Method Article

İnsan Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerinde Onkojenik Heterozigot Fonksiyon Kazancı Mutasyonlarının Mühendisliği

DOI:

10.3791/64558

⸱

March 10th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical University of Graz, 2Division of Hematology, Stanford Cancer Institute, Stanford Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Blood Group Serology and Transfusion Medicine, Medical University of Graz

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetik kök hücre biyolojisini ve hematolojik maligniteleri daha iyi incelemek için hematopoetik kök ve progenitör hücrelerdeki (HSPC'ler) somatik mutasyonları sadık bir şekilde modellemek için yeni stratejiler gereklidir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanımını ve çift rAAV donör transdüksiyonunu birleştirerek HSPC'lerde heterozigot fonksiyon kazancı mutasyonlarını modellemek için bir protokol açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşamları boyunca, hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC'ler) somatik mutasyonlar kazanırlar. Bu mutasyonlardan bazıları proliferasyon ve farklılaşma gibi HSPC fonksiyonel özelliklerini değiştirir, böylece hematolojik malignitelerin gelişimini teşvik eder. HSPC'lerin etkili ve kesin genetik manipülasyonu, tekrarlayan somatik mutasyonların fonksiyonel sonuçlarını modellemek, karakterize etmek ve daha iyi anlamak için gereklidir. Mutasyonlar bir gen üzerinde zararlı bir etkiye sahip olabilir ve fonksiyon kaybına (LOF) neden olabilir veya tam tersine, fonksiyonu artırabilir veya hatta işlev kazancı (GOF) olarak adlandırılan belirli bir genin yeni özelliklerine yol açabilir. LOF mutasyonlarının aksine, GOF mutasyonları neredeyse sadece heterozigot bir şekilde ortaya çıkar. Mevcut genom düzenleme protokolleri, bireysel alellerin seçici hedeflemesine izin vermemekte ve heterozigot GOF mutasyonlarını modelleme yeteneğini engellemektedir. Burada, verimli DNA donör şablonu transferi için CRISPR / Cas9 aracılı homoloji yönelimli onarım ve rekombinant AAV6 teknolojisini birleştirerek insan HSPC'lerinde heterozigot GOF hotspot mutasyonlarının nasıl tasarlanacağına dair ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Daha da önemlisi, bu strateji, başarılı bir şekilde heterozig olarak düzenlenmiş HSPC'lerin izlenmesine ve saflaştırılmasına izin vermek için çift floresan bir muhabir sisteminden yararlanmaktadır. Bu strateji, GOF mutasyonlarının HSPC fonksiyonunu nasıl etkilediğini ve hematolojik malignitelere doğru ilerlemesini tam olarak araştırmak için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmiş kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) / Cas9 teknolojisinin geliştirilmesiyle, bilim adamlarının araç setine yeni ve son derece güçlü bir cihaz eklenmiştir. Bu teknoloji, genomun hassas mühendisliğine izin verir ve sadece araştırma amaçlı değil (Hsu ve ark.1'de gözden geçirilmiştir) son derece yararlı olduğunu kanıtlamıştır, ancak daha yakın zamanda 2,3,4 klinik ortamına da başarıyla çevrilmiştir. CRISPR / Cas9 düzenleme stratejileri, bir Cas9 proteininin aktivitesine ve tek kılavuzlu bir RNA'ya (sgRNA) dayanır5,6,7. Konakçı hücrede, Cas9 proteini, DNA'da sgRNA dizisini tamamlayan ve bir DNA çift iplikçik kırılması (DSB) getirecek olan belirli bir bölgeye yönlendirilir. Bir DSB oluşturulduktan sonra, oluşabilecek iki ana ve rakip onarım mekanizması vardır: homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolojiye yönelik onarım (HDR). NHEJ, yerleştirmelere ve silmelere (indels) yol açan hataya eğilimli, ağırlıklı olarak kullanılan bir onarım mekanizmasıdır, oysa HDR, kardeş kromatidini bir onarım şablonu olarak kullanarak, çok hassastır, ancak hücre döngüsü8'in S veya G2 fazı ile sınırlıdır. Genom mühendisliğinde, HDR, Cas9 ile indüklenen DSB'nin her iki DNA ucuyla aynı olan homoloji kolları tarafından kuşatılmış bir donör şablonu sağlayarak DNA'nın hedeflenen modifikasyonu için kullanılabilir (Şekil 1). HDR için kullanılan bağışçı şablonu türü, düzenleme verimliliğini büyük ölçüde etkileyebilir. İnsan HSPC'lerinde genetik mühendisliği için, adeno ilişkili virüs serotip 6 (AAV6) yakın zamanda tek sarmallı DNA şablonlarının 9,10'unun verilmesi için mükemmel bir araç olarak tanımlanmıştır.

CRISPR / Cas9 genom mühendisliği, zararlı mutasyonları düzeltmek için terapötik olarak kullanılabilir11, ancak kanser gelişimini modellemek için DNA'ya patojenik mutasyonlar sokmak için de kullanılabilir12. Lösemi gibi kan kanseri, sağlıklı HSPC'lerde somatik mutasyonların sıralı olarak edinilmesi yoluyla gelişir13,14. Erken genetik olaylar klonal proliferatif bir avantaja yol açarak, belirsiz potansiyele sahip klonal hematopoez (CHIP) ile sonuçlanır15,16. Mutasyonların daha fazla kazanılması sonunda lösemik transformasyona ve hastalığın gelişmesine yol açacaktır. Somatik mutasyonlar, kendini yenilemeyi, hayatta kalmayı, çoğalmayı ve farklılaşmayı kontrol eden genlerde bulunabilir17.

Genom mühendisliği yoluyla bireysel mutasyonların sağlıklı HSPC'lere tanıtılması, bu aşamalı lösemijenik sürecin hassas bir şekilde modellenmesini sağlar. Akut miyeloid lösemi (AML)18,19 gibi miyeloid neoplazmlarda bulunan sınırlı sayıda tekrarlayan mutasyon, bu hastalığı genom mühendisliği araçları kullanılarak özetlenmeye özellikle uygun hale getirmektedir.

Somatik mutasyonlar sadece bir alel (monoallelik/heterozigot mutasyonlar) veya her iki alel (bialelik/homozigot mutasyonlar) üzerinde ortaya çıkabilir ve genin fonksiyonu üzerinde derin etkilere sahip olabilir, bu da fonksiyon kaybına (LOF) veya fonksiyon kazancına (GOF) neden olabilir. LOF mutasyonları, genin azalmış (eğer bir alel etkilenirse) veya tam (her iki alel de etkilenirse) HOF'una yol açarken, GOF mutasyonları genin aktivasyonunun veya yeni fonksiyonunun artmasına neden olur. GOF mutasyonları tipik olarak heterozigot20'dir.

Daha da önemlisi, zigotluğun (hetero- vs homozigot) bir mutasyonu sadık bir şekilde modelleme girişimi için büyük etkileri vardır; Bu nedenle, heterozigot sıcak nokta GOF mutasyonlarını tasarlamak için bir genin sadece bir alelinin hedeflenen manipülasyonu gereklidir. Hataya eğilimli NHEJ, değişken, öngörülemeyen biyolojik sonuçlara yol açabilecek farklı uzunluklarda21 indellere yol açar. Bununla birlikte, NHEJ, bir DSB'nin tanıtılmasından sonra hücreler tarafından kullanılan baskın onarım programı olduğundan, şu anda HSPC'leri manipüle etmek için kullanılan çoğu CRISPR / Cas9 platformu, genetik sonucun22,23'ünü tam olarak tahmin etmeye izin vermemektedir. Buna karşılık, HDR yoluyla genom mühendisliği için rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) vektör tabanlı DNA donör şablonlarının kullanımı ile birlikte bir CRISPR / Cas9 aracılı çift iplikçik kırılmasının (DSB'ler) tanıtılması, insan HSPC'lerinde mutasyonların alele özgü olarak yerleştirilmesine izin verir11,24. Bir mutant ve vahşi tip (WT) dizisinin eşzamanlı entegrasyonu, bireysel aleller üzerindeki farklı floresan muhabirlerle birleştiğinde, heterozigot bir genotip seçmek için gerçekleştirilebilir (Şekil 2). Bu strateji, tekrarlayan, lösemik, heterozigot GOF hotspot mutasyonlarının HSPC fonksiyonu, hastalığın başlaması ve ilerlemesi üzerindeki etkilerini tam olarak karakterize etmek için güçlü bir araç olarak kullanılabilir.

