İmmünofloresan Tahlilleri ile Hasta Kaynaklı Yumurtalık Kanseri Organoidlerinde DNA Hasar Onarım Proteinlerinin Görselleştirilmesi

Yumurtalık kanseri jinekolojik maligniteye bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir. Hastaların çoğunluğu karboplatin gibi DNA'ya zarar veren ilaçlarla tedavi edilir ve homolog rekombinasyon onarımı (HRR) eksikliği olan tümörleri olanlara poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörleri^{verilebilir 1,2}. Bununla birlikte, çoğu hasta bu tedavilere direnç geliştirir ve tanıdan sonraki 5 yıl içinde ölür. DNA hasar yanıtının (DDR) düzensizliği, yumurtalık kanseri gelişimi ve hem kemoterapi hem de PARP inhibitörü direnci ile ilişkilendirilmiştir³. Bu nedenle, DDR'nin incelenmesi, yumurtalık kanserinin patofizyolojisini, potansiyel biyobelirteçleri ve yeni hedefe yönelik tedavileri anlamada zorunludur.

DDR'yi değerlendirmek için mevcut yöntemler, DNA hasar proteinlerinin ve nükleotid analoglarının doğru tanımlanmasına ve lokalizasyonuna izin verdiği için immünofloresan (IF) kullanır. DNA'da çift sarmallı bir kırılma (DSB) olduğunda, histon proteini H2AX hızla fosforile edilir ve DNA hasarı onarım proteinlerinin^4'ü bir araya getirdiği bir odak oluşturur. Bu fosforilasyon, IF kullanılarak kolayca tanımlanabilir; Aslında, ɣ-H2AX testi, bir DSB 5,6,7,8,9'un indüksiyonunu doğrulamak için yaygın olarak kullanılmıştır. Artmış DNA hasarı, DNA'ya zarar veren ajanların platin duyarlılığı ve etkinliği ile ilişkilendirilmiştir 10,11,12 ve ɣ-H2AX^, diğer kanser tedavilerinde kemoterapi yanıtı ile ilişkili bir biyobelirteç olarak önerilmiştir¹³. Bir DSB üzerine, HRR'de yetkin bir hücre, BRCA1 ve BRCA2'nin replikasyon proteini A'nın (RPA) yerini alması ve DNA'ya bağlanması için RAD51'i işe almasına yol açan bir dizi olay gerçekleştirir. HRR onarımı, DSB'yi sadık bir şekilde onarmak için bir DNA şablonu kullanır. Bununla birlikte, tümörler HRR'de eksik olduğunda, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) gibi alternatif onarım yollarına güvenirler. NHEJ'nin hataya eğilimli olduğu bilinmektedir ve hücre üzerinde yüksek mutasyonel bir yük oluşturur, bu da 53BP1'i pozitif bir düzenleyici¹⁴ olarak kullanır. Bu DNA hasarı proteinlerinin hepsi IF kullanılarak odaklar olarak doğru bir şekilde tanımlanabilir. Proteinler için boyamaya ek olarak, IF çatal korumasını ve tek sarmallı DNA boşluğu oluşumunu incelemek için kullanılabilir. Stabil çatallara sahip olma yeteneği platin yanıtı ile ilişkilendirilmiştir ve son zamanlarda, boşluk testleri PARP inhibitörlerine ^6,15,16,17 yanıtını tahmin etme potansiyelini göstermiştir. Bu nedenle, genoma girdikten sonra nükleotid analogları için boyama, DDR'yi incelemenin başka bir yoludur.

Bugüne kadar, yumurtalık kanserinde DDR'nin değerlendirilmesi büyük ölçüde klonal heterojenliği, mikroçevreyi veya in vivo tümörlerin mimarisini özetlemeyen homojen 2D hücre hatları ile sınırlandırılmıştır^18,19. Son zamanlarda yapılan araştırmalar, organoidlerin DDR^{mekanizmaları} 6 gibi karmaşık biyolojik süreçleri incelemede 2D hücre hatlarından daha üstün olduğunu göstermektedir. Mevcut metodoloji PDO'larda RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA ve geminin'i değerlendirmektedir. Bu yöntemler bozulmamış organoidi değerlendirir ve DDR mekanizmalarının in vivo tümör mikroçevresine daha benzer bir ortamda incelenmesine izin verir. Konfokal mikroskopi ve otomatik odak sayımı ile birlikte, bu metodoloji yumurtalık kanserinde DDR yolunun anlaşılmasına ve hastalar için tedavi planlarının kişiselleştirilmesine yardımcı olabilir.

