Yöntem makalesi

Floresein-İzotiyosiyanat-Etiketli Dextran Kullanarak Farelerde Bağırsak Bariyer Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/64710

⸱

18 Kasım 2022

 ,  ,  , 
1Nutrition and Microbiome Laboratory, Institut du cancer de Montréal, Centre de recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM), 2Digestive Surgery Service, Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CHUM), Faculty of Medicine, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Faculty of Medicine, Université de Montréal

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, floresein-izotiyosiyanat etiketli (FITC) dekstran, hem in vivo hem de plazma ve dışkı örneklerinde bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek için farelere oral gavaj yoluyla uygulanmaktadır. Bağırsak bariyeri fonksiyonu birçok hastalık sürecinde etkilendiğinden, bu doğrudan ve nicel tahlil çeşitli araştırma alanlarında kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak bariyeri bütünlüğü, bağırsak sağlığının ayırt edici bir özelliğidir. Bağırsak bariyer bütünlüğü, plazma enflamatuar belirteçlerinin ölçümü ve dalak ve lenf düğümlerine bakteriyel translokasyon gibi dolaylı belirteçler kullanılarak değerlendirilebilirken, altın standart, seçilen moleküllerin bağırsak mukozal tabakasını sistemik dolaşıma doğru geçme yeteneğini doğrudan ölçer. Bu makalede, floresein-izotiyosiyanat etiketli dekstran (FITC-dextran) kullanan farelerde bağırsak geçirgenliğini gerçek zamanlı olarak ölçmek ve takip etmek için invaziv olmayan, uygun maliyetli ve düşük yüklü bir teknik kullanılmaktadır. FITC-dextran ile oral takviyeden önce, fareler oruç tutulur. Daha sonra fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilmiş FITC-dekstran ile gavagona edilirler. Gavage'den bir saat sonra, fareler izofluran kullanılarak genel anesteziye tabi tutulur ve in vivo floresan bir görüntüleme odasında görselleştirilir. Bu teknik, karın boşluğundaki rezidüel floresanı ve floresan probun portal migrasyonunu düşündüren hepatik alımı değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Kan ve dışkı örnekleri oral gavajdan 4 saat sonra toplanır ve fareler kurban edilir. PBS'de seyreltilen plazma ve dışkı örnekleri daha sonra kaplanır ve floresan kaydedilir. FITC-dextran konsantrasyonu daha sonra standart bir eğri kullanılarak hesaplanır. Önceki araştırmalarda, in vivo görüntüleme, düşük lifli bir diyetin neden olduğu daha zayıf bir bağırsak bariyerine sahip farelerde floresanın karaciğere hızla yayıldığını, bağırsak bariyerini güçlendirmek için lifle takviye edilmiş farelerde, floresan sinyalinin çoğunlukla gastrointestinal sistemde tutulduğunu göstermiştir. Ek olarak, bu çalışmada, kontrol fareleri dışkıda yüksek plazma floresansına ve azalmış floresana sahipken, tersine, inülin takviyeli fareler bağırsakta daha yüksek floresan sinyallerine ve plazmada düşük seviyelere sahipti. Özetle, bu protokol bağırsak sağlığı için bir belirteç olarak bağırsak geçirgenliğinin kalitatif ve kantitatif ölçümlerini sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak bariyeri hem sağlıkta hem de hastalıkta önemli bir rol oynar. Gerekli besin maddelerinin bağırsak lümeninden dolaşıma nüfuz etmesine izin verirken aynı zamanda patojenler veya antijenler gibi pro-inflamatuar moleküllerin penetrasyonunu önlemek arasında karmaşık bir denge gerektirir1. Artmış geçirgenlik, karaciğer hastalığı veya inflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD'ler) gibi birçok gastrointestinal bozukluktan kaynaklanabilir2,3. Örneğin, ülseratif kolitte (UC), bir IBD'de, kronik inflamasyon, sıkı kavşakların parçalanmasına, ardından bağırsak bariyerinin bozulmasına ve bakterilerin translokasyonuna yol açarak, potansiyel olarak mukozal ve sistemik inflamasyonu sürdürür4.