Bu makalede, primer insan HSPC'lerinde tekrarlayan mutasyona uğramış heterozigot GOF mutasyonlarının verimli mühendisliği için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu strateji, heterozigot GOF mutasyonunun prospektif üretimi için WT ve mutant DNA donör şablonları sağlamak üzere CRISPR / Cas9 kullanımını ve çift AAV6 transdüksiyonunu birleştirir. Örnek olarak, calreticulin (CALR) genindeki tekrarlayan tip 1 mutasyonlarının (52 bp delesyonu) mühendisliği25 gösterilecektir. CALR'nin ekzon 9'undaki heterozigot GOF mutasyonu, esansiyel trombositemi (ET) ve primer miyelofibroz (PMF)26 gibi miyeloproliferatif hastalıklarda tekrar tekrar bulunur. CALR, yeni sentezlenen proteinlerin katlanma sürecinde öncelikle kalite kontrol fonksiyonuna sahip endoplazmik retikulum yerleşik bir proteindir. Yapısı üç ana alana ayrılabilir: proteinin şaperon fonksiyonunda yer alan bir amino (N) terminal alanı ve prolin bakımından zengin bir P alanı ve kalsiyum depolama ve düzenleme27,28'de yer alan bir C-alanı. CALR mutasyonları +1 çerçeve kaymasına neden olur, bu da yeni bir genişletilmiş C-terminal ucunun transkripsiyonuna ve endoplazmik retikulum (ER) retansiyon sinyalinin (KDEL) kaybına yol açar. Mutant CALR'nin trombopoietin (TPO) reseptörünü bağladığı gösterilmiştir, böylece artmış proliferasyon ile TPO'dan bağımsız sinyalleşmeye yol açmıştır29.

figure-introduction-1
Resim 1: NHEJ ve HDR onarımı. DNA'da çift sarmallı bir kırılmanın ortaya çıkmasını takiben NHEJ ve HDR onarım mekanizmalarının basitleştirilmiş şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-introduction-2
Şekil 2: Bialelik HDR düzenleme stratejisine şematik genel bakış. Donör şablonlarının hedeflenen alellere entegrasyonunu ve ardından bunların işleyen mRNA'lara çevrilmesini gösteren şematik gösterim. Turuncu noktalı kutular, sol homoloji koluna (LHA) ve sağ homoloji koluna (RHA) karşılık gelen bölgeleri gösterir. HA'ların ideal boyutu her biri 400 bp'dir. Yeşil noktalı kutu, SA dizisine karşılık gelen bölgeyi temsil eder. SA'nın boyutu 150 bp'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, sağlıklı donör kaynaklı CD34 + HSPC'lerin kullanılmasını gerektirir ve yerel kurumsal inceleme kurullarından (IRB) etik onay ve imzalı bilgilendirilmiş onam gerektirir. Bu protokolde kullanılan CD34 + HSPC'ler, term doğumların göbek kordon kanından (UCB) izole edildi (>34 gebelik haftası). Doğumdan önce annelerden bilgilendirilmiş onam alındı ve UCB'nin toplanması için etik onay (IRB onayı: 31-322 ex 18/19) Graz Tıp Üniversitesi'nden alındı. Bu protokolde kullanılan malzemelerin tam listesi Malzeme Tablosunda bulunabilir.

1. sgRNA tasarımı ve kesme verimliliklerinin değerlendirilmesi

  1. İstenilen mutasyonun yerini ve doğru transkripti çevrimiçi bir veritabanı aracında arayın (örneğin, COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic).
  2. Bir sgRNA tasarım aracı kullanarak mutasyona bitişik (ekzonik hedefleme) veya önceki intronda (intronik hedefleme) bir sgRNA seçin. Bu protokolde, Benchling'in çevrimiçi aracı kullanılır. sgRNA tasarımı için olası çevrimiçi araçların bir listesi için Malzeme Tablosu'na bakın.
  3. DNA Dizisi > DNA Dizilerini İçe Aktar > Veritabanlarından İçe Aktar > + (oluştur) seçeneğini belirleyin. İstediğiniz geni girin, örneğin CALR ve tür olarak insanı seçin > Arama > Doğru transkripti seçin (örneğin, CALR-201 -ENST00000316448) > İçe Aktarma. DS molasının tanıtılacağı ilgi alanını seçin (örneğin, intron 7).
  4. Ekranın sağ tarafındaki CRISPR seçeneğini belirleyin ve Kılavuzları tasarla ve analiz et'i seçin. Tek kılavuz seçin, kılavuz uzunluğunu 20 bp'ye ve SpCas9 (NGG) ile düzenlemek için PAM sırasına göre tutun.
  5. Yüksek hedef içi puana (istenen lokusta düzenleme yapma şansı yüksek) ve yüksek hedef dışı puana (istenmeyen lokuslarda düşük düzenleme şansı) sahip bir kılavuz seçin. En iyi performans gösteren sgRNA'yı bulmak için test etmek üzere en az üç kılavuz seçin. SgRNA'yı ticari bir satıcıdan kimyasal olarak modifiye edilmiş sentetik bir sgRNA olarak sipariş edin.
    NOT: Bu aşamada, ilk elek için az miktarda sentetik sgRNA sipariş etmeniz önerilir. İyi performans gösteren bir sgRNA tanımlandıktan sonra, seçilen sgRNA'nın daha büyük bir sırası ile devam edin.
  6. Çözme 2 x 10 5-5 x 105 CD34 + HSPC'ler. Hücreleri% 1 antibiyotik (örneğin, penisilin / streptomisin) ile desteklenmiş 10 mL önceden ısıtılmış RPMI1640'a aktarın.
    NOT: En iyi ve en tekrarlanabilir sonuçları elde etmek için %>90 saflıkta CD34+ HSPC'ler kullanılmalıdır.
  7. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) 350 x g'da santrifüj. Hücreleri bir hemositometre ile sayın ve% 0.2 penisilin / streptomisin (P / S), 100 ng / mL trombopoietin (TPO), 100 ng / mL kök hücre faktörü (SCF), 100 ng / mL FMS benzeri tirozin kinaz 3 ligand (FLT3L), 100 ng / mL interlökin-6 (IL-6), 35 nM UM171 ve 0.75 μM StemRegenin1 (SR1) ile desteklenmiş SFEM II ortamındaki hücreleri 2.5 x 105 hücre / mL konsantrasyonuna kadar askıya alın. 48 saat -72 saat boyunca 37 °C / %5 CO 2'de inkübe edin.
    NOT: Ortamın tamamı bundan böyle HSPC saklama ortamı olarak anılacaktır.
  8. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve hücreleri sayın. Tripan mavisi dışlama ile hücre canlılığını kontrol edin.
    1. Başlamadan önce, transfeksiyon sistemini açın ve küvet seçeneğini seçin. HSPC'ler için uygun programı ve nükleofeksiyon çözümünü seçin (bkz. 2 x 10 5 ile5 x 10 arasında6 hücre bir 100 μL küvette çekirdeklendirilebilir. WT kontrolü olarak kullanılmak üzere 48 saat boyunca kültürde tutmak için az sayıda hücreyi (örneğin, 1 x 105-2 x 105) bir kenara koyun.
  9. RNP kompleksini hazırlayın. 1,5 mL'lik bir tüpte, 15 μg Cas9 ve 8 μg sgRNA (molar oran 1: 2.5) ekleyin ve bir ısıtma bloğunda 10 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
  10. RNP kompleksi inkübe edilirken, hücreleri RT'de 350 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve bir pipet kullanarak süpernatantı atın. Hücreleri 100 μL nükleofeksiyon çözeltisi içinde askıya alın.
  11. Hücreleri RNP kompleksi ile karıştırın ve küvete aktarın. Transfer sırasında oluşmuş olabilecek olası hava kabarcıklarını çıkarmak için küvete hafifçe dokunun.
  12. Küvetin transfeksiyon sisteminin tutucusuna yerleştirilmesi ve DZ-100 programı ile hücrelerin elektroporasyonu yapılır.
  13. Elektroporasyondan hemen sonra, P/S olmadan 400 μL önceden ısıtılmış HSPC tutma ortamı ekleyin.
  14. İnce transfer pipetine sahip hücreleri, P/S olmadan önceden ısıtılmış HSPC tutma ortamı içeren bir kültür plakasına aktarın. hücre numarasına bağlı olarak, 0,25 x 10 6 ile 1 x 106 hücre/mL arasında bir yoğunluğa ulaşmak için uygun bir kültür plakası (24-, 12- veya6-well plate) kullanın.
  15. Plakayı inkübatöre 37 °C / % 5 CO2'de aktarın. Çekirdeklenmiş hücreleri 6-8 saat boyunca inkübe edin.
  16. 6-8 saat sonra, eski ortamı çıkarın ve P / S ile desteklenmiş taze önceden ısıtılmış HSPC tutma ortamı ile değiştirin. hücreleri 2.5 x 10 5 ile5 x 105 arasındaki bir konsantrasyonda askıya alın ve bir hücre kültürü plakasına (24-, 12 veya 6 delikli plaka) aktarın. Hücreleri 37 ° C / % 5 CO 2'de 48 saat boyuncainkübe edin.
  17. 2 x 10 5 hücre hasat edin veRT'de 5 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj yapın. Başlamadan önce, ısıtma bloklarını 65 ° C ve 98 ° C'ye ayarlayın.
  18. Süpernatantı atın ve hücreleri 1,5 mL'lik bir tüpte 1 mL'lik 1x DPBS'de askıya alın. RT'de 5 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj.
  19. Süpernatantı atın ve hücreleri 50 μL DNA ekstraksiyon çözeltisinde askıya alın. 15 s. için vorteks.
  20. 65 °C'de 6 dakika boyunca inkübe edin. 15 s vorteks ve 98 ° C'de 2 dakika kuluçkaya yatırın.
  21. DSB bölgesini, merkezdeki DSB ile yaklaşık 400-600 bp'lik bir amplikon üreten primerleri kullanarak PCR ile yükseltin. PCR reaksiyonu için 0.5-1 μL ekstrakte edilmiş DNA kullanın.
    NOT: DNA ekstraksiyon çözeltisinin bileşimi nedeniyle, DNA konsantrasyonları spektrofotometri ile doğru bir şekilde ölçülemez.
  22. PCR ürününü DNA merdiveni ile 100 V'ta 100 V'ta % 1,5'lik agaroz jeli üzerinde 45-60 dakika boyunca çalıştırın. Jeli mavi bir ışık veya UV transilluminator üzerine yerleştirin.
  23. Üreticinin talimatlarına göre piyasada satılan bir kit kullanarak jelden doğru boyuttaki DNA bandını çıkarın (bkz.
  24. PCR'den ileri astar veya ters primer kullanarak numuneleri Sanger dizilimi ile sıralayın. 400-600 bp uzunluğundaki PCR ürünleri için, toplam 15 μL hacimde 5 ng / mL'lik bir konsantrasyonla dizileme için 75 ng DNA gereklidir.
  25. Sıralama dosyalarını, sgRNA tarafından üretilen ekleme ve silme işlemlerini tanımlayarak düzenleme verimliliğini hesaplamak için tasarlanmış bir programa yükleyerek sgRNA'ların düzenleme verimliliğini analiz edin. Devam etmek için en iyi performans gösteren sgRNA'yı seçin.
    NOT: Özel çevrimiçi araçlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Bu analiz, transfekte edilmiş ve WT HSPC'lerin .ab1 dosyalarını, sgRNA dizisini ve PAM dizisini gerektirir.