Tümör dokusu ve asit, St. Louis Kurumsal İnceleme Kurulu'ndaki (IRB) Washington Üniversitesi tarafından onaylanan jinekolojik onkoloji biyodeposunun bir parçası olarak hasta onayı alındıktan sonra elde edildi. İleri evre yüksek dereceli seröz over kanseri (HGSOC) olan hastalar dahil edildi. Tüm prosedürler aksi belirtilmedikçe tezgahta oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Tüm reaktifler oda sıcaklığında (aksi belirtilmedikçe) hazırlandı ve 4 ° C'de saklandı.

1. Organoid üretimi

1. Daha önce yayınlanan rapor^20'yi izleyerek organoidleri oluşturun.

2. Organoidlerin kaplanması ve ışınlanması

1. Kültürde organoidleri kullanarak, bir pipet ucunun manuel manipülasyonu yoluyla organoidlerin tırnaklarını kültür kabından çıkarın. Organoidleri 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
2. Konik tüpü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın. Bir pipet kullanarak, süpernatantı dikkatlice aspire edin.
3. Pelet için 1.000 μL hayvansal kökenli olmayan, rekombinant enzim ekleyin (bkz. Çözeltiyi karıştırın ve 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
4. Çözeltiyi 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın. Bir pipet kullanarak, süpernatanı dikkatlice aspire edin.
5. Santrifüjleme ve aspirasyondan sonra, peleti 1.000 μL fosfat tamponlu salin içinde yeniden askıya alın.
6. Çözeltinin 10 μL'sini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 μL tripan mavisi ile karıştırın.
7. Tripan mavi hücre çözeltisinin 10 μL'sini bir hücre sayma odası slaytına alın ve hücre sayma makinesine yerleştirin (bkz.
8. 8 delikli bir cam hazne kaydırağına 20 μL bazal membran ekstraktı (BME) başına 40.000 hücre plakalayın (bkz. Bu, hücrelerin organoidler oluşturmasına ve uygun bir boyuta büyümesine izin vermek için organoidleri 3-5 gün boyunca korur.
9. Çift sarmallı DNA kırılmalarını indüklemek için, kaplanmış organoidleri 10 Gri (Gy) ɣ-ışınlama ile ışınlayın (ışınlayıcı ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Bu işlem 5-10 dakika kadar sürebilir.
10. Kültür ortamlarındaki organoidleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de ve 4 saat boyunca% 5 CO_2'de inkübe edin.

3. İmmünofloresan boyama

NOT: Hacimler, 8 delikli hazneli kızağın (~300 μL) kuyucuk başına miktarını ifade eder.