Bu nedenle, bağırsak bariyeri bütünlüğü, bağırsak sağlığının önemli bir belirtecidir. Bununla birlikte, bağırsak geçirgenliğinin ölçülmesi için mevcut yöntemlerin birçok sınırlaması vardır. Örneğin, plazma inflamatuar belirteçlerini veya dalak ve lenf düğümlerine bakteriyel translokasyonu ölçen yöntemler dolaylıolarak 5,6'dır. Diğer yöntemler invaziv ve zaman yoğun olabilir. Bu makalede, bağırsak geçirgenliğini doğrudan ve nicel olarak ölçen invaziv olmayan ve uygun maliyetli bir test açıklanmaktadır. Bu tahlil, floresansı in vivo ölçerek bağırsak geçirgenliğini gerçek zamanlı olarak takip etmek için floresein-izotiyosiyanat etiketli dekstran (FITC-dextran) kullanır. Ek olarak, plazma ve dışkıdaki FITC-dekstran seviyelerinin ölçülmesi, bağırsak geçirgenliğini ölçer (Şekil 1).

FITC-dextran geçirgenlik testi daha önce Parkinson hastalığı7, sepsis8, iskemik inme9 ve yanık hasarı10'un hayvan modelleri de dahil olmak üzere birçok farklı bağlamda kullanılmıştır. Ek olarak, bu tahlil son zamanlarda bağırsak mikrobiyomunun farklı hastalık süreçlerinde nasıl rol oynayabileceğini ve potansiyel bir terapötik olarak nasıl hedeflenebileceğini veya manipüle edilebileceğini anlamaya yardımcı olmak için kullanılmıştır. Örneğin, 11, IBD'ler 12, kolorektal kanser13 ve otizmspektrum bozukluğu 11'de mikrobiyom ve mikrobiyom bazlı terapötikleri incelemek için kullanılmıştır. Bağırsak bariyeri fonksiyonu sağlık ve hastalığın birçok yönüyle ilişkili olduğundan, bu tahlil yaygın olarak kullanılmıştır. Göreceli sadeliği ve düşük zaman yükü, bağırsak bariyeri bütünlüğünü değiştirdiğinden şüphelenilen in vivo koşulları test etmek için idealdir. Kantitatif sonuçları, potansiyel bir tedavinin etkinliğini belirlemek için yararlıdır.

Bu çalışmada, diyetin bağırsak bariyer fonksiyonu üzerindeki etkisi FITC-dextran testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Kontrol diyeti alan farelerin bağırsak geçirgenliği ve inülin takviyeli diyet alan farelerin bağırsak geçirgenliği karşılaştırılmıştır. İnülin, bağırsak bariyer fonksiyonunu iyileştirdiği gösterilen faydalı bir oligosakkarittir12,13. İn vivo floresan ölçümleri (arka plan) için, negatif kontrol olarak ek bir tedavi edilmemiş fare kullanıldı ve FITC-dextran yerine PBS aldı. Bu deney, FITC-dekstran testinin bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek için değerli bir araç olduğunu göstermektedir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedürler, CRCHUM'un Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandıktan sonra Kanada Hayvan Bakımı Konseyi kılavuzlarını izleyerek gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, ticari bir kaynaktan elde edilen sekiz haftalık dişi BALB/c fareleri kullanılmıştır (bakınız Malzeme Tablosu). Hayvanlara 2 hafta boyunca% 10 inülin wt / wt ile diyet takviyesi verildi. Bir kontrol grubu, inülin takviyesinden yoksun benzer bir diyet aldı. Farelerin diyete ad libitum erişimi vardı. Tahlilin genel bir bakışı Şekil 1'de gösterilmiştir.