2. Homolojiye yönelik onarım (HDR) vektör yapısı

  1. HDR şablon tasarımı
    NOT: İki HDR şablonu tasarlanmalıdır: WT dizisi için bir şablon ve mutasyona uğramış dizi için bir şablon.
    1. İstenilen genin genomik dizisini ve kodlama dizisini (CDS) moleküler klonlama için uygun bir yazılıma aktarın ( özel araçlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir). Genomik dizi dosyasından, DSB'nin 5' ucunda ideal olarak 400 bp seçerek sol homoloji kolunu (HA) tasarlayın. Bu sırayı yeni bir dosyaya yapıştırın.
    2. Bir intron sgRNA ile hedeflenirse, bir ekleme alıcısı (SA) dizisinin dahil edilmesi gerekir. Hedeflenen intron'un son 150 bp'sini seçin ve sol HA'dan sonra yapıştırın. Ekzon doğrudan hedeflenmişse, bu dizi gerekli değildir (Şekil 3).
    3. CDS dosyasından, ilgilendiğiniz cDNA'yı seçin. Bir ekzonik dizinin hedeflenmesi durumunda, cDNA'nın DSB bölgesinin hemen aşağısında başladığından ve ilgili genin aşağıdaki ekzonlarını ve durdurma kodonunu içerdiğinden emin olun. Bir intron hedeflenirse, cDNA'nın aşağıdaki ekzonun ilk kodonu ile başladığından emin olun. cDNA'yı kodon ile optimize edin ve SA dizisinden sonra yerleştirin. Bu amaçla özel çevrimiçi araçlar kullanın (Malzeme Tablosu).
    4. İlgilenilen cDNA'dan sonra 3' poliadenilasyon (PolyA) sinyali ekleyin (örneğin, SV40 veya bGH) (Tablo 1). PolyA'yı takiben, floresan protein için bir promotör dizisi (örneğin, dalak odağı oluşturan virüs [SFFV] veya poliubikitin C [UBC], Tablo 1) ekleyin.
    5. Floresan proteini için diziyi ekleyin (yani, GFP, BFP veya mCherry). İkinci fakat farklı bir PolyA sinyali ekleyin.
      NOT: Farklı bir PolyA dizisinin eklenmesi, plazmidin bakteriyel rekombinasyonu veya şablondaki iki özdeş dizi nedeniyle dizi hizalaması ile ilgili sorunlar gibi sorunları önleyecektir.
    6. Genomik dizi dosyasından, DSB'nin 3' ucunda ideal olarak 400 bp seçerek doğru HA'yı tasarlayın. Bu sırayı ikinci PolyA'dan sonra ekleyin.
    7. Tüm kalıbın bir kopyasını oluşturun ve istenen mutasyonun dizisini içerecek şekilde ilgili cDNA'yı değiştirin.
    8. Floresan proteinini farklı bir floresan proteini ile değiştirin. Örneğin, WT şablonu için GFP kullanılmışsa, mutant şablon için BFP veya mCherry ile değiştirin. HDR şablonlarını oluşturun ve pAAV-MCS plazmidine (veya diğer uygun omurgalara) klonlayın.
      NOT: Montaj için gerekli parçalar PCR ile üretilebilir veya ticari olarak sipariş edilebilir ve komşu parçalarıyla örtüşen diziler içermesi gerekir. İlgilenilen mutasyon bir nokta mutasyonu, küçük bir ekleme veya küçük bir silme ise, mutasyona uğramış cDNA, WT cDNA'yı içeren HDR şablonunda bölgeye yönelik bir mutagenez gerçekleştirilerek PCR tarafından üretilebilir.
    9. Isı şoku yöntemini kullanarak yetkin Escherichia coli'yi monte edilmiş ürünle dönüştürün. Başlamadan önce, bakterileri 10 dakika boyunca buz üzerinde çözülmesi için yerleştirin.
    10. Toplanan ürünlerden 2 μL'yi 50 μL bakteriye ekleyin. İçeriği hafifçe hafifçe vurarak karıştırın.
    11. Örnekleri 30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Numuneleri 30 s için 42 °C'ye ayarlanmış bir termobloğa aktarın.
    12. Numuneleri 5 dakika boyunca buz üzerinde aktarın. 450 μL oda sıcaklığında SOC ortamı ekleyin ve numuneleri 1 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    13. Numuneleri ampisilin içeren LB agar plakalarına yayın. Her numune için, toplanabilen tek kolonili LB agar plakaları elde etmek için bakteri çözeltisinin üç farklı seyreltisinden (seyreltilmemiş, 1: 5 ve 1: 10) 100 μL'lik bir miktar yayın. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    14. Ertesi gün, numune başına üç koloni seçin. Kolonileri, ampisilin ile desteklenmiş 4 mL LB ortamı içeren kapaklı 15 mL tüplere aktarın ve gece boyunca 37 ° C'de bir çalkalayıcıda inkübe edin.
    15. Her koloniden gelen bakteriyel çözeltinin Aliquot 500 μL'si ve daha sonra kullanmak üzere buzdolabında saklayın. Plazmid DNA'sını üreticinin talimatlarına göre çıkarmak için mini bir hazırlık yapın.
    16. Plazmidlerin doğru şekilde monte edildiğini onaylamak için örnekleri Sanger dizilemesi için gönderin. Kesintisiz dizi onayı sağlamak için plazmid boyunca dağılmış yeterli sayıda primer kullanın, ideal olarak her bölgeyi ileri ve geri okumalarla iki kez kaplayın.
    17. Doğru şekilde monte edilmiş plazmidi içeren bakteriyel çözeltinin 200 μL'sini, ampisilin ile desteklenmiş 200 mL LB ortamına ekleyin ve 37 ° C'de gece boyunca bir çalkalayıcıda inkübe edin.
    18. Plazmid DNA'sını üreticinin talimatlarına göre çıkarmak için bir midi veya maxi hazırlığı gerçekleştirin. Plazmid DNA'sını -20 °C'de saklayın.
  2. Rekombinant AAV6 preparatı
    NOT: İki ayrı AAV6 hazırlığının gerçekleştirilmesi gerekecektir: biri WT HDR şablonuna sahip rAAV6 için, diğeri mutasyona uğramış HDR şablonuna sahip rAAV6 için. Bu bölümde, yalnızca bir virüsün hazırlanması için gereken adımlar açıklanmaktadır.
    1. HEK293T hücrelerini çözün, hücreleri% 10 FBS,% 1 P / S ve 25 mM HEPES ile desteklenmiş 10 mL önceden ısıtılmış DMEM'e aktarın ve 5 dakika boyunca RT'de 350 x g'de santrifüj yapın.
    2. Hücreleri 1 x 105 hücre / mL konsantrasyonda askıya alın ve uygun bir şişeye (örneğin, 175cm2'lik bir şişe) aktarın. Şişeyi 37 °C / % 5 CO2'de bir inkübatöre aktarın.
      NOT: HEK293T hücreleri, hücrelerin tamamen iyileşmesini ve yeterli sayıda hücre elde etmesini sağlamak için önceden çözülmelidir (bir virüsün üretimi için 11 x 107 hücre gereklidir). Hücrelerin en az üç pasajdan sonra kullanılması ve hücrelerin 20 pasajın altında tutulması önerilir. HEK293T hücreleri haftada üç kez bölünmelidir. Hücreleri korurken, bunlar% 70-80 akıcılığı geçmemelidir. AAV preparatında kullanılan DMEM ayrıca L-glutamin ve sodyum piruvat ile desteklenmelidir.
    3. Hücreleri 50 mL'lik bir tüpte toplayın ve 5 dakika boyunca RT'de 350 x g'de santrifüj yapın.
    4. Hücreleri% 10 FBS,% 1 P / S ve 25 mM HEPES ile desteklenmiş 20 mL DMEM'de askıya alın ve bir hemositometre ile sayın. Ölü hücre dışlaması için tripan mavisi kullanın.
    5. 175 cm2'lik bir şişede FBS, %1 P/S ve 25 mM HEPES ile desteklenmiş 20 mL DMEM'de tohum 3 x 106 hücre. Bir virüsün üretimi için en az dört adet 175cm2 şişe hazırlayın. Hücreleri 3 gün boyunca 37 °C / % 5 CO2'de inkübe edin.
      NOT: Bu adım, hücrelerin hafta sonu boyunca genişlemesine izin verdiği için en iyi Cuma günü gerçekleştirilir.
    6. HEK293T hücrelerini toplayın ve sayın.
    7. Virüslerden birinin hazırlanması için, her biri% 10 FBS,% 1 P / S ve 25 mM HEPES ile desteklenmiş 20 mL DMEM'de 11 x 106 HEK293T içeren on adet 150 mm'lik tabak hazırlayın.
    8. Bulaşıkları inkübatöre 24 saat boyunca 37 °C / % 5 CO2'ye yerleştirin. Eski ortamı dikkatlice atın ve% 10 FBS, 25 mM HEPES ve 1 mM sodyum bütirat ile desteklenmiş 20 mL antibiyotiksiz DMEM ile değiştirin. Devam etmeden önce, hücrelerin akıcılığının% 80'in üzerinde olmadığını kontrol edin.
    9. Transfeksiyon karışımlarını içerecek iki adet 15 mL tüp hazırlayın. Tüp 1'e 5 mL azaltılmış serum ortamı, 60 μg rAAV6 mutasyona uğramış HDR plazmid ve 220 μg pDGM6 (yardımcı plazmid) ekleyin. Tüp 2'ye, 5 mL indirgenmiş serum ortamı ve 1120 μL 1 mg / mL polietilenimin çözeltisi (PEI, transfeksiyon reaktifi) ekleyin.
    10. Tüp 2'nin içeriğini Tüp 1'e ekleyin ve 30 saniye boyunca vorteks. DNA'nın PEI misellerine uygun şekilde kapsüllenmesini sağlamak için RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Çözeltiyi 20 dakikadan fazla tutmayın.
    11. Her bir kaba damla damla 1.1 mL çözelti dikkatlice ekleyin ve yavaşça döndürerek dağıtın. Bulaşıkları inkübatöre 48 saat boyunca 37 °C / % 5 CO2'ye yerleştirin.
    12. 48 saat sonra, her yemeğe 250 μL 0,5 M EDTA ekleyin ve bulaşıkları 10 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Hücreleri tabakta yıkayarak toplayın ve 500 mL'lik bir santrifüj tüpüne veya birden fazla 50 mL'lik tüpe aktarın.
    13. 4 °C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj. Süper natantı atın. Süpernatanın tamamen çıkarılmasını sağlamak için, 4 ° C'de 1 dakika boyunca 2.000 x g'de tekrar santrifüj yapın.
    14. Kalan süpernatan olanları atın. Herhangi bir artık süpernatant, virüsün saflaştırılmasını bozabilir.
    15. Peleti vorteks yaparak gevşetin ve üreticinin talimatlarına göre bir AAV saflaştırma kiti kullanarak virüsü çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız). Alternatif olarak, iyodiksanol gradyanı ultrasantrifüjleme30,31 ile ekstraksiyon gerçekleştirin.
    16. Saflaştırılmış virüsü Aliquot ve -80 ° C'de saklayın. Optimal transdüksiyon koşullarını belirlemek için AAV'yi işlevsel olarak titre edin veya AAV titresini dijital damlacık PCR (ddPCR)32 ile ölçün.
    17. rAAV6 WT HDR plazmidinin hazırlanması için bu işlemi tekrarlayın.
  3. ddPCR ile AAV titrasyonu
    1. Başlamadan önce, ısıtma bloklarını 65 ° C ve 98 ° C'ye ayarlayın.
    2. Virüsün 5 μL'sine 15 μL DNA ekstraksiyon çözeltisi ekleyerek viral DNA'yı çıkarın. 15 s. için vorteks.
    3. 65 °C'de 6 dakika boyunca inkübe edin. 15 s. için vorteks. 98 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. ddPCR için nükleaz içermeyen (nf) H2O ile seri seyreltmeleri (1:400, 1:40.000, 1:160.000, 1:640.000) hazırlamak için ekstrakte edilmiş DNA'yı (viral DNA'nın 1:4 seyreltilmesidir) kullanın.
      NOT: ddPCR hemen gerçekleştirilmeyecekse, seyreltmeler -20 ° C'de saklanabilir.
    5. ddPCR için seyreltmelerden üçünü seçin. Kullanılacak seyreltmenin seçimi, virüsün konsantrasyonuna bağlıdır. Tercihen, makinenin algılama sınırı içindeki en iyi seyreltmeyi bulmak için üç farklı seyreltme (örneğin, 1:40.000, 1:160.000 ve 1:640.000) kullanın.
    6. Çalışırken reaktifleri buz üzerinde tutun. Bir ana karışım hazırlayın (tüm numuneler kopyalar halinde ölçülecektir). Her reaksiyon için aşağıdakileri hazırlayın: Problar için 12,5 μL ddPCR Supermix, dUTP yok, 1,25 μL PrimeTime Std qPCR Testi, AAV-ITR (bkz. Malzeme Tablosu) ve 6,25 μL nf-H2O.
    7. 5 μL DNA'yı 20 μL ana karışımla karıştırın. Bunu 1:40.000, 1:160.000 ve 1:640.000 seyreltmeler için gerçekleştirin.
    8. Kartuş tutucusuna bir kartuş yerleştirin. Yağ olarak adlandırılan sıradaki problara 70 μL damlacık üretim yağı ekleyin. Herhangi bir kabarcık oluşturmamaya dikkat edin.
    9. Örnek olarak adlandırılan satıra örnek hacminin 20 μL'sini ekleyin. Herhangi bir kabarcık oluşturmamaya dikkat edin.
    10. Kartuşu contayla kapatın ve damlacık jeneratörüne yerleştirin. Makinedeki başlat düğmesine basarak damlacıkları üretin, contayı çıkarın ve çok kanallı bir pipetle üretilen damlacıkların 40 μL'sini 96 delikli bir plakaya dikkatlice aktarın. Damlacıkların ve hava kabarcıklarının tahrip olmasını önlemek için yavaşça çalışın.
    11. PCR plaka sızdırmazlık elemanını kullanarak 96 delikli plakayı delici folyo (yukarı bakan kırmızı şerit) ile kapatın. Plakayı bir termosikletçiye yerleştirin.
    12. Ses seviyesini 40 μL'ye, kapak sıcaklığını 105 °C'ye ve rampa hızlarını 2 °C/s'ye ayarlayın. PCR programını Tablo 2'de açıklandığı gibi çalıştırın.
    13. Damlacık okuyucuyu kullanmadan 30 dakika önce açın. Yazılımı masaüstünde açın.
    14. Plaka düzenini girin ve deneme sekmesinde ABS'yi ve Supermix sekmesinde ddPCR Supermix'i seçin. Ardından, önce PRIME'ye basın, ardından sistemi başlatmak için yazılımdaki FLUSH SYSTEM'e tıklayın.
    15. Plakayı okuyucuya girin. Çalıştırmayı başlatın ve tamamlandığında, verileri elektronik tablo olarak sonraki analizler için CSV dosyası olarak dışa aktarın.
      NOT: Yazılım tarafından üretilen sayılar, μL başına genom kopyalarıdır (GC). Bunların seyreltme faktörleri ile çarpılması gerekir: GC / μL x 5 (ana karışımdaki DNA'nın seyreltilmesi) x ilk seyreltme (yani, 40.000 veya 160.000).

