Burada sunulan, mekano-düğüm-gözenek algılama (mekano-NPS) adı verilen elektronik tabanlı bir mikroakışkan platform kullanarak tek hücreleri mekanik olarak fenotiplemek için bir yöntemdir. Bu platform, hücrelerin hem elastik hem de viskoz biyofiziksel özelliklerini ölçerken 1-10 hücre / s'nin ılımlı verimini korur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mekano-Düğüm-Gözenek Algılama: Çok Parametreli Tek Hücreli Viskoelastik Ölçümler için Hızlı, Etiketsiz Bir Platform
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Hücresel mekanik özellikler, kök hücre farklılaşmasından kanser metastazına kadar çok çeşitli biyolojik süreçlerde ve hastalıklarda rol oynar. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve mikropipet aspirasyonu (MA) gibi bu özellikleri ölçmek için kullanılan geleneksel yöntemler, bir hücrenin tam viskoelastik tepkisini yansıtan zengin bilgileri yakalar; ancak, bu yöntemler çok düşük aktarım hızı ile sınırlıdır. Gerçek zamanlı deforme olabilirlik sitometrisi (RT-DC) gibi yüksek verimli yaklaşımlar, genellikle yalnızca bir hücrenin elastik özelliklerini yansıtan tek parametreli okumalarla sınırlı olduklarından, yalnızca sınırlı mekanik bilgileri ölçebilir. Bu yöntemlerin aksine, mekano-düğüm-gözenek algılama (mekano-NPS), orta verime sahip bir hücrenin çok parametreli viskoelastik ölçümlerini elde etmedeki boşluğu dolduran esnek, etiketsiz bir mikroakışkan platformdur. Doğru akım (DC) ölçümü, hücreleri mikroakışkan bir kanaldan geçerken izlemek, dar bir daralmadan önce, sırasında ve sonrasında boyutlarını ve hızlarını izlemek için kullanılır. Bu bilgi (yani, boyut ve hız), her hücrenin enine deformasyonunu, deformasyona karşı direncini ve deformasyondan iyileşmesini ölçmek için kullanılır. Genel olarak, bu elektronik tabanlı mikroakışkan platform, çoklu viskoelastik hücre özellikleri ve böylece bir hücrenin mekanik durumunun daha eksiksiz bir resmini sağlar. Minimum numune hazırlama gerektirdiğinden, basit bir elektronik ölçüm kullandığından (yüksek hızlı bir kameranın aksine) ve standart yumuşak litografi imalatından yararlandığından, bu platformun uygulanması basit, erişilebilir ve aşağı akış analizine uyarlanabilir. Bu platformun esnekliği, kullanışlılığı ve hassasiyeti, temel bilim ve klinik teşhiste daha birçok uygulama potansiyeli ile çeşitli hücreler hakkında benzersiz mekanik bilgiler sağlamıştır.
Giriş
Tek hücreler dinamik, viskoelastik malzemelerdir1. Çok sayıda iç ve dış süreç (örneğin, mitozun başlangıcı veya hücre dışı matrisin [ECM] yeniden şekillendirilmesi), yapılarını ve kompozisyonlarınıetkiler 2,3,4, genellikle mevcut durumlarını tamamlayan farklı biyofiziksel özelliklerle sonuçlanır. Özellikle, mekanik özelliklerin hücresel gelişim, fizyoloji ve patolojinin önemli biyobelirteçleri olduğu ve kanonik moleküler ve genetik yaklaşımları destekleyebilecek değerli nicel bilgiler sağladığı gösterilmiştir 5,6,7
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Tasarım cihazı geometrisi
- Boyutlandırma ve geri kazanım segmentlerinin genişliğini, ölçülecek en büyük hücrelerin çapından daha geniş olacak şekilde seçin, ancak aynı zamanda yeterli bir sinyal-gürültü oranını (SNR) korur. Çeşitli hücre satırları için farklı boyutlandırma ve kurtarma segmenti genişliklerine örnekler için Ek Tablo 2'ye bakın.
- Mekanofenotiplemeye tabi tutulacak hücrelerin ortalama boyutuna 0-@'lık bir gerinim uygulamak için büzülme segmenti genişliğini seçin. Gerinim, d'nin hücre çapı ve wc'nin büzülme kanalı genişliği 2,8 olduğu
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada sunulan mekanofenotipleme platformu, orta verime sahip tek hücrelerin biyofiziksel özelliklerini ölçmek için basit ve çok yönlü bir yaklaşımdır. Hücreler, sabit basınç güdümlü akış kullanılarak mikroakışkan kanaldan (Şekil 1A) akar. Hücreler geçiş yaparken, mikroakışkan kanalın uzunluğu ve üretilen akım darbeleri, veri toplama donanımı kullanılarak kaydedilir. Elde edilen sinyal (Şekil 1B, C) daha sonra ilgili tek hücreli mekanik özellikl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu mekanofenotipleme tekniğini kullanarak tek hücrelerin mekanik özelliklerinin ölçülmesi üç aşamadan oluşur: cihaz üretimi, veri toplama ve veri analizi. Her aşamada, deneysel sonuçları önemli ölçüde etkileyebilecek dikkate değer yönler vardır. Cihaz üretimi sırasında, tutarlı kanal geometrileri ve cihazdan cihaza homojenlik, doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar için gereklidir. Özellikle, her aygıtın yan duvarları nispeten düzgün olmalıdır (Şekil 4Ai) ve çoğaltılan aygıtlardaki kanal yüksekli.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
L. L. S, ABD patent No. 11,383,241'e sahiptir: "Mechano-node-pore sensing", J. Kim, S. Han ve L. L. Sohn, 12 Temmuz 2022'de yayınlanmıştır.