FITC-dekstran absorpsiyon çalışma diyagramı; sıçan, oral gavaj, floresan ölçümü, analiz kurulumu.
Resim 1: FITC-dextran testinin şeması. Gavage'den T−4-4 saat önce, gıda erişimi kaldırıldı. T0- FITC-dextran oral gavage yoluyla uygulandı. T1 - 1 saat sonrası gavaj, in vivo floresan değerlendirildi. T4- 4 saat sonrası gavaj, dışkı ve plazma örnekleri toplandı ve floresan ölçüldü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. FITC-dextran yönetimi

  1. FITC-dextran'ı uygulamadan önce, suya ad libitum erişimini korurken fareleri 4 saat boyunca hızlandırın.
    NOT: Oruç tercihen ışık döngüsünün başlangıcında (sabahları) başlatılmalıdır. Fareler, koprofajiyi sınırlamak için oruç sırasında yatak takımları olmadan yeni bir kafese aktarılabilir.
  2. Steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) (fare başına) içinde seyreltilmiş 200 μL 80 mg · mL−1 4 kDa FITC-dextran ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. Numuneleri uygulamadan hemen önce taze olarak hazırlayın ve ışıktan koruyun.
  3. FITC-dextran süspansiyonunun 200 μL'sini, top veya armut şeklinde uçlu 38 mm 22 G sterilize, kavisli bir gavage iğnesi kullanarak her fareye oral gavage yoluyla uygulayın (bkz. İlk gavajdan sonra bir zamanlayıcı başlatın ve in vivo ölçümlere izin vermek için bir sonraki fareyi gavaging yapmadan önce 5-10 dakika bekleyin (adım 2), her zaman 1 saat sonrası gavajı koruyun. Standart eğri için kalan FITC-dextran süspansiyonunu koruyun.
    NOT: Gavage'ın hemen ardından, dışkı oluşumunu sağlamak için yiyecekler değiştirilebilir.

2. İn vivo floresan ölçümü

  1. Gavajdan 1 saat sonra fareleri% 2.5 izofluran veya alternatif bir anestezi kullanarak anestezi yapın. Ayak parmağını veya kuyruğu sıkıştırarak ve hayvanın tepki vermemesini sağlayarak hayvanın uygun şekilde uyuşturulduğunu doğrulayın.
    1. Elektrikli tıraş makinesi kullanarak kürkü karın bölgesinden çıkarın ve kurumasını önlemek için gözlere cömertçe oftalmik yağlama merhemi uygulayın. Ardından, fareleri dorsal olarak yatan görüntüleme odasına ayrı ayrı yerleştirin.
      NOT: İn vivo görüntüleme sırasında arka planı hesaba katmak için FITC-dextran yerine PBS veya salin alan bir kontrol faresi dahil edilmelidir.
  2. Bir floresan görüntüleme odası kullanarak fareleri görüntüleyin (bkz. Lazer uzunluğunu 470 nm'ye ve çözünürlüğü 2,0 mm'ye ayarlayarak karın bölgesinin görüntülerini alın.
    1. Başlat düğmesine tıklayıp basılı tutarak makineyi ve yazılımı başlatın . Sistemin ısınmasına izin verin.
      NOT: Sistemin ısınması için 20 dakika veya daha fazla bir süre gerekebilir, bu nedenle farelerin gavajdan 1 saat sonra görüntülenmesine müdahale etmemek için makinenin erken başlatılması gerekir.
    2. Cihaz durumu'na tıklayın ve devam etmeden önce yapılandırılan tüm cihazların "Tamam" gösterdiğinden emin olun.
    3. Gerekirse, Lazer kontrolüne tıklayarak ve ardından istenen lazerin Lazer adı düğmesine tıklayarak uygun lazeri ısıtın.
    4. Yeni etüde tıklayarak yeni bir etüt başlatın. İstediğiniz adla uygun dosyanın altına kaydedin.
    5. Etüt seçeneklerine tıklayın, ardından Numune Kimliğini girin ve doğru lazeri seçin ve deneyin.
    6. Görüntüleme odasını açın ve hayvanı dorsal olarak tarama plakasına yerleştirin. Uzuvları ve kuyruğu bantla sabitleyin ve burun ve ağzın anestezi tüpüne sıkıca oturduğundan ve % 2.5 izofluran koruduğundan emin olun.
    7. Tarama plakasının yüksekliğini, tarama bölgesi hayvanın orta çizgisinden biraz ventral olacak şekilde ayarlayın. Görüntüleme odasının içindeki ayar düğmesini çevirerek plakayı ayarlayın. Görüntüleme odası kapağını kapatın ve kilitleyin.
    8. Çizim aracını kullanarak taranacak alanı seçin. Karnın tüm genişliğini karaciğerin hemen üstünden rektuma kadar dahil edin. Çizildikten sonra alanı ayarlamak için Değiştir aracına tıklayın.
    9. Tarama çözünürlüğünü 2,0 mm'ye ayarlayın ve ardından İleri'ye tıklayın. Güç otomasyonu tamamlandıktan sonra, ayarların doğru olduğundan emin olun ve gerekli ayarlamaları yapın. Taramayı başlatmak için Başlat'a tıklayın.
    10. Tarama tamamlandıktan sonra, hayvanı görüntüleme odasından çıkarın ve anesteziden kurtulurken vücut ısısını korumak için bir inkübatöre yerleştirin.
    11. Ayarları korumak için Çalışmaya devam et'e tıklayın ve ardından tüm fareler taranana kadar 2.2.5-2.2.10 adımlarını tekrarlayın.
    12. Güç düğmesine tıklayın ve görüntüleme odasını kapatmak için 3 saniye basılı tutun.
  3. Kullanılan görüntüleme sistemiyle ilişkili bir yazılım kullanarak her hayvanın abdominal floresansını ve kontrol faresini eşit ölçekteki görüntülerde karşılaştırarak floresanı değerlendirin (bkz.
    1. Görüntü dosyalarını seçilen dosya adı altında bularak açın. Ayarları senkronize edilmiş tüm dosyaları aynı anda açın.
    2. Görüntü ayarları araç çubuğunu kullanarak, görüntülerin ayarlarını senkronize etmek için Görüntüyü senkronize et ve Ölçeği senkronize et düğmelerini kullanarak doğru bir karşılaştırma yapın.
    3. Görüntüleri ayarlanmış ölçekleriyle kaydedin.

