Farelerde İn Vivo Periton Boşluğu Dokusunda Yerleşik Makrofajların Verimli Gen ve MikroRNA Modülasyonu için Lentiviral Vektör Hazırlığı

Özet

Periton dokusunda yerleşik makrofajlarda gen fonksiyonunun araştırılması için in vivo, lentiviral vektörler kullanılarak adım adım bir protokol gösteriyoruz.

Özet

Periton dokusunda yerleşik makrofajlar, homeostazın sürdürülmesinde geniş işlevlere sahiptir ve lokal ve komşu dokulardaki patolojilerde rol oynarlar. İşlevleri mikro-çevresel ipuçları tarafından belirlenir; Bu nedenle, davranışlarını in vivo fizyolojik bir niş içinde araştırmak önemlidir. Şu anda, spesifik peritoneal makrofaj hedefleme metodolojileri, tüm fare transgenik modellerini kullanmaktadır. Burada, lentivirüs partikülleri kullanılarak peritoneal makrofajlarda mRNA ve küçük RNA türlerinin (örneğin, mikroRNA) ekspresyonunun etkili in vivo modülasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. Lentivirüs preparatları HEK293T hücrelerde yapıldı ve tek bir sükroz tabakası üzerinde saflaştırıldı. İntraperitoneal enjeksiyonu takiben lentivirüs etkinliğinin in vivo olarak doğrulanması, lokal dokuya sınırlı makrofajların baskın enfeksiyonunu ortaya çıkardı. Peritoneal makrofajların hedeflenmesi homeostaz ve tiyoglikolat ile indüklenen peritonit sırasında başarılı olmuştur. Lentivirüsün intraperitoneal verilmesinin neden olduğu düşük seviyeli inflamasyon ve potansiyel deneyler için zaman kısıtlamaları dahil olmak üzere protokolün sınırlamaları tartışılmaktadır. Genel olarak, bu çalışma in vivo peritoneal makrofajlarda gen fonksiyonunun hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için hızlı ve erişilebilir bir protokol sunmaktadır.

Giriş

Dokuda yerleşik makrofajlar (Mφ), istilacı patojenleri algılayan ve bunlara yanıt veren heterojen bir fagositik bağışıklık hücresi popülasyonudur ^1,2. Ek olarak, doku gelişiminde, yeniden şekillenmede ve homeostazın korunmasında önemli bir rol oynarlar ^1,3. Birçok doku Mφ, embriyogenez sırasında yolk kesesi progenitörlerinden türetilir ve yaşam boyunca dokuda kalır ^4,5. Bu hücrelerin fenotipi ve işlevleri, spesifik transkripsiyon faktörlerinin ve yerel mikro çevrenin işbirlikçi ve hiyerarşik etkileşimleri tarafından belirlenir 6,7,8,9. Bu bağımlılığın giderek daha iyi anlaşılması, Mφ'nin fizyolojik olarak ilgili nişleri içinde gen manipülasyonu için etkili in vivo yöntemlere olan ihtiyacı artırmaktadır.

Lentiviral vektörler, özellikle hem bölünen hem de bölünmeyen hücreleri enfekte etme ve konakçı genomuna stabil bir şekilde entegre olma yetenekleri nedeniyle, in vivo^10,11,12 spesifik hücre popülasyonlarında nükleik asitlerin manipülasyonu için sıklıkla kullanılan bir araçtır^13,14. Son yirmi yılda, lentivirüs dağıtım teknolojisi optimize edilmiş ve soya özgü hedeflemeyi artırmak için alternatif zarflar ve sentetik destekleyiciler araştırılmıştır ^8,15. Geniş hücre tropizmi nedeniyle, veziküler stomatit virüsü saran glikoprotein (VSV-G)^16,17, lentivirüs teknolojisinde kullanılan "altın standart" zarf haline gelmiştir.

Bu protokol^18'de, kısa firkete RNA'sının (shRNA) ve mikroRNA'nın (miR) fare peritoneal Mφ'ye (pMφ) in vivo, kararlı durumda¹⁹ hedefli ve etkili bir şekilde verilmesini göstermek için VSV-G psödotipli lentiviral partiküller kullanılır. Transgen ekspresyonu, dalak odak oluşturan virüs (SFFV) promotörü tarafından yönlendirildi. Hücrelerin üretken enfeksiyonu, lentivirüs türevli gelişmiş yeşil floresan proteinin (GFP) ekspresyonu ile tanımlandı. Bu yaklaşımın kullanılması, optimal dozu ve deneysel zaman çerçevesini tanımlamak için in vivo lentivirüs deneyleri için kolay okumaya izin verdi. Son olarak, tiyoglikolatın neden olduğu inflamasyon sırasında farelerin in vivo lentiviral mücadelesi, seçici pMφ enfeksiyonu için doğal eğilimi ortaya çıkardı.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Kurumsal ve Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür.