1. Organoidlerin ışınlanması ve inkübasyonundan sonra, 3D matrisi bozmamak için ortamı bir pipetle dikkatlice aspire edin. 300 μL PBS ile yıkayın.
2. Organoidleri 10 dakika boyunca 300 μL% 2 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin.
   NOTLAR: BME depolimerize olacağından ve aspire edilebileceğinden çok uzun süre ayrılmayın.
3. Organoidleri 300 μL boyama tamponu ile yıkayın (bkz. 5 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.
4. Geçirgenlik için, nazikçe 300 μL geçirgenlik tamponu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 20 dakika boyunca inkübe edin. 300 μL boyama tamponu ile yıkayın. 5 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.
5. Geçirgenlik adımını engellemek için 300 μL boyama tamponu ekleyin. 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin. Bir pipet kullanarak boyama tamponunu aspire edin.
6. Boyama tamponunda seyreltilmiş 300 μL birincil antikor (tavşan anti-RAD51, fare anti-Geminin, tavşan anti-RPA, fare anti-H2AX, tavşan anti-Geminin, fare anti-53BP1; bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin. 16 saat boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   NOT: Aynı konakçı hayvanla birlikte lekelenmeyi önleyin. Antikorların komşu kuyucuklara karışmasını önlemek için kapağı kapalı bırakın.
7. Birincil antikor çözeltisini çıkarın. Çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca 300 μL boyama tamponu ile üç yıkama yapın.
8. Boyama tamponunda seyreltilmiş 300 μL ikincil antikor (keçi anti-fare Alexa fluor 488 ve keçi anti-tavşan Alexa fluor 647; bakınız Malzeme Tablosu) çözeltisi ekleyin ve karanlıkta 1 saat inkübe edin.
   NOT: Sonraki tüm adımlar karanlıkta gerçekleştirilmelidir.
9. İkincil antikor çözeltisini aspire edin. 300 μL seyreltilmiş DAPI ekleyin. 5 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.
10. Çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca 300 μL boyama tamponu ile üç yıkama yapın. Boyama tamponunu çıkarın ve hazne kızaklarıyla birlikte verilen sökme kitini kullanarak odaları ayırın (bkz.
    NOT: 3B matrisi bozmak için çok ileri itmediğinizden emin olun.
11. Ucu kesilmiş bir p200 pipet ucu kullanarak, her bir kuyucuğu bir organoid tırnakla (ör. her organoid tırnak için 20-30 μL) örtmek için montaj ortamı ekleyin (bkz.
12. Kabarcıklardan kaçınarak numunenin üzerine bir kapak kayması yerleştirin.
13. Şeffaf oje alın ve slaytı kapatmak için kapak camının kenarlarına boyayın. 1 saat sertleşmesine izin verin ve -20 ° C'ye yerleştirin.
    NOT: Görüntülemeden sonra, slayt en az floresan kaybıyla en az 6 ay saklanabilir.

4. Görüntüleme

1. Daldırma yağı ile 63x hedefte bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüler elde edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Nükleer proteinleri görüntülüyorsanız, 63x avantajlıdır, ancak 40x de kabul edilebilir.
2. Organoidleri göz merceğinden bulmak için DAPI kullanın. Kullanılan floroforlara göre mikroskopi için uygun filtreleri seçin. Z-stack görüntülerini yakalamak için parametreleri ayarlayın.
   NOT: Çalışmada kullanılan floroforlar DAPI, 488 ve 647 idi. Boyama işlemini görselleştirmek için 405, 488 ve 638 lazerler açıldı.
   NOT: Önerilen z-yığını, hedefin çözme gücüne bağlıdır.
3. Canlı görüntüyü ayarlayın: odağı, lazer yoğunluğunu vb. Ayarlayın.
   NOT: Lazer yoğunluğu ne kadar yüksek olursa, numunenin foto-ağartma olasılığı o kadar yüksek olur. Bu nedenle, optimum bir lazer yoğunluğu seçin.
4. Z-yığınını edinin.
   NOT: Bu işlem 5-10 dakika kadar sürebilir.
5. Z-yığınında toplanan görüntülerden, yığın başına en az üç görüntünün ekran görüntüsünü alın.
   NOT: Niceleme sırasında çekirdekleri çoğaltmamak için yığın boyunca ekran görüntüleri aldığınızdan emin olun.
6. Her dosyayı TIFF olarak kaydedin ve çözümlemeye devam edin (adım 5).

5. Analiz

NOT: Daha önce yayınlanan rapor^21'i izleyen tüm görüntü analizleri için JCountPro kullanın. Bu yazılımı edinmek için, ilişkili yayına başvurun.