3. Fekal örneklerde ve plazmada floresan ölçümü

  1. Gavage'dan 4 saat sonra steril bir tüpte her fareden bir dışkı pelet toplayın. Tüpleri karanlıkta buz üzerinde tutun.
  2. 240 mg/mL pentobarbital sodyumun intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla fareleri anestezi altına alın (seyreltme, 1:100; bakınız Malzeme Tablosu). 0.03 mL / g vücut ağırlığının bir dozunda uygulayın.
    1. Retro-orbital pleksus14'e bir cam kılcal tüp yerleştirerek pıhtılaşmayı önlemek için heparin veya EDTA içeren plazma toplama için yapılmış bir tüpte en az 700 μL'lik kan örnekleri toplayın (bkz.
      NOT: Kan alımı için alternatif yöntemler arasında kardiyak ponksiyon veya kuyruk damarından çekilme bulunur. Bu bir terminal prosedürü olduğundan, farelerin servikal çıkık veya alternatif bir insancıl yöntemle ötenazi yapılması gerekir. Ötanazi için yerel hayvan etik komitesi tavsiyelerine uyun.
  3. Kan örneklerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 9.390 x g'da santrifüj yapın. Plazmayı yeni bir steril tüpe aktarın ve buz üzerinde karanlıkta tutun.
  4. 50 mg dışkı örneğini 200 μL 1x PBS içinde seyreltin ve plazmayı 1: 2 ile 1x PBS ile seyreltin. Seyreltme oranı, floresan sinyalinin yoğunluğuna bağlı olarak değiştirilebilir.
  5. 1x PBS'de FITC-dextran'ın seri seyreltmelerini kullanarak standart bir eğri oluşturun. En yüksek konsantrasyon olan 20 mg · mL−1 FITC dekstrandan başlayarak, seri olarak 7-10 kez 1: 1 faktörle seyreltilir.
    NOT: Bu nedenle konsantrasyonlar 20 mg·mL−1, 10 mg·mL−1, 5 mg·mL−1, 2.5 mg·mL−1, 1.25 mg·mL−1, 0.625 mg·mL−1, 0.3125 mg·mL−1, vb.
  6. Plaka 100 μL numuneler ve standartlar opak siyah 96 delikli bir plakada. PBS boşluğunu ekleyin. Floresanı bir floresan plaka okuyucusunda (bakınız Malzeme Tablosu) 530 nm'de absorpsiyon ve 485 nm'de uyarma ile okuyun.
    NOT: Numuneler ve standartlar çift veya üçlü olarak kaplanabilir ve daha sonra floresan değerlerinin ortalaması alınır.
  7. Floresanı standart eğrinin bilinen konsantrasyonlarıyla karşılaştırarak numune başına FITC-dextran konsantrasyonunu belirleyin. Numunelerde, konsantrasyonu seyreltme faktörü ile çarpın (adım 3.5).