NOT: Lentivirüs ile yapılan tüm in vivo çalışmalar, araştırmada hayvanların etik kullanımına ilişkin yerel ve ulusal yönergelere göre ve ayrıca kategori II bulaşıcı materyallerin kullanımıyla ilgili tüm düzenlemelere bağlı kalarak yapılmalıdır. Hayvan refahı da yerel düzenlemelere uygun olarak izlenmelidir. Protokolün bu adımında, lentiviral partiküller ve kesici aletlerle çalışırken çok dikkatli olunması gerekir.

1. Transfeksiyon için HEK293T hücrelerinin hazırlanması

NOT: Bu adımları steril bir doku kültürü biyolojik güvenlik kabini altında gerçekleştirin.

1. 450 mL DMEM'i% 10 (h / h) fetal buzağı serumu (50 mL) ve 100 U / mL penisilin / streptomisin nihai konsantrasyonu ile birleştirerek HEK293T hücreler için tam Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (cDMEM) hazırlayın.
2. Planlanan transfeksiyondan en az 1 hafta önce HEK293T hücrelerinin buzunu çözün. Hücreleri şişeden ayırmak için tripsin + EDTA kullanarak sağlıklı yetiştirme koşullarını ve geçişi 2-3 günde bir koruyun.
3. Transfeksiyondan bir gün önce, büyüme ortamını hücrelerden dikkatlice aspire edin ve hücreleri steril DPBS ile nazikçe yıkayın. Şişeye 1-5 mL tripsin ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde 2-5 dakika inkübe edin.
4. 5-10 mL cDMEM ekleyin ve hücreleri 5 dakika boyunca 350 x g'da döndürün. Sıvıyı çıkarın ve hücre peletini 10 mL cDMEM'de yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve 20 mL cDMEM'de T175 şişesi başına 10-11 x^{10 6} canlı HEK293T hücresi tohumlayın.
5. HEK293T hücrelerinin %70-80 birleşmeye ulaşmasını sağlamak için gece boyunca %5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
6. Ertesi gün, ışık mikroskobu altında hücrelerin birleştiğini onaylayın.
7. Hücre tek tabakasını bozmadan ortamı 25 mL'lik bir serolojik şerit ile şişeden çıkarın.
8. Yavaşça 10 mL DPBS ekleyin ve hücre tek tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek hücreleri yıkamak için plakayı sallayın.
9. DPBS'yi 25 mL serolojik stripet ile çıkarın.
10. Hücre tek tabakasını rahatsız etmemek için T175 şişesi başına duvara 15 mL yeni cDMEM ekleyin ve plakayı 37 ° C'de inkübatöre geri koyun.

2. Lipozomal olmayan lipid transfeksiyon reaktifi kullanılarak HEK293T hücrelerinin transfeksiyonu

1. 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde, lentiviral bileşenleri hazırlayın: 2 μg lentiviral plazmit, 1.5 μg pΔ8.91 (pCMV-Δ8.91) ve 1 μg pMD2.G (pCMV-MD2.G) Tampon EC (Transfeksiyon reaktif kiti) ile 600 μL'lik bir nihai hacme kadar.
2. 36 μL arttırıcı solüsyon ekleyin. Bileşenleri 1 mL'lik bir pipet kullanarak, sıvının bir kısmını tekrar tekrar emerek ve doğrudan kalan çözeltinin üzerine damla damla geri koyarak karıştırın. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika bekletin.
3. 120 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin ve yukarıdaki gibi yaklaşık 20 kez karıştırın. RT'de 10 dakika inkübe edin.
4. 5.2 mL cDMEM ekleyin ve yukarıdaki gibi 5 mL serolojik şerit ile karıştırın.
5. Tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanarak, transfeksiyon karışımını damla damla doğrudan HEK293T hücrelerinin tek tabakasına (şişe duvarlarından kaçınarak) ekleyin ve karışımı şişenin farklı noktalarına yayın.
6. Şişeyi bir yandan diğer yana hafifçe sallayarak plazmidi dağıtın. Şişe kapağına herhangi bir