1. Dosya seçimi sekmesindeki (programın alt kısmındaki) nesne analizi panelinin altında (programın üst kısmı), TIFF dosyalarını seçin.
2. Seçili dosyaları seçili dosyalar grubuna taşımak için Ekle'yi tıklatın. Ekran'ı seçin.
3. Segmentasyon sekmesinin altında, çekirdeklerin rengi olarak maviyi seçin. Çekirdeklerin eşiğini optimize etmek için Otomatik segmentasyon'u seçin.
   NOT: Otomatik segmentasyon nesneleri doğru bir şekilde tanımlamazsa, kullanıcı ince ayarı ve ham ayarı görüntüye ayarlayabilir veya segmentasyonu daha da optimize etmek için kullanım kılavuzuna bakabilir.
4. Nesneler panelinin altında, Büyük nesneleri otomatik böl'ü seçin ve çekirdeklerin boyutunu en iyi duruma getirin.
   NOT: Çekirdekler genellikle koşulsuz boyutu 5.000 pikseldir, koşullu boyutu ise 1.500 pikseldir. Nesnelerin boyutunu daha da optimize etmek için kullanım kılavuzuna bakın.
5. Parametreleri test etmek için Nesneleri tanımla'yı seçin.
   NOT: Bu parametreler doğru değilse, boyut ve ayar diğer ayarlarla birlikte ayarlanabilir. Daha fazla optimizasyonla ilgili talimatlar için kullanım kılavuzuna bakın.
6. Parametrelerin görüntüyü ayarladıktan sonra, seçilen tüm görüntülerdeki çekirdekleri tanımlamak için Tüm Görüntülerdeki Nesneleri Tanımla'yı seçin.
7. Odak Analizi panelini seçin (programın üst kısmı).
8. Dosya seç sekmesinin altında (programın alt kısmında), nesne çözümlemesi için kullanılan TIFF dosyalarını seçin ve görüntüleri görüntü dosyaları grubuna taşımak için Ok Düğmelerini (>>) seçin.
9. Taşınan görüntü dosyalarının altındaki dizin grubunda, El İle Düzenle klasörünü çift tıklatın ve ioc dosyalarını nesne koleksiyonu dosyaları grubuna taşımayı seçin.
   NOT: Seçilen tüm TIFF'ler ioc dosyalarıyla eşleşmiş olmalıdır.
10. Dosyaları seçili dosyalar grubuna taşımak için Select (Seç ) düğmesine basın. Programın altındaki Odak sayımı sekmesini seçin.
11. Aşağıdaki adımları izleyerek parametreleri optimize edin.
    1. Üst şapka ayarları dizini: 12.
    2. Netleme kanalı: Odakların rengini seçin (yeşil: ɣ-H2AX; kırmızı: RAD51).
    3. H kubbe ayarları: kubbe yüksekliği %: 30; eşik %: 28 ve 28.
    4. Şekil/boyut ayarı: Minimum odak boyutu, piksel: 5. Şekil/Boyut Uygula'yı seçin. Maksimum odak boyutu (koşullu): 32. Minimum yuvarlaklık, x100: 96. Maksimum odak, piksel: 60.
    5. Gürültü filtresi: boyut 1.
       NOT: Bir çekirdeğin geminin boyanması için pozitif olup olmadığını belirlerseniz, ikinci kanalın altında yeşili seçin ve analiz altında yoğunluğu seçin.
12. Ayarlanan parametreleri test etmek için aşağıdaki düğmeleri sırayla seçin: Üst Şapka > H-Kubbe > Odak Sayısı.
    NOT: Bu parametreler işe yaramazsa, boyut ve ayar diğer ayarlarla birlikte ayarlanabilir. Görüntünün nasıl daha da optimize edilebileceği hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanım kılavuzuna bakın.
13. Parametreler seçilen görüntüler için optimize edildikten sonra, çekirdek başına her görüntüdeki odakları saymak için Otomatik say'ı seçin. İkinci kanal istenirse, program kullanılabilecek yoğunluğu belirleyecektir.

