | Mikropipet Eppendorf | 3123000055 | |
| 200 μ L Mikro Pipet Uçları | VWR | 76322-150 | |
| 5 mL Serolojik Pipet | Drummond | 6-000-005 | |
| 50 mL Konik Santrifüj Tüpleri | Falcon | 352070 | |
| 6 cm Petri Kabı | Corning | 353002 | |
| 6 Watt LED Çift Deveboynu Aydınlatıcı | AmScope | LED-6W | |
| 6 Kuyulu Plakalar | Corning | 353046 | |
| 90 derece açılı ayna | Edmund Optics | 45-594 | |
| Akrilik yapıştırma yapıştırıcısı | SCIGRIP | #4 | |
| Ayarlanabilir 10 cm x 10 cm jak | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
| Alüminyum 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
| A-Plan 10X Objektif Lens | ZEISS | 1020-863 | |
| Otoklav Torbaları | Propper | 21002 | |
| B-27 takviyesi | ThermoFisher | 17504044 | |
| B-27 takviyesi (insülinsiz) | ThermoFisher | A1895601 | |
| Tezgah Üstü Santrifüj | Eppendorf | 5810 R | |
| Siyah ABS | Ultimaker | 2,85 mm genişliğinde | |
| Sığır Kollajen I | Gibco | A1064401 CHIR99021 | |
| Tocris | 4423 | ||
| Sınıf II Biyogüvenlik Kabini | Labconco | 3430009 | |
| Şeffaf Akrilik Kaplama | estreetplastics | 1002502436 | 6,25 mm kalınlığında |
| CNC Dik Freze | Haas | VF-1 | |
| İletken Grafit Çubuklar | McMaster Carr | 1763T33 | |
| Diseksiyon mikroskobu | Olympus | SZ61 | |
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium/Ham'ın F-12 Besin Karışımı | ThermoFisher | 11330032 | |
| Etanol | Fisher Scientific | A4094 | Suda %70'e seyreltin |
| EVE Otomatik Hücre sayacı | NanoEntek | E1000 | |
| EVE Hücre Sayma Slaytı | NanoEntek | EVS-050 | |
| Fetal Sığır Serumu | Yaşam Teknolojileri | 10438026 | |
| İnce Kavisli Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11253-25 | |
| Forma Seri II Su Ceketli CO2 İnkübatörü | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "inkübatör". HEPA sınıf 100 filtre |
| Fusion360 yazılımı | Autodesk | AKA "CAD yazılımı" | |
| Cam Hemositometre | Reichert | 1475 | 0.1 mm derinliğinde |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| hESC nitelikli matrigel | Corning | 354277 | AKA "bazal membran matrisi". Dondurulmuş alikotlarda saklayın |
| Yüksek Hızlı CCD Kamera | PixelLINK | P7410 | |
| Ters Mikroskop | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X faz kontrast objektif |
| IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
| LabView Yazılımı | National Instruments | 2016 | |
| Laminer akış temiz tezgah | NuAire | NU-201-330 | hECT fonksiyonel analizi için gerekli |
| Laptop | AsusTek | Strix | Intel Core i & işlemci, CPU 2.8GHz, 16GB RAM |
| Lazer Kesim Makinesi | Epilog | Helix 24 | |
| Büyütme kulaklığı | ExcelBlades | 70020 | İnce manipülasyon gerektiren adımlar için önerilir |
| Matlab | Mathworks | Sürüm 2019b veya üstü | AKA "veri analizi yazılım" |
| Mikro Vannas Makas, 3 mm bıçak | WPI Aletleri | 501839 | |
| Mikroskop Bom Standı | Olympus | SZ2-STU1 | |
| Penisilin-Streptomisin stok çözeltisi | ThermoFisher | 15140122 | 10.000 IU/ml penisilin; 10.000 μ g/ml streptomisin |
| İki değerlikli katyonlar içermeyen fosfat tamponlu salin | Sigma Aldrich | P3813 | Damıtılmış suda 1X ve 10X konsantrasyonlarına seyreltilmiş |
| Pipet Kontrol Cihazı | Drummond | 4-000-100 | |
| PixelLINK Yakalama OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Kamera Yazılımı" |
| Polisülfon | McMaster Carr | 86735K73 | yarı saydam kehribar rengi |
| Politetrafloroetilen (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | Siyah, kalıplı |
| ReLeSR | Kök Hücre Teknolojileri | 5872 | AKA "iPSC ayrışma ortamı" |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 Medya | ThermoFisher | 11875135 | |
| Silikon Kaplama | SMI üretimi | parlak, 0.02 inç kalınlık, durometre 40 | |
| Boyut 10/0 Mavi, Yeşil, Kırmızı ve Sarı Cam Tohum | Boncukları Michael'ın | rengi dayanmalı otoklavlama | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| Kare Nabız Stimülatörünü karıştırmak için kullanılır | Astro-Med / Çim Teknolojileri | S88X | |
| Paslanmaz Çelik Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | daha düşük sertlik nedeniyle paslanmaz olmayan çeliğe tercih edilir |
| Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | AKA "iPSC kültür ortamı" |
| Steril damıtılmış su | ThermoFisher | 5230 | |
| Sylgard 170 - Silikon Elastomer Kapsülleyici Siyah 0,9 kg Kit | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA siyah Polidimetilsiloksan (siyah PDMS) |
| Sylgard 184 - Silikon Elastomer Şeffaf 1 lb Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0,5KG 1,1 LB KIT | AKA Polidimetilsiloksan (PDMS) |
| Sıcaklık kontrollü ısıtmalı kademe | Okolab | H401-HG-SMU | Yüksekliği 10 cm'ye ayarlayın |
| Termoplastik 3D yazıcı | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
| Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
| Tripan Mavi | NanoEntek | EBT-001 | |
| Vakum Odası | Bel-Art Parçaları | F42027-0000 | |
| Değişken Hızlı Mini Şerit Testere | Micro-Mark | 82203 | |
| Değişken Hızlı Minyatür Matkap Presi | Micro-Mark | 82959 | |
| Titreşim İzolasyon Masası | Labconco | 3618000 | |
| Tartı Tekneleri | VWR | 10803-140 | |
| Pençe Silindir Tezgah Kelepçesi | VWR | 97035-528 | AKA vidalı kelepçe |
Kaynaklar
- Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Engineering. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
- Turnbull, I. C., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
Posted by JoVE Editors on 1/10/2024. Citeable Link.
An erratum was issued for: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues. The title was corrected from:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues
to:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