figure-protocol-1
Şekil 3: CRISPR/Cas9 HDR knock-in sırasında intronic ve ekzonik hedeflemeye şematik genel bakış. CRISPR/Cas9 HDR knock-in için intronic ve ekzonik hedefleme stratejileri arasında şematik karşılaştırma. (A) İntronik hedefleme sırasında, DNA'nın bir intronunda çift sarmallı bir kırılma meydana gelir. HDR şablonu bir LHA, cDNA dizisi ve RHA'dan oluşur. İntronik hedefleme, ek olarak, 3' ekleme bölgesini, dal noktasını ve polipirimidin sistemini içeren bir dilim alıcısının varlığını gerektirir. Bu, doğru eklemeyi sağlar. Yeşil noktalı kutu, SA dizisine karşılık gelen bölgeyi temsil eder. SA'nın boyutu 150 bp'dir. (B) Ekzonik hedefleme, doğrudan ekzonda çift sarmallı bir kırılmanın üretilmesine dayanır. HDR şablonu bir LHA, cDNA dizisi ve RHA'dan oluşur. Turuncu noktalı kutular, LHA ve RHA'ya karşılık gelen bölgeleri gösterir. HA'ların ideal boyutu her biri 400 bp'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Organizatör
AdUzunlukTarif
cesaret492 bgDalak Odağı Oluşturan Virüs destekleyicisi. Güçlü memeli destekçisi. Yapısal olarak ifade edilir
UBC400 bgİnsan ubikitin C geninden türetilen promotör. Yapısal olarak ifade edildi.
cesaret508 bgSitomegalovirüsten türetilen promotör. Arttırıcı bir bölge içerebilir. Yapısal olarak ifade edildi. Güçlü memeli destekçisi. Susturulabilir.
EF-1a1182 bgİnsan ökaryotik translasyon uzama faktörü 1 alfa promotörü. Yapısal olarak ifade edildi. Güçlü memeli destekçisi.
EFS200-300 bpEF-1 alfa intronsuz kısa form
cesaret584 bgCMV erken arttırıcı (C), tavuk beta aktin promotörü (A) ve tavşan beta-globin geni (G) için ek alıcı içeren hibrit memeli promotörü. Yapısal olarak ifade edildi.
Poliadenilasyon (PolyA) sinyalleri
KısaltmaUzunlukTarif
SV40 PoliA82-122 bgSimian virüsü 40 poliadenilasyon sinyali
bGH PoliA224 bgSığır büyüme hormonu poliadenilasyon sinyali
rbGlob PoliA56 bgTavşan beta globin poliadenilasyon sinyali

Tablo 1: Promotörler ve poliadenilasyon sinyalleri.

AdımSıcaklıkSaatDöngü
Enzim aktivasyonu95°C10 dakika1 adet
Denatürasyon94°C30 saniye42x
Tavlama60°C1 dakika
Uzantı72°C30 saniye
Enzim deaktivasyonu98°C10 dakika1 adet
Tutmak4°C∞

Tablo 2: Dijital damlacık PCR programı.