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İn vivo floresan analizi, sadece kontrol diyetini alan farelerin, inülin takviyeli diyet alan farelere kıyasla karın boşluğunda daha yüksek hepatik FITC-dextran alımına ve daha yüksek seviyelerde artık floresan seviyesine sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 2A). İnülin diyetini alan farelerin caecumunda bir miktar floresan görülebiliyordu, ancak bu diyetlerin artan bağırsak geçirgenliğine karşı korunduğunu gösteren hepatik alım çok az veya hiç yoktu.

Plazma ve dışkı numunelerindeki floresan seviyeleri, in vivo muadillerini güçlendirmek ve ölçmek için çalışır. İnülin takviyeli diyet alan fareler, plazmalarında sadece kontrol diyetini alan farelere kıyasla önemli ölçüde daha düşük FITC-dekstran seviyelerine sahipti (Şekil 2B). Bu, bağırsak bariyeri fonksiyonunu geliştirdiklerini gösterir, çünkü daha az FITC-dextran bağırsak bariyerini dolaşıma nüfuz edebilir. Buna uygun olarak, inülin diyetini alan farelerin dışkılarında sadece kontrol diyetini alan farelerden önemli ölçüde daha yüksek FITC-dekstran seviyeleri vardı (Şekil 2C). Bu, FITC-dekstran'ın normal kabul edildiği gibi atılıma kadar kolonda kalması nedeniyle sağlam bağırsak bariyeri fonksiyonuna sahip olduklarını güçlendirir. Kontrol farelerinin dışkısındaki düşük FITC-dextran seviyeleri, uygun şekilde atılmak yerine bağırsak bariyerinden dolaşıma nüfuz ettiğini gösterir. Plazmadaki yüksek FITC-dextran seviyeleri bu bulguyu güçlendirmektedir.

FITC-dekstran ile 530 nm'de in vivo floresan analizi; Plazma ve dışkı konsantrasyon çizelgeleri.
Şekil 2: İnülin ile diyet takviyesi, FITC-dextran'ın bağırsak bariyeri boyunca translokasyonunu azaltır. (A) FITC-dextran'ın artık floresansı ve hepatik alımı. Kırmızı = en yüksek yoğunluk; koyu mor = en düşük yoğunluk. Maksimum floresan 2.15 x 103, minimum floresan 0.378. (B) FITC-dekstranın plasmatik konsantrasyonu. P = 0.010. (C) FITC-dekstranın dışkı konsantrasyonu. P = 0.00003. Grup başına N = 4. Veriler SEM ± ortalama olarak gösterilir. Her nokta bir fareyi temsil eder. Eşleşmemiş Öğrencinin t-testi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak bariyeri fonksiyonu, birçok farklı hastalık sürecinin ayrılmaz bir parçasıdır. Bu nedenle, bağırsak geçirgenliğinin invaziv olmayan, uygun maliyetli ve ölçülebilir bir şekilde değerlendirilmesi, bu hastalıkların hayvan modellerinde doğru bir şekilde temsil edilmesi için gereklidir. FITC-dextran testi bu temsil için olanak sağlar. Bununla birlikte, bu protokol güvenilir sonuçlar elde etmek için doğru bir şekilde tamamlanması gereken birkaç kritik adımı içerir. İlk olarak, uygun boyutta FITC-dextran kullanımının sağlanması esastır. İn vivo geçirgenliği incelemek için, 4 kDa FITC-dextran optimal moleküler ağırlıktır ve moleküler ağırlık arttıkça geçirgenlikazalır 15. Bu nedenle, farklı bir moleküler ağırlığa sahip FITC-dextran kullanmak kafa karıştırıcı veya güvenilmez sonuçlar sağlayabilir. Ek olarak, her bir gavajın zamanını not etmek ve in vivo veri toplama ve plazma ve dışkı toplama için zaman noktalarını buna göre ayarlamak önemlidir. Örneğin, iki fare 10 dakika arayla gavaged edilirse, in vivo floresan okumaları ve dışkı ve plazma toplanması da 10 dakika arayla gerçekleşmelidir. Floresansı aynı zaman noktalarında karşılaştırmak, geçirgenlikteki farklılıkların daha doğru bir şekilde temsil edilmesini sağlar. Ayrıca, farklı gruplardan hayvanların test edilme sırası, zamanlama nedeniyle kümelenme etkisini önlemek için değiştirilmelidir. Önce Grup A'daki tüm hayvanları, daha sonra Grup B saniyesindeki (AAABBB) tüm hayvanları test etmek yerine, grubun her hayvandan (ABABAB) sonra değiştirilmesi önerilir.