Teşekkürler
Bu araştırma NIBIB 1R01EB024989-01 ve NCI 1R01CA190843-01 hibeleri ile desteklenmiştir. A. L. ve R. R., H2H8 Derneği Lisansüstü Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir. K. L. C., Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu ve Siebel Scholar Bursu tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Aseton | J.T. Baker | 5356-05 | Saflık (GC) ≥ %99,5 (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker) |
| Alüminyum Folyo | n/a | n/a | |
| Analog Alçak Geçiren Filtre | ThorLabs | EF504 | ≤ 240 kHz Geçiş Bandı, Koaksiyel BNC Geçişi (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0) |
| Biyopsi Punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | 1mm, Tek Kullanımlık, Pistonlu (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25) |
| Bıçak | n/a | n/a | |
| BNC Kablosu | Pomona Elektronik | 2249-C-12 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ Orta=TBM& utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW& utm_term= & utm_content=Koaksiyel%20 Kablolar%20%28RF%29& gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB |
| Temiz Oda Polyester Çubuk | Thermo Fisher Scientific | 18383 | https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383 |
| Akım Önamplifier | DL Instruments | 1211 | https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419 |
| Özel PCB (bileşenlerle) | n/a | n/a | Ek dosyalara bakın 4 ve 5 |
| DAQ Terminal Bloğu | Ulusal Aletler | BNC-2120 | https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html |
| DAQ - BNC-2110 kablosu | Ulusal Aletler | SHC68-68-EPM | https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html |
| Veri Toplama Kartı (DAQ) | Ulusal Aletler | PCI-6251 | https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html |
| Kurutucu | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250 |
| Dişi BNC - Banana Fiş Adaptörü | Pomona Electronics | 72909 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318 |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | VWR | 89510-186 | https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs |
| Cam Kesici | Chemglass | CG-1179-21 | https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips |
| Altın Gravür TFA | Transene | NC0977944 | https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944 |
| Sıcak Plaka | Thermo Fisher Scientific | SP131825 | |
| İzopropil Alkol Spektrumu | Kimyasal | I1056-4LTPL | Saflık (GC) ≥ %99,5 (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056) |
| Metal Donanım Muhafazası | Hammond İmalatı | EJ12126 | https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415 |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Saflık (GC) ≥ %99,8 (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561) |
| MF-321 Geliştirici | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/mf-321/ |
| MICROPOSIT S1813 Pozitif Fotorezist | DuPont | n/a | https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049 |
| Photomask | Fineline Imaging | n/a | Photomask, CAD tasarımlarımızdan özel olarak sipariş edilmiştir (https://www.fineline-imaging.com/) |
| Düz Cam Mikroskop Slayt | Fisher Scientific | 12-553-5B | Malzeme: Soda Kireç, L75 x W50 mm, Kalınlık: 0.90 ve ndash; 1,10 mm |
| Plazma Temizleyici | Harrick Plazma | PDC-001 | https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/ |
| Plastik Petri | Kabı Thermo Fisher Scientific FB0875712 | 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712) | |
| Basınç Kontrol Cihazı | Fluigent | MFCS-EZ | https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/ |
| Basınç Kontrol Yazılımı | Fluigent | MAESFLO | |
| Programlama ve Veri | toplama ve analizi için | MATLAB | R2021b |
| PTFE Boru | Cole Parmer | 06417-31 | 0.032 "ID x 0.056" ( https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731) |
| Scepter 2.0 El Otomatik Hücre Sayacı | Millapore Sigma | PHCC20060 | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060 |
| Silikon Gofret Gofret | Dünyası | 2885 | 76.2 mm, Tek Taraflı Cilalı (https://www.waferworld.com/product/2885) |
| Spin Kaplayıcı | n/a | n/a | |
| SU-8 3025 Negatif Fotorezist | Kayaku İleri Malzemeler | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ |
| SU8 Geliştirici | Kayaku İleri Malzemeler | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-developer/ |
| Sygard 184 Polidimetilisiloksan | Dow Kimyasal | 4019862 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Bant | Scotch | 810-341296 | https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB |
| Titanyum, Platin, Altın | n/a | n/a | |
| Üçlü Çıkış Güç Kaynağı | Keysight | E36311A | https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 |
| UV Maskesi Hizalayıcı | Karl Suss Amerika | MJB3 Maskesi Hizalayıcı |
Kaynaklar
- Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038(2017).
- Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mec....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