3. HSPC'lerin düzenlenmesi

  1. HSPC'lerin transfeksiyonu ve transdüksiyonu
    1. CD34 + HSPC'leri çözün ve hücreleri, 10 dakika boyunca RT'de 350 x g'de% 1 P / S. Santrifüj ile desteklenmiş 10 mL önceden ısıtılmış RPMI'ye aktarın.
    2. HSPC tutma ortamındaki hücreleri 2.5 x 105 hücre / mL konsantrasyonuna askıya alın ve 48 saat -72 saat boyunca 37 °C / % 5 CO 2'de inkübe edin.
    3. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın. Hücreleri sayın ve tripan mavisi dışlama ile hücre canlılığını kontrol edin. 2 x 10 5 ile5 x 10 arasında6 hücre tek bir küvette çekirdeklendirilebilir. Hesaplanan hücre numaranıza bağlı olarak uygun sayıda küvet hazırlayın.
    4. RNP kompleksini hazırlayın. 1,5 mL'lik bir tüpte, 15 μg Cas9 ve 8 μg sgRNA (molar oran 1: 2.5) ekleyin ve bir ısıtma bloğunda 10 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
    5. RNP kompleksi inkübe edilirken, hücreleri 5 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.
    6. Hücreleri 100 μL nükleofeksiyon çözeltisi içinde askıya alın. Hücreleri RNP kompleksi ile karıştırın ve küvete aktarın.
    7. Transfer sırasında oluşmuş olabilecek artık hava kabarcıklarını çıkarmak için küvete hafifçe dokunun.
    8. Küvetleri transfeksiyon sisteminin tutucusuna yerleştirin ve hücreleri daha önce sgRNA tasarım bölümünde açıklandığı gibi elektroporat yapın.
    9. Elektroporasyondan hemen sonra, P/S olmadan 400 μL önceden ısıtılmış HSPC tutma ortamı ekleyin ve ince transfer pipeti olan hücreleri, P/S olmadan 500 μL önceden ısıtılmış HSPC tutma ortamı içeren bir doku kültürü plakasına aktarın. hücre numarasına bağlı olarak, 0,25 x 10 6 ile 1 x 10 6 hücre/mL arasında bir yoğunluğa ulaşmak için uygun bir kültür plakası (24-, 12- veya6-well plate) kullanın. Plakayı inkübatöre 37 °C / % 5 CO2'de aktarın.
    10. Dondurulmuş rAAV'leri içeren şişeleri buz üzerinde çözün. Her rAAV6'nın optimal miktarını hücre süspansiyonuna pipetleyerek hücreleri dönüştürün. Yüksek iletim verimliliği elde etmek için elektroporasyondan sonraki 20-30 dakika içinde transdüksiyonu gerçekleştirin.
      NOT: Her virüsün optimum konsantrasyonu (WT HDR şablonu için bir virüs ve mutasyona uğramış HDR şablonu için başka bir ayrı virüs) deneysel olarak belirlenmelidir. Genellikle, 5.000-10.000 GC / hücre (örneğin, 1 x 106 hücre için 5 x 109 GC) yüksek transdüksiyonla sonuçlanır.
    11. Hücre süspansiyonunu pipetle nazikçe karıştırın. Dönüştürülmüş hücreleri 37 °C / % 5 CO 2'de 6-8 saat boyuncainkübe edin. 6-8 saat sonra, hücreleri bir tüp içinde toplayın ve 5 dakika boyunca RT'de 350 x g'de santrifüj yapın.
    12. Eski ortamı atın ve P / S ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış taze HSPC tutma ortamı ile değiştirin.
    13. Hücreleri 2.5 x 10 5-5 x 105 hücre / mL arasındaki bir konsantrasyonda askıya alın ve dokuyla işlenmişbir hücre kültürü plakasına (24-, 12- veya 6-well plate) aktarın. Sıralamaya geçmeden önce hücreleri 48 saat boyunca 37 °C / % 5 CO2'de inkübe edin.
  2. Heterozigot GOF mutasyonunu taşıyan mühendislik HSPC'lerinin akış sıralaması
    1. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 5 dakika boyunca RT'de 350 x g'de santrifüj yapın. Süpernatanı çıkarın, hücreleri% 0.1 BSA içeren 1 mL DPBS'de askıya alın ve 5 dakika boyunca RT'de 350 x g'de tekrar santrifüj yapın.
    2. Süpernatantı atın ve hücre numarasına bağlı olarak hücreleri uygun bir DPBS + % 0.1 BSA hacminde askıya alın.
      NOT: Sıralayıcının tıkanma riskini azaltmak için hücrelerin minimum 200 μL hacimde askıya alınması ve 1 x 107 hücre/mL'yi geçmemesi önerilir.
    3. Hücreleri bir kapakla donatılmış steril bir FACS tüpüne aktarın. Canlı / ölü hücre dışlaması için hücre süspansiyonuna 7-AAD veya başka bir canlılık boyası (floresan proteinleriyle uyumluluklarına bağlı olarak) ekleyin.
    4. Floresan muhabir proteinleri için çift pozitif olan canlı hücreleri, 200 μL HSPC tutma ortamı içeren bir toplama tüpüne ayırın.
      NOT: Sıralama prosedürü sırasında uygun geçişi sağlamak için yalnızca AAV'lerle dönüştürülen hücrelerden oluşan uygun kontroller eklenmelidir.
    5. Sıralanmış hücreleri RT'de 350 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve kültürde daha fazla genişleme için HSPC tutma ortamındaki hücreleri 2.5 x 105 hücre / mL konsantrasyonunda askıya alın veya hücreleri doğrudan fonksiyonel testler için kullanın.

4. Başarılı gen düzenlemesinin doğrulanması

  1. Genomik DNA ekstraksiyonu
    1. Başlamadan önce, ısıtma bloklarını 65 ° C ve 98 ° C'ye ayarlayın. 2 x 105 genom tarafından düzenlenmiş ve sıralanmış saflaştırılmış hücreleri hasat edin ve 5 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj yapın.
    2. Daha önce açıklandığı gibi gDNA'yı ayıklayın. DNA çözeltisini doğrudan PCR için kullanın veya -20 ° C'de saklayın.
  2. Giriş-Çıkış PCR
    1. 5' yerleştirme bölgesini yükseltmek için iki primer tasarlayın (Şekil 4A): primer ileri 1, sol homoloji kolunun dışındaki genomik lokusu hedefler; astar ters 2, entegre diziyi hedefler.
    2. Giriş-çıkış PCR için, reaksiyon başına aşağıdaki PCR karışımını hazırlayın:
      10 μL PCR Master Mix (2x; bkz.
      1 μL ileri astar 1 (10 μM stok)
      1 μL astar ters 2 (10 μM stok)
      Ekstrakte edilmiş DNA'nın 0.5-1.0 μL
      Nükleaz içermeyenH2O, 20 μL'lik son hacme kadar
      NOT: Birden fazla reaksiyon için, pipetleme hatalarını hesaba katmak üzere fazladan bir reaksiyon içeren bir ana karışım hazırlanması önerilir. Alay ile muamele edilmiş bir örnekten şablon olmayan bir kontrol ve şablon DNA eklemek önemlidir.
    3. PCR reaksiyonlarını uygun termal döngü programı ile çalıştırın (üreticinin talimatlarına bakın).
      NOT: Öncelikle optimum tavlama sıcaklığı için astar çiftinin test edilmesi önerilir. Bu, Tm'yi hesaplayarak ve daha sonra PCR'yi gradyan sıcaklığı gerçekleştirebilen bir termosikler ile çalıştırarak yapılabilir.
    4. PCR ürünlerini DNA merdiveni ile 100 V'ta 100 V'ta 45-60 dakika boyunca %1,5'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın (Şekil 4B). Jeli mavi bir ışık veya UV transilluminator üzerine yerleştirin. Bantları jelden tüketin.
    5. Bir DNA jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı bantlardan çıkarın. Endojen gen lokusunda istenen cDNA'nın doğru ve kesintisiz entegrasyonunu doğrulamak için ekstrakte edilen PCR örneklerini Sanger dizilimi için uygun primerlerle gönderin.

figure-protocol-2
Şekil 4: Genomik entegrasyonun in-out PCR ile doğrulanması. (A) In-out PCR stratejisinin şematik gösterimi. Tasvir edilen stratejide, iki astar tasarlandı. Primer ileri 1, LHA'nın dışındaki genomik lokusu hedefler ve primer ters 2, kodon için optimize edilmiş diziyi hedefler. (B) Bir agaroz jel elektroforezinin şematik gösterimi. Yalnızca başarılı bir şekilde düzenlenmiş hücreler (RNP + AAV), içeri-dışarı PCR sırasında bir PCR ürünü oluştururken, düzenlenmemiş örnekler (yalnızca AAV) bir PCR ürünü oluşturmaz. Kısaltma: NTC = şablon dışı denetim. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda tarif edilen protokol uygulanarak, heterozigot tip 1 CALR mutasyonları, kordon kanı kaynaklı HSPC'lerde tekrarlanabilir şekilde tanıtıldı. Bu mutasyon, ekzon 9'da (CALR'nin son ekzonu) 52 bp'lik bir delesyondan oluşur ve bu da +1 kare kaymasıyla sonuçlanır ve yeni bir pozitif yüklü C-terminal alanı 26,33'ün çevrilmesine yol açar. Endojen gen lokusunda CALR mutasyonunu tanıtmak için, ekzon 9'un yukarı akımında bir intronic hedefleme stratejisi benimsendi, çünkü bu, Cas9 ile indüklenen DSB'nin HDR mekanizması ile onarılmadığı durumlarda kodlama dizisindeki istenmeyen değişiklikleri atlatacaktı. Bu özel durumda, uygun homoloji kolları ile kombinasyon halinde yüksek hedef üstü ve düşük hedef dışı sekansların mevcudiyeti nedeniyle intron 7 için bir sgRNA tasarlanmıştır (dizi tekrarlarının eksikliği; Şekil 5A).