Bu tahlil, bir görüntüleme makinesine erişim eksikliği varsa, yalnızca plazma ve dışkı örneklerinin değerlendirilmesini içerecek şekilde değiştirilebilir. Doğrudan floresan görüntüleme in vivo olarak hepatik alımın ve rezidüel abdominal floresanın görüntülenmesine izin vermesine rağmen, plazma ve fekal örneklerdeki floresanın değerlendirilmesi hala bağırsak geçirgenliğinin kantitatif bir ölçümünü sağlar. Ayrıca, tarif edilen deneyde gösterildiği gibi, plazma ve dışkıdaki floresan seviyeleri in vivo görüntüleme ile iyi ilişkilidir. Ek olarak, bu test sadece in vivo görüntülemeyi içerecek şekilde değiştirilebilir. Bu, diğer parametreleri test etmeye devam etmek veya bağırsak geçirgenliğinin zaman içinde nasıl değiştiğini izlemek için hayvanların canlı tutulmasını sağlar. Bu nedenle, bu tahlili değiştirme yeteneği, onu erişilebilir, ancak yine de niceliksel hale getirir. Son olarak, her fareye verilen 80 mg · mL − 1 FITC-dekstran'ın 200 μL'lik dozu daha önce kullanılmış ve vücut ağırlığında küçük farklılıklar olan farelerde etkili olduğu gösterilmiştir16. Ayrıca, temsili sonuçlar bölümünde kullanılan tüm farelerin yaklaşık 20 g ağırlığında olduğunu ve her fare için aynı dozajın kullanılmasına izin verdiğini belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, vücut ağırlığındaki farklılıkları hesaba katmak için, FITC-dextran, örneğin17 gibi 0.6-0.8 mg / g vücut ağırlığındaki bir dozajda uygulanabilir. En önemlisi, kullanılan dozajdan bağımsız olarak, komplikasyonları veya rahatsızlığı önlemek için her fareye verilen miktarı 10 mL · kg − 1'den daha az bir miktarla sınırlamak önemlidir18.

FITC-dextran testi, bağırsak bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için etkili bir yöntem sağlasa da, yine de bazı sınırlamaları vardır. Bu modelin bir sınırlaması, fareleri birkaç saat boyunca oruç tutmayı gerektirmesidir, yani bu sonuçları oruç tutmamış farelerden elde edilenlerle karşılaştırmak güvenilmezdir. Ek olarak, oruç, diyabet için hayvan modellerinde kan şekeri ölçümü gibi sıkı beslenme programları gerektiren bazı modellerdeki sonuçları etkileyebilir.