Sunulan protokol, organoidlerdeki nükleer DNA hasar onarım proteinlerini başarılı bir şekilde boyayabilir, görselleştirebilir ve ölçebilir. Bu teknik, ışınlamadan önce ve sonra PDO'ları boyamak ve değerlendirmek için kullanıldı. PDO'lar 10 Gy radyasyona maruz bırakıldı ve aşağıdaki biyobelirteçler için değerlendirildi: ɣ-H2AX (Şekil 1), DNA hasarının bir belirteci; HRR için bir belirteç olan RAD51 (Şekil 2); 53BP1, NHEJ'nin bir belirteci; RPA, çoğaltma geriliminin bir belirteci (Şekil 3); ve ikizler, bir G2 / S faz hücre döngüsü belirteci14. 10 Gy dozu, yumurtalık kanserinde DNA hasarını inceleyen daha önce yayınlanmış araştırmalara dayanarak seçildi 6,22. JCountPro yazılımı, çekirdeği tanımlamak ve resimli parametreler13 ile çekirdek içindeki odak sayısını ölçmek için kullanıldı (Şekil 4). Yazılım, çekirdeği (Şekil 4A, B), ardından nükleer odakları (Şekil 4C) tanımlar ve odakları ikizler-pozitif hücrelerden filtreler (Şekil 4D).

Resim 1: Işınlama öncesi ve sonrası PDO'larda ɣ-H2AX odakları. PDO'larda DAPI ve ɣ-H2AX odaklarının 63x insetlerle 10x'te ışınlama öncesi ve sonrası temsili görüntüleri. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: Işınlama öncesi ve sonrası PDO'larda RAD51 odakları ve ikizler. DAPI, geminin, RAD51'in temsili görüntüleri ve geminin/RAD51 odaklarının 63x insetlerle 10x'te ışınlamadan önce ve sonra birlikte boyanması. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Işınlama öncesi ve sonrası PDO'larda RPA ve 53BP1. (A) DAPI, RPA'nın temsili görüntüleri; (B) ikizler, 53BP1 ve geminin/53BP1 odaklarının 10x'te 63x insetlerle birlikte boyanması. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: JCountPro yazılımı niceleme iş akışı . (A) Nesne analizi altında, mavi nesneleri, çekirdekleri tanımlamak için mavi kanal seçilir, ardından otomatik segmentasyon (kırmızı ok) seçilerek otomatik olarak optimize edilir. (B) Otomatik bölme altında, nesne boyutu (çekirdekler) görüntünün boyutuna ve büyütmeye uyarlanır. Parametreleri test etmek için nesneyi tanımla düğmesi seçilir (1) ve her görüntünün nesnelerini (çekirdekleri) tanımlamak için Tüm görüntülerdeki nesneleri tanımla (kırmızı ok) düğmesi seçilir. (C) Odak analizi sekmesi altında, görüntüler girilir ve odak sayma parametreleri ayarlanır: ilk olarak, odakların rengi odak kanalının altında seçilir, yeşil; üst şapka endeksi 12 olarak ayarlanır; H kubbe ayarları, kubbe yükseklik yüzdesi 30 ve eşik yüzdesi 28 olacak şekilde ayarlanmıştır; odakların şekli ve boyutu, 60'ta maksimum odak boyutu pikselleri ve 96'da minimum yuvarlaklık x 100 manuel parametreleri ile görüntü boyutuna göre optimize edilir; Son olarak, gürültü filtresi uygulanır. Ayarlar, üst şapka, H kubbesi ve odak sayısı (1-3) uygulanarak test edilir. Hücre başına ɣ-H2AX odaklarını ölçmek için, başlat düğmesine basın (kırmızı ok). (D) RAD51 odakları için ayarlar, kırmızıya değiştirilen netleme kanalı hariç, ɣ-H2AX odakları için gösterildiği gibi uygulanır; Bununla birlikte, ikizler ile boyanmış çekirdekleri tanımlamak için, ikinci kanal yeşil olarak seçilir ve analiz yoğunluğa değiştirilir. Parametreler, üst şapka, H kubbesi ve odak sayısı (1-3) uygulanarak, ardından tüm RAD51 odaklarını ölçmek için başlat düğmesine (kırmızı ok) basılarak ve her görüntüde hücre başına yeşilin yoğunluğu değerlendirilerek test edilir. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.