Daha sonra iki donör şablonu AAV6 vektörlerinde tasarlandı ve paketlendi. Endojen ekzonlardan entegre cDNA'ya doğru eklemeyi sağlamak için, donör şablonları (i) 3' ekleme bölgesi, dal noktası ve polipirimidin sistemini içeren bir SA dizisini, (ii) WT (CALRWT) veya mutasyona uğramış diziyi (CALRDEL DEL) içeren ekzonların kodon için optimize edilmiş cDNA dizisini içerir. ) bir durdurma kodonu dahil, (iii) bir simian virüsü 40 (SV40) poliA sinyali, (iv) ayrı bir iç promotörün kontrolü altında bir floresan proteini kodlayan bir dizi, dalak odak oluşturan virüs (SFFV) promotörü, ardından (v) bir sığır büyüme hormonu (bGH) poliA sinyali. CALR WT cDNA'yı içeren donör şablonu bir GFP kaseti içerecek şekilde tasarlanırken, CALRDEL cDNA dizisini içeren donör şablonu bir BFP kaseti içerecek şekilde tasarlanmıştır. Tüm yapı sol ve sağ HA ile çevriliydi (Şekil 5A).

RNP kompleksi ile transfeksiyon ve rAAV6 virüsleri ile transdüksiyondan iki gün sonra, hücreler akış sitometrisi ile analiz edildi. Dört ana popülasyon tespit edilebilir: (i) ne GFP'yi ne de BFP'yi ifade eden, HDR tabanlı genom düzenlemesi olmayan hücreleri temsil eden hücreler, (ii) yalnızca GFP için pozitif olan, yalnızca WT yapısını entegre edenleri temsil eden hücreler, (iii) yalnızca mutasyona uğramış yapıyı entegre edenleri temsil eden yalnızca BFP için pozitif hücreler ve (iv) GFP ve BFP çift pozitif hücreler, hem WT hem de mutasyona uğramış dizileri entegre eden hücreleri temsil eder (Şekil 5B). Heterozigot tip 1 CALR mutasyonunu taşıyan HSPC'lerin saf popülasyonlarını elde etmek için, çift pozitif hücreler akış sitometrisi ile sıralandı. Kontrol hücreleri olarak iki WT dizisinin çalındığı HSPC'ler kullanıldı (GFP + mCherry +; Şekil 5B). Kontrol hücreleri olarak kullanmak için geçerli bir alternatif, floresan proteinlerin güvenli bir liman lokusunda bialelik bir entegrasyonuna sahip HSPC'ler olacaktır (yani, AAVS1; gösterilmemiştir). Sıralanmış HSPC'lerde yapılan tripan mavisi dışlaması ile hücre sayımı, hücrelerin% 90'ından fazlasının uygulanabilir olduğunu göstermiştir.

Yapıların hedefte sorunsuz entegrasyonu, içeri-dışarı PCR stratejisi uygulanarak doğrulanmıştır (Şekil 6A). Bu özel durumda, biri çalıntı CALR WT dizisi (Şekil 6A'daki jel elektroforezinin 1. şeridi) ve diğeri de çalınan CALRDEL dizisi (Şekil 6A'daki jel elektroforezinin 2. şeridi) için olmak üzere iki ayrı içeri-çıkış PCR'si gerçekleştirdik. Jel bantlarından ekstrakte edilen DNA üzerinde gerçekleştirilen sanger dizilemesi, CALR DEL / WT HSPC'lerindeWT ve mutasyona uğramış dizilerin doğru yerleştirildiğini doğruladı (Şekil 6B).

figure-results-1
Şekil 5: Heterozigot CALR mutasyonunu taşıyan HSPC'lerin üretimi. (A) Heterozigot CALR mutasyonunun yerleştirilmesi için düzenleme stratejisini gösteren temsili şema. RNP kompleksi, CALR geninin ekzon 7 ve ekzon 8 arasındaki intronunu hedefler. Biri mutasyona uğramış ekzonlar 8-9 ve bir BFP, diğeri WT ekzonları 8-9 ve bir GFP içeren iki AAV, donör onarım şablonları olarak hizmet edecek ve mutasyona uğramış dizinin bir alelde entegrasyonunu ve WT dizisinin kalan alelde entegrasyonunu teşvik edecektir. (B) HSPC'lerin transfeksiyonu ve transdüksiyonunu takiben GFP ve BFP veya GFP ve mCherry 48 h ekspresyonunu gösteren temsili akış sitometri grafikleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 6: HSPC'lerde başarılı heterozigot CALR mutasyonunun doğrulanması . (A) AAV kontrolleri, CALR WT / WT ve CALR DEL/ WT'den ekstrakte edilen genomik DNA üzerinde gerçekleştirilen içeri-dışarı PCR ürünlerinden jelelektroforezi. 100 bp DNA merdiveni kullanıldı. Kısaltma: NTC = şablon dışı denetim. (B) CALRDEL/WT üzerinde gerçekleştirilen in-out PCR'lerden elde edilen ve WT ve mutasyona uğramış dizilerin başarılı entegrasyonunu doğrulayan Sanger dizileme sonuçları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan primer HSPC'lerinin verimli ve kesin genetik manipülasyonu, normal hematopoezi ve en önemlisi hematopoetik hücrelerin lösemik transformasyonunu etkileyen süreçleri keşfetmek ve anlamak için harika bir fırsatı temsil eder.

Bu protokolde, tekrarlayan heterozigot GOF mutasyonlarını ifade etmek için insan HSPC'lerini tasarlamak için etkili bir strateji tanımlanmıştır. Bu prosedür, WT ve mutant DNA dizilerini endojen gen lokuslarına hassas bir şekilde eklemek için DNA şablonları için bağışçı olarak CRISPR / Cas9 teknolojisinden ve rAAV6 vektörlerinden yararlandı. Tasarlanmış cDNA'ların (WT ve mutant) ayrı floresan muhabir proteinleri ile bağlanması, kesin bir heterozigot duruma sahip hücrelerin zenginleşmesini ve izlenmesini sağlar.

Bu strateji, sık kullanılan lentiviral (LV) tabanlı yöntemlere kıyasla çeşitli avantajlar sunmaktadır. Ana avantajlardan biri, CRISPR / Cas9 tabanlı sistemin endojen lokuslarda hassas düzenlemeye izin vermesidir, bu da endojen promotörlerin ve düzenleyici elemanların korunmasını sağlar. Bu, hücrelerde düzenlenmiş genin ekspresyonunda homojenliğe yol açar; bu, LV tabanlı bir yöntem kullanıldığında zorlukla ulaşılabilen bir hedeftir. AG vektörleri ile gen transferi, transkripsiyonel olarak aktif bölgeler tercih edilerek genin yarı rastgele entegrasyonuna yol açar34. Bu, aktarılan genin aşırı ekspresyonuna ve düzenlenmiş hücreler arasındaki heterojenliğe dönüşebilir ve sonuçta mutasyonların ve gen etkileşimlerinin rolünü araştırmak ve analiz etmek için zorluklara neden olabilir. İkinci bir avantaj, tarif edilen sistemin, siteye özgü bir düzenleme sistemi olarak, ekleme mutajenezi35 risklerini ortadan kaldırmasıdır.

Çift floresan muhabir stratejisi, her iki alel üzerinde başarılı bir şekilde düzenlenmiş hücrelerin hassas bir şekilde zenginleştirilmesine ve izlenmesine izin verir; bir alel WT cDNA'yı entegre eder ve diğer alel mutasyona uğramış cDNA dizilerini bütünleştirir. Yalnızca tek bir muhabiri ifade eden hücreler, HDR şablonlarının aynı floresan muhabirle yalnızca monoallelik entegrasyonunu veya bialelik entegrasyonunu temsil eder. Her iki senaryo da ancak tek hücreden türetilmiş klonlar üretilir ve ayrı ayrı analiz edilirse kesin olarak ayırt edilebilir. Bununla birlikte, HSPC'ler in vitro olarak sadece sınırlı proliferatif kapasiteye sahiptir ve kültürde uzun süre tutulduğunda, HSPC'ler daha olgun soylara farklılaşmaya başlar ve kendini yenileme ve aşılama kapasitelerini kaybeder. Bu, istenen heterozigot mutasyonu barındıran tek hücreli klonların seçilmesini ve genişletilmesini mümkün kılmaz. Çift floresan protein stratejisinin uygulanması ve heterozigot mutasyonu taşıyan hücreler için akış sitometrisi ile zenginleştirilmesi, genişletilmiş in vitro kültürün neden olduğu sorunların atlanmasına izin verir.

Bu özel örnekte, heterozigot CALRDEL / WT mutasyonunu taşıyan HSPC'lerin saf popülasyonlarını elde etmek için HSPC'lerin verimli bir şekilde tasarlanabileceği ve sıralanabileceği başarıyla gösterilmiştir.

Bununla birlikte, bu sistem heterozigot çerçeve kaydırma mutasyonlarının mühendisliği ile sınırlı değildir, aynı zamanda yanlış ve saçma mutasyonlar da dahil olmak üzere diğer mutasyon türlerini oluşturmak için kolayca benimsenebilir. WT içeren AAV'lerin farklı kombinasyonlarını veya farklı floresan raporlayıcı proteinleri ile mutasyona uğramış dizileri uygulayarak, bu sistem homozigot mutasyonların tanıtılması (her ikisi de mutant cDNA taşıyan ancak farklı floresan muhabirleri taşıyan iki rAAV ile eşzamanlı transdüksiyon) veya hatta mutasyonların düzeltilmesi (her ikisi de WT cDNA taşıyan iki AAV ile eşzamanlı transdüksiyon) için de kullanılabilir. Ek olarak, bu stratejinin onkojenik GOF mutasyonlarının tanıtılmasıyla sınırlı olmadığını belirtmek önemlidir. Aslında, tarif edilen protokol, gen nakavtı, gen replasmanı36,37, transgenlerin hedefli knock-in'i (yani, kimerik antijen reseptörleri)38 ve hatta hastalığa neden olan mutasyonların düzeltilmesi 11,39 dahil olmak üzere çoklu alternatif stratejiler için kullanılabilir.