Bu sınırlamalara rağmen, FITC-dekstran testi, birçok klasik yöntemden daha kantitatif, çok yönlü, uygun maliyetli ve daha az invaziv olduğu için bağırsak geçirgenliğini analiz etmek için etkili bir yöntem olmaya devam etmektedir. Örneğin, bağırsak geçirgenliğini ölçmek için kullanılan yaygın problar, bazı avantajları olan küçük sakarit problar veya Cr-EDTA'dır19. Bununla birlikte, bazı sakkarit probları sadece bölgeye özgü geçirgenliğe sahiptir. İnce bağırsağın distal kısmında hidrolize olduklarından, kolonik geçirgenlik hakkında hiçbir fikir vermezler19. Öte yandan, Cr-EDTA kolonik geçirgenlik hakkında bilgi sağlayabilir, ancak 24 saat boyunca ölçümler gerektirir, bu da bu yöntemin zaman yükünü FITC-dekstran testi20'ninkinden çok daha yüksek hale getirir. Ayrıca, bu yöntemlerin hiçbiri bu testin doğrudan in vivo görüntülenmesini sağlamaz. Bu nedenle, FITC-dextran testi, bağırsak geçirgenliğini ölçmek için alternatif yöntemlere kıyasla nispeten basit, doğrudan ve etkili bir seçenek sunar.

Son olarak, IBD4, Alzheimer hastalığı21 ve karaciğer hastalığı2 gibi hastalık süreçlerinde, bağırsak geçirgenliği, çalışmaları iyileştirmek için FITC-dekstran testi kullanılarak ölçülebilecek önemli bir parametredir. Örneğin, IBD'ler için immünoterapiler gibi yeni tedavilerin geliştirilmesinde, bu tahlil, bağırsak bariyeri bütünlüğünü korumak için terapinin etkinliğini test etmek için kullanılabilir. Bozulmuş bağırsak bariyeri fonksiyonunun UC'deki kronik inflamasyonun sürdürülmesinde rol oynayabileceği göz önüne alındığında, örneğin, bir terapinin artan geçirgenliğe karşı ne kadar iyi korunduğunu incelemek önemlidir4. Bu sadece bir örnektir, ancak FITC-dextran testi, araştırmanın birçok farklı alanında ve yönüyle bağırsak geçirgenliğini ölçmenin erişilebilir ve ölçülebilir bir yoludur.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir açıklamaları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi'nden bir hibe ile finanse edilmiştir (MMS'ye RGPIN-2018-06442 hibesi). CRCHUM'daki hayvan tesisine ve Kardiyovasküler Fenotipleme Platformundan Dr. Junzheng Peng'e teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
50 ppm Fe Diyeti (% 10 İnülin)Envigo TekladTD.190651Temsili Sonuçlar
50 ppm Fe Diyeti (FeSO4)Envigo TekladTD.190723Temsili Sonuçlar
BALB/c Fareler 49-55 Gün, DişiCharles River 028BALB/CTemsili Sonuçlar
BD 1 mL Şırınga Tüberkülin Kayma UcuBecton, Dickinson and Company309659Gavaj için
BD Microtainer Tüpleri - LH (Lityum Heparin)ileBecton, Dickinson and Company365965Plazma toplama için
Santrifüj 5420EppendorfS420KN605698
Kavisli Gavaj İğnesi (Gavaj Kanülü) 7.7.0 38 mm x 22 GHarvard Apparatus Canada34-024Artık mevcut değil - Instech Labs'ta potansiyel bir alternatif mevcuttur (FTP-22-38) 
Ötenazil (Pentobarbital Sodyum) 240 mg/mLBimeda-MTC Hayvan Sağlığı A.Ş.1417041/100 seyreltme; 0.03 mL / g vücut ağırlığında intraperitoneal enjeksiyon yoluyla uygulanır
FITC-dekstran 4TdB Labs20550
Heparinize Kılcal TüplerKimble Chase Yaşam Bilimleri ve Araştırma2501Retro-orbital kan alımı için
Mikroplaka, PS, 96 oyuklu, Düz tabanlı (Baca Kuyusu), Siyah, Flutrac, Med. BağlayıcıGreiner Bio-one655076
MiniARCO Kesme KitiEpilasyon içinCL8787-KIT
Optix MX2 ve Optix Optiviewİleri Araştırma Teknolojileri2.02.00.6Floresan görüntüleme makinesi ve yazılımı
Fosfat Tamponlu Salin 1x (PBS)Wisent Inc311-010-LL
Puralube Veteriner MerhemDechra12920060Anestezi sırasında göz hasarını önlemek için oftalmik ointement
Spark Çok Plakalı OkuyucuTecan30086376
Kent Scientific

