Hasta kaynaklı organoidler (PDO), tümör ortamını in vitro olarak taklit edebilen üç boyutlu (3D) bir kültürdür. Yüksek dereceli seröz over kanserinde, PDO'lar yeni biyobelirteçleri ve terapötikleri incelemek için bir model oluşturur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yüksek Dereceli Seröz Yumurtalık Kanseri Hasta Kaynaklı Organoidlerin Üretimi ve Kültürlenmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Organoidler, hasta kaynaklı yumurtalık tümör dokusundan, asitlerinden veya plevral sıvıdan başarıyla yetiştirilebilen ve yumurtalık kanseri için yeni terapötiklerin ve prediktif biyobelirteçlerin keşfine yardımcı olan 3D dinamik tümör modelleridir. Bu modeller klonal heterojenliği, tümör mikroçevresini ve hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini özetler. Ek olarak, primer tümörü morfolojik, sitolojik, immünohistokimyasal ve genetik olarak eşleştirdikleri gösterilmiştir. Böylece, organoidler tümör hücreleri ve tümör mikroçevresi üzerinde araştırmayı kolaylaştırır ve hücre hatlarından üstündür. Mevcut protokol, %97'den daha yüksek başarı oranına sahip hasta tümörleri, asitler ve plevral sıvı örneklerinden hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri üretmek için farklı yöntemler tanımlamaktadır. Hasta örnekleri hem mekanik hem de enzimatik sindirim ile hücresel süspansiyonlara ayrılır. Hücreler daha sonra bir bazal membran ekstresi (BME) kullanılarak kaplanır ve yüksek dereceli seröz yumurtalık kanserinin (HGSOC) kültürlenmesine özgü takviyeler içeren optimize edilmiş büyüme ortamı ile desteklenir. İlk organoidleri oluşturduktan sonra, PDO'lar sonraki deneyler için genişleme için pasaj da dahil olmak üzere uzun vadeli kültürü sürdürebilir.
Giriş
2021 yılında, Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 21.410 kadına yeni epitel yumurtalık kanseri teşhisi kondu ve 12.940 kadın bu hastalıktan öldü1. Cerrahi ve kemoterapide yeterli ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların %70'inden fazlası kemoterapötik direnç geliştirir ve tanıdan sonraki 5 yıl içinde ölür 2,3. Bu nedenle, bu ölümcül hastalığı tedavi etmek için yeni stratejilere ve klinik öncesi araştırmalar için temsili, güvenilir modellere acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
Kanser hücre hatları ve primer over tümörlerinden oluşt....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Araştırma için toplanan tüm insan dokusu örnekleri, Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokole göre elde edilmiştir. Aşağıda özetlenen protokoller steril bir insan doku kültürü ortamında gerçekleştirilmiştir. İnsan deneklerden bilgilendirilmiş yazılı onam alındı. Uygun hastaların yumurtalık kanseri tanısı veya varsayılan tanısı olması, bilgilendirilmiş onam imzalamaya istekli ve yetenekli olması ve en az 18 yaşında olması gerekiyordu. Tümör dokusu (malign primer tümör veya metastatik bölgeler), asit ve plevral sıvı onay veren hastalardan işlem sırasında elde edildi. Bu örnekler derhal laboratuvara taşındı ve aşağıda özetlenen yöntemler kullanılarak organoid üreti....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
PDO'lar üretmek için, numuneler mekanik ve enzimatik olarak tek hücreli süspansiyonlara sindirildi. Hücreler daha sonra BME'de yeniden askıya alındı ve özel olarak tasarlanmış ortamlarla desteklendi (Şekil 3). Organoidler tipik olarak 10 günlük bir zaman diliminde kurulur, daha sonra kültürde ayrı organoidler gösterirler (Şekil 4).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yumurtalık kanseri, tanıdaki ileri aşaması ve kemoterapi direncinin ortak gelişimi nedeniyle son derece ölümcüldür. Yumurtalık kanseri araştırmalarında kanser hücre hatları ve PDX modelleri kullanılarak birçok ilerleme kaydedilmiştir; Bununla birlikte, daha temsili ve uygun fiyatlı bir in vitro modele belirgin bir ihtiyaç vardır. PDO'ların tümör heterojenliğini, tümör mikroçevresini ve primer tümörlerinin genomik ve transkriptomik özelliklerini doğru bir şekilde temsil ettiği kanıtlanmıştır ve bu nedenle, ilaç t.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Ron Bose, MD, PhD'nin rehberliği ve bu protokolün oluşturulmasında Barbara Blachut, MD'nin yardımı için minnettarız. Ayrıca, St. Louis'in Kadın Hastalıkları ve Doğum Bölümü ve Jinekolojik Onkoloji Bölümü'ndeki Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne, Washington Üniversitesi Dekan'ın Akademik Programı'na ve Üreme Bilim İnsanı Geliştirme Programı'na bu projeye verdikleri destek için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %1 HEPES | Yaşam Teknolojileri | 15630080 | |
| %1 Penisilin-Streptomisin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tüpleri | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Doku Kültürü Kabı | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serolojik Pipet | |||
| 100 & mikro; m Hücre Filtresi | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL santrifüj tüpleri | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| %2 Paraformaldehit Fiksatif | Sigma-Aldrich | ||
| 37 ° C su banyosu | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Şartlandırılmış Ortam Takviyesi | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 kuyulu plakalar | TPP | 92006 | |
| %70 Etanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Gelişmiş DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Yaşam Teknolojileri | 17504044 | |
| Santrifüjü | |||
| Cultrex Tip 2 | Ar-Ge D Systems | 3533-010-02 | bazal membran özü |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNaz I Reaksiyon Tamponu | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tüpler | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Isıtıcılı Octo Dissociator | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | Üretici protokolünü kullanıyoruz. |
| GlutaMAX | Yaşam Teknolojileri | 35050061 | dipeptid, L-alanil-L-glutamin |
| Hematoksilen ve Eozin Boyama Kiti | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Parafin Balmumu | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Bay Frosty Dondurma Kabı | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-asetilsistein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nikotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Uçlu Pipet | |||
| p200 Uçlu Pipet | |||
| Pasteur Pipetleri 9 " | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Kontrol Cihazı | |||
| Prostaglandin E2 | R& D Sistemleri | 2296 | |
| Puromisin ve nbsp; | ThermoFisher | A1113802 | |
| Rekombinant Murin Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Geri Kazanım Hücre Kültürü Donma Ortamı | İnvitrojen | 12648010 | |
| Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu | BioLegend | 420301 | |
| ROCK İnhibitörü (Y-27632) | R& D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Doku Kültürü Başlığı | |||
| Doku Gömme Kaset | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | hayvan kökenli, rekombinant enzim |
| Tip II Kollajenaz | Yaşam Teknolojileri | 17101015 | |
| Vorteks |
Kaynaklar
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H. Organ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