CRISPR / Cas9 ve AAV6'yı çoklu floresan muhabirlerle birleştirme stratejisinin, T hücreleri, plazmasitoid dendritik hücreler, indüklenmiş pluripotent kök hücreler, nöronal kök hücreler ve hava yolu kök hücreleri 24,38,40,41,42,43,44 dahil olmak üzere diğer birçok hücre tipinde de uygulanabilir olduğu gösterilmiştir. . Bu strateji, üstün kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin üretimi için uygulanabilir. Örneğin, yakın zamanda, CAR T hücrelerindeki TGFBR2 geninin CRISPR / Cas9 aracılı nakavtının, baskılayıcı TGF β zengin tümör mikroçevre45'teki işlevlerini büyük ölçüde arttırdığı yayınlanmıştır. Böyle bir yaklaşım, hem CAR'ı eksprese etmek için T hücrelerinin mühendisliğini yapmak hem de TGFBR2 genini CAR'ı TGFBR2 geninin her iki aleline özel olarak yerleştirerek bölgeye göre nakavt etmek için tek adımlı bir protokol sağlayabilir. Dahası, bu yaklaşım, CAR'ı T hücresi reseptörü alfa sabiti (TRAC) geni46,47'ye entegre ederek evrensel CAR T hücreleri üretmek için de yararlı olabilir.

Tekrarlanabilirliği arttırmak ve hücrelerin verimli bir şekilde düzenlenmesini garanti etmek için, bazı önemli hususlara dikkat edilmesi gerekir. Hücrelerin başarılı bir şekilde düzenlenmesini sağlamak için ana kritik noktalar (i) sgRNA'nın seçimi, (ii) HDR şablonunun tasarımı ve (iii) rAAV6 üretiminde bulunur.

İyi performans gösteren bir sgRNA'nın seçimi, HDR şablonunun entegre edilebileceği maksimum alel sayısını belirleyeceği için çok önemlidir. Şu anda mevcut olan çok sayıda yazılım nedeniyle, aday sgRNA'ların araştırılması basitleştirilmiştir. İlgilenilen bölgeyi seçerek, yazılım sırasıyla istenen lokusta ve istenmeyen lokusta düzenleme şansını gösteren hedef üstü puana ve hedef dışı puana sahip bir dizi sgRNA önerebilir. Bu puanlar daha önce yayınlanmış48,49 puanlama modellerine göre hesaplanmıştır. Bu, iyi performans gösteren bir sgRNA seçmek için iyi bir başlangıç noktası olmasına rağmen, silikodaki öngörülen performansı her zaman in vitro olarak verimli bir sgRNA'ya karşılık gelmediğinden, sgRNA'nın performansının doğrulanması gerekir. Bu nedenle, en iyi sgRNA'yı bulma şansını artırmak için en az üç sgRNA tasarlamanız ve test etmeniz şiddetle tavsiye edilir. Gerçek bir iyi performans gösteren sgRNA tanımlandıktan sonra, HDR şablonunun tasarımına devam edilmesi önerilir.

HDR şablonunu tasarlarken önlemler dikkate alınmalıdır. Sol ve sağ homoloji kollarının (sırasıyla LHA ve RHA) her biri sırasıyla sgRNA kesim bölgesinin yukarı ve aşağı yönünde 400 bp yayılmalı, çünkü daha kısa HA'lar HDR frekanslarının azalmasına neden olabilir. HDR ile tanıtılabilen cDNA'nın boyutu, kabaca 4,7 kb olan AAV'lerin paketleme yeteneklerine bağlıdır. HDR şablonunda zorunlu olan çok sayıda öğe (LHA, RHA, SA, PolyA, promotör ve floresan muhabir dizisi) nedeniyle, mutasyona uğramış veya WT cDNA için kalan alan sınırlıdır. İstenilen mutasyon bir genin 3' ucunun yakınında veya genel olarak kısa bir CDS'ye sahip genlerde bulunuyorsa bu sorunsuzdur. Bununla birlikte, mutasyonun uzun bir CDS'li genlerin transkripsiyonel başlangıç tarafına (TSS) yakın bir yerde bulunduğu durumlarda (AAV'nin kalan paketleme alanını aşarak), bu tarif edilen yaklaşım mümkün olmayabilir. Bu sorunu aşmak için, HDR şablonunu iki AAV'ye bölmeye dayanan bir strateji yakın zamanda Bak ve meslektaşları tarafından geliştirilmiştir. Bu strateji, büyük bir gen50'nin nihai kesintisiz entegrasyonunu elde etmek için iki ayrı HDR aracılı entegrasyona dayanır.

Virüsün kalitesi ve titresi, hücrelerin başarılı genom mühendisliğini yapabilen veya bozabilen ek faktörlerdir. Optimum verim için, HEK293T'nin kültürde korunurken tam akıcılığa ulaşmasına izin vermemek önemlidir. İdeal olarak, HEK293T hücreleri% 70-80 akıcılığa ulaşıldığında bölünmelidir. Ek olarak, HEK293T uzun süre kültürlenmemelidir, çünkü bu onların virüs üretme yeteneklerini azaltabilir. Yeni HEK293T hücrelerinin 20 geçişten sonra çözülmesi gerekir. Yüksek virüs titreleri elde etmek, deneylerin verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini artırmak için önemlidir. Düşük viral titreler, HSPC'lerin transdüksiyonu için gerekli olan büyük hacimli rAAV çözeltisine dönüşecektir. Genel bir kural olarak, çekirdeklendirilmiş hücrelere eklenen rAAV çözeltisi, HSPC tutma ortamının toplam hacminin% 20'sini geçmemelidir. Daha yüksek hacimli AAV solüsyonu hücre ölümünün artmasına, proliferasyonun azalmasına ve transdüksiyon verimliliğinin bozulmasına neden olabilir. Düşük virüs titreleri durumunda, bu nedenle virüsün daha da konsantre edilmesi önerilir.