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. König, J., et al. Human intestinal barrier function in health and disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196(2016).
  2. Lorenzo-Zuniga, V., et al. Insulin-like growth factor I improves intestinal barrier function in cirrhotic rats. Gut. 55 (9), 1306-1312 (2006).
  3. Schwarz, B. T., et al. LIGHT signals directly to intestinal epithelia to cause barrier dysfunction via cytoskeletal and endocytic mechanisms. Gastroenterology. 132 (7), 2383-2394 (2007).
  4. Schmitz, H., et al. Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis. Gastroenterology. 116 (2), 301-309 (1999).
  5. Fouts, D. E., Torralba, M., Nelson, K. E., Brenner, D. A., Schnabl, B. Bacterial translocation and changes in the intestinal microbiome in mouse models of liver disease. Journal of Hepatology. 56 (6), 1283-1292 (2012).
  6. Galipeau, H. J., Verdu, E. F. The complex task of measuring intestinal permeability in basic and clinical science. Neurogastroenterology and Motility. 28 (7), 957-965 (2016).
  7. Bordoni, L., et al. Positive effect of an electrolyzed reduced water on gut permeability, fecal microbiota and liver in an animal model of Parkinson's disease. PLoS One. 14 (10), 0223238(2019).
  8. Wang, Q., Fang, C. H., Hasselgren, P. -O. Intestinal permeability is reduced and IL-10 levels are increased in septic IL-6 knockout mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (3), 1013-1023 (2001).
  9. Crapser, J., et al. Ischemic stroke induces gut permeability and enhances bacterial translocation leading to sepsis in aged mice. Aging. 8 (5), 1049-1063 (2016).
  10. Mal Earley, Z., et al. Burn injury alters the intestinal microbiome and increases gut permeability and bacterial translocation. PLoS One. 10 (7), 0129996(2015).
  11. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  12. Schroeder, B. O., et al. Bifidobacteria or fiber protects against diet-induced microbiota-mediated colonic mucus deterioration. Cell Host & Microbe. 23 (1), 27-40 (2018).
  13. Hajjar, R., et al. Improvement of colonic healing and surgical recovery with perioperative supplementation of inulin and galacto-oligosaccharides. Clinical Nutrition. 40 (6), 3842-3851 (2021).
  14. JoVE. Lab Animal Research. Blood Withdrawal I. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
  15. Costantini, T. W., et al. Quantitative assessment of intestinal injury using a novel in vivo, near-infrared imaging technique. Molecular Imaging. 9 (1), 30-39 (2010).
  16. Thevaranjan, N., et al. Age-associated microbial dysbiosis promotes intestinal permeability, systemic inflammation, and macrophage dysfunction. Cell Host & Microbe. 21 (4), 455-466 (2017).
  17. Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104, 1-14 (2014).
  18. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  19. Arrieta, M. C., Bistritz, L., Meddings, J. B. Alterations in intestinal permeability. Gut. 55 (10), 1512-1520 (2006).
  20. von Martels, J. Z. H., Bourgonje, A. R., Harmsen, H. J. M., Faber, K. N., Dijkstra, G. Assessing intestinal permeability in Crohn's disease patients using orally administered 52Cr-EDTA. PLoS One. 14 (2), 0211973(2019).
  21. Gonzalez-Escamilla, G., Atienza, M., Garcia-Solis, D., Cantero, J. L. Cerebral and blood correlates of reduced functional connectivity in mild cognitive impairment. Brain Structure and Function. 221 (1), 631-645 (2016).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ba rsak Ge irgenli iFITC Dekstran AnaliziIn Vivo G r nt lemeOral GavagePlazma FloresansFekal FloresansFloresan Plaka OkuyucuHepatik Al mStandart E ri

İlgili makaleler