Özetle, bu protokol, ek çift floresan muhabirlerle CRIPSR / Cas9 ve rAAV6 donör şablonlarının eşzamanlı kullanımı yoluyla insan HSPC'lerini hassas ve verimli bir şekilde manipüle etmek için tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar. Bu yaklaşımın normal hematopoetik kök hücre biyolojisini ve mutasyonların löseminogeneze yaptığı katkıları incelemede harika bir araç olduğu kanıtlanmıştır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Avusturya Bilim Fonu'ndan (FWF; sayı P32783 ve I5021) A.R.'ye verilen hibelerle desteklenmektedir. A.R.'ye ek fon, Avusturya İç Hastalıkları Derneği (Joseph Skoda Bursu), Avusturya Hematoloji ve Onkoloji Derneği (OeGHO; Klinik Araştırma Bursu) ve MEFOgraz. T.K. Lösemi ve Lenfoma Derneği'nin Özel Üyesidir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
175 cm2 Hücre Kültürü Şişesi, Havalandırma Kapağı, TC ile işlenmişCorning431080
150 mm x 25 mm tabaklarCorning430599
293TDSMZACC 635https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635
4D Nükleofektör Çekirdek ÜnitesiLonza-İnsanHSPC'lerinin nükleofeksiyonu için DZ-100 programını kullanın.
4D Nükleofektör X ÜnitesiLonza-500
ml Santrifüj TüpüCorning431123
7-AADBD Biosciences559925
AAVpro Arıtma KitiTakara6666
Alt-R SP Cas9 Nükleaz V3Entegre DNA Teknolojileri (IDT)1081058
Avanti JXN-30 UltrasantrifüjBeckman Coulter-Benchling
sgRNA tasarım aracısgRNA tasarımı için çevrimiçi araç: http://www.benchling.com/crispr
Sığır Serumu Albümini (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
C1000 Dokunmatik Termal DöngüleyiciBio-Rad-Kimyasal
olarak modifiye edilmiş sentetik sgRNASynthegoWeb sitesi: CALR'nin intron 7'sini hedefleyen sgRNA için https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Dizi: 5'-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3'                 sgRNA'yı tamamlamak için 80 nükleotid RNA dizisine 9 nükleotidlik bir SpCas20 iskelesi eklenir. İlk ve son 3 baza 2'-O-Metil'in kimyasal modifikasyonları eklenir ve ilk 3 ve son 2 baza 3' fosforotiyoat bağları eklenir.       *Alternatif olarak, kimyasal olarak modifiye edilmiş sentetik sgRNA'lar, IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) ve Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)
CHOPCHOP sgRNA tasarım aracından. sgRNA tasarımı için çevrimiçi araç: http://chopchop.cbu.uib.no
Costar 24 kuyulu Clear TC ile işlenmiş Çok Kuyulu PlakalarCorning3526
CRISPick sgRNA tasarım aracısgRNA tasarımı için çevrimiçi araç: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
CRISPOR sgRNA tasarım aracısgRNA tasarımı için çevrimiçi araç: http://crispor.tefor.net
ddPCR 96 Kuyulu PlakalarProblar için Bio-Rad12001925
ddPCR Supermix (dUTP yok)
DG8 Kartuşları 
DG8 Contaları Bio-Rad1863009
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)Thermo ScientificK1081
Problar için Damlacık Oluşturma YağıBio-Rad1863005
Dulbecco' Yüksek glikozlu Modifiye Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6429-6X500ML
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (DPBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
FACSAria FusionBD Biosciences-Falcon
5 mL Yuvarlak TabanlıCorning352054
Fetal Sığır Serumu (FBS) Good Forte (ısı ile etkisizleştirilmiş), 500 mlPan BiotechP40-47500
FlowJo 10.8.0BD Biosciences -
GenAgarose L.E.Inno-trainGX04090
GeneRuler 100 bp Plus DNA MerdiveniThermo ScientificSM0321
Gibson Assembly Master MixNew England Biolabs Inc. (NEB)E2611L
HEK293T
HEPES çözümüSigma-AldrichH0887-100ML
ICESynthegohttps://ice.synthego.com
IDT kodon optimizasyon aracıIDThttps://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool
IDT sgRNA tasarım aracısgRNA tasarımı için çevrimiçi araç: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM
LB Et Suyu (Lennox) EZMix tozu mikrobiyal büyüme ortamıSigma-AldrichL7658-1KG
Agarlı LB Suyu (Lennox) EZMix tozu mikrobiyal büyüme ortamıSigma-AldrichL7533-1KG
Midori Green AdvanceNippon GeneticsMG04
Monarch Plazmid Miniprep KitiNEBT1010L
Monarch DNA Jel Ekstraksiyon KitiNEBT1020L
NEB 5-alfa Yetkin E. coli (Yüksek Verimlilik)NEBC2987U
Nükleaz İçermeyen Su, 5X100 mlAmbionAM9939
NucleoBond Xtra MidiMacherey-Nagel740410
Opti-MEM, İndirgenmiş Serum Ortamı, 500 mlGibco31985070
P3 Birincil Hücre 4D-Nucleofetor  X Kit LLonzaV4XP-3024Lonza Birincil P3 çözeltisi, 2.25 mL P3 Birincil Hücre Nükleofektör Çözeltisi ve 0.5 mL Ek 1 olarak sağlanır. Sulandırmak için, Ek 1'i P3 Birincil Hücre Nükleofektör Çözeltisine ekleyin ve karıştırın.
pAAV-MCS2Addgene46954
PCR Plakalı Isı Yalıtım Folyosu, delinebilirBio-Rad1814040
pDGM6Addgene110660
Penisilin-Streptomisin (P / S)Gibco15140122
Polietilenimin (PEI)Polysciences23966Bir tüpte 50 mg PEI'ye 50 mL PBS 4.5 pH (HCl ile yapılır) ekleyin. Tüpü 70 ° C'ye yerleştirerek çözün; C su banyosu ve çözelti eriyene kadar her 10 dakikada bir girdaplama. Çözelti RT'ye ulaştıktan sonra, filtre 0.22 & mu'dan sterilize edilir; m filtre, 1120 &mu yapın; L alikotlar ve -80 ° C'de saklayın.
Polistiren Test Tüpü, Çıtçıtlı Kapaklı Primerler
 Eurofins-Primerler, Eurofins'ten (eurofinsgenomics.eu) modifiye edilmemiş tuzsuz özel oligolar olarak sipariş edildi. Astarlar PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)  kullanılarak tasarlanmıştır.                                                                                                       Astar 1 Fwd:      AAGTGATCCGTTCGCCATGAC;                               Primer 2 Rev CALR WT'ye özel: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC;                                         Primer 2 Rev CALR DEL'e özel: CCAACCCTGGAGACACGCTTC
PrimeTime qPCR PrimerIDT-PrimeTimeqPCR Prob Testleri (1 prob/2 primer)  IDT'den (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry) sipariş edilebilir. Ölçek: Std - qPCR Testi 500 reaksiyon; Primer 1 İleri (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Ters (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Prob (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5 'Boya / 3' Söndürücü: FAM / ZEN / IBFQ; Astar prob oranı: 3.6
PX1 PCR Plaka KapatıcıBio-Rad1814000
QuantaSoft YazılımıBio-Rad
Hızlı Ekstrakt DNA Ekstraksiyon ÇözeltisiLucigenQE0905T
QX200 Damlacık Jeneratörü Bio-Rad1864002
QX200 Damlacık OkuyucuBio-Rad
Rekombinant insan Flt3-ligandPeprotech300-19
Rekombinant insan IL-6Peprotech200-06
Rekombinant İnsan SCFPeprotech300-07
Rekombinant İnsan TPOPeprotech300-18
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758-6X500ML
SnapGeneDotmaticsMoleküler klonlama yazılımı https://www.snapgene.com *Alternatif olarak Benchling (https://www.benchling.com) ve Geneious (https://www.geneious.com) da kullanılabilir.
Soc büyüme ortamıNEBB9020S
Sodyum-bütiratSigma-AldrichB5887-1G
Kök Regenin 1 (SR1)Biyogemler1224999
StemSpan SFEM IIKÖK HÜCRE Teknolojileri9655
TAE Tamponu (Tris-asetat-EDTA) 50XThermo Scientific B49
TIDEhttp://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Tripan mavisi %0.4Sigma-AldrichT8154-100ML
TrypLE (fenol kırmızısı ile), 500 mlThermo Scientific16605-028
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 mlThermo Scientific15575-038
UM171KÖK HÜCRE Teknolojileri72914
Vector Builder kodon optimizasyon aracıVector Builderhttps://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html
elde edilebilirQX200/QX100 Damlacık Jeneratörü için Bio-Rad 1863024 QX200/QX100 Damlacık Jeneratörü için Bio-Rad 1864008 Testi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing transthyretin amyloidosis. New England Journal of Medicine. 385 (6), 493-502 (2021).
  3. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
  4. Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
  5. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  6. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  7. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  8. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  9. Veldwijk, M. R., et al. Pseudotyped recombinant adeno-associated viral vectors mediate efficient gene transfer into primary human CD34+ peripheral blood progenitor cells. Cytotherapy. 12 (1), 107-112 (2010).
  10. Song, L., et al. High-efficiency transduction of primary human hematopoietic stem cells and erythroid lineage-restricted expression by optimized AAV6 serotype vectors in vitro and in a murine xenograft model in vivo. PLoS One. 8 (3), 58757(2013).
  11. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  12. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  13. Jan, M., et al. Clonal evolution of preleukemic hematopoietic stem cells precedes human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 4 (149), (2012).
  14. Corces-Zimmerman, M. R., Hong, W. J., Weissman, I. L., Medeiros, B. C., Majeti, R. Preleukemic mutations in human acute myeloid leukemia affect epigenetic regulators and persist in remission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2548-2553 (2014).
  15. Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
  16. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
  17. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  18. Cancer Genone Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (22), 2059-2074 (2013).
  19. Ball, M., List, A. F., Padron, E. When clinical heterogeneity exceeds genetic heterogeneity: thinking outside the genomic box in chronic myelomonocytic leukemia. Blood. 128 (20), 2381-2387 (2016).
  20. Varmus, H. E. The molecular genetics of cellular oncogenes. Annual Review of Genetics. 18, 553-612 (2003).
  21. Cox, D. B. T., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: Prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
  22. Tothova, Z., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing in human hematopoietic stem cells models clonal hematopoiesis and myeloid neoplasia. Cell Stem Cell. 21 (4), 547-555 (2017).
  23. Mandal, P. K., et al. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9. Cell Stem Cell. 15 (5), 643-652 (2014).
  24. Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 13 (2), 358-376 (2018).
  25. Foßelteder, J., et al. Human gene-engineered calreticulin mutant stem cells recapitulate MPN hallmarks and identify targetable vulnerabilities. Leukemia. , (2023).
  26. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2391-2405 (2013).
  27. Merlinsky, T. R., Levine, R. L., Pronier, E. Unfolding the role of calreticulin in myeloproliferative neoplasm pathogenesis. Clinical Cancer Research. 25 (10), 2956-2962 (2019).
  28. Belčič Mikič, T., Pajič, T., Zver, S., Sever, M. The contemporary approach to CALR-positive myeloproliferative neoplasms. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3371(2021).
  29. How, J., Hobbs, G. S., Mullally, A. Mutant calreticulin in myeloproliferative neoplasms. Blood. 134 (25), 2242-2248 (2019).
  30. Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nature Protocols. 1 (3), 1412-1428 (2006).
  31. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
  32. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2011).
  33. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).
  34. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 1-24 (2021).
  35. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. The Journal of Clinical Investigation. 119 (4), 964-975 (2009).
  36. Vaidyanathan, S., et al. Targeted replacement of full-length CFTR in human airway stem cells by CRISPR-Cas9 for pan-mutation correction in the endogenous locus. Molecular Therapy. 30 (1), 223-237 (2022).
  37. Cromer, M. K., et al. Gene replacement of α-globin with β-globin restores hemoglobin balance in β-thalassemia-derived hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 27 (4), 677-687 (2021).
  38. Wiebking, V., et al. Genome editing of donor-derived T-cells to generate allogenic chimeric antigen receptor-modified T cells: Optimizing αβ T cell-depleted haploidentical hematopoietic stem cell transplantation. Haematologica. 106 (3), 847-858 (2021).
  39. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
  40. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 genome engineering in engraftable human brain-derived neural stem cells. iScience. 15, 524-535 (2019).
  41. Laustsen, A., et al. Interferon priming is essential for human CD34+ cell-derived plasmacytoid dendritic cell maturation and function. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  42. Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLife. 6, 27873(2017).
  43. Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
  44. Vaidyanathan, S., et al. selection-free gene repair in airway stem cells from cystic fibrosis patients rescues CFTR function in differentiated epithelia. Cell Stem Cell. 26 (2), 161-171 (2020).
  45. Tang, N., et al. TGF-β inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors. JCI Insight. 5 (4), 133977(2020).
  46. Georgiadis, C., et al. Long terminal repeat CRISPR-CAR-coupled "universal" T cells mediate potent anti-leukemic effects. Molecular Therapy. 26 (5), 1215-1227 (2018).
  47. Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
  48. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  49. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  50. Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hematopoietic Stem CellsProgenitor CellsGain Of Function MutationsCRISPR Cas9 EditingHomology Directed RepairRecombinant AAV6Fluorescent Reporter SystemFlow CytometrySingle Guide RNAGenome Editing

Related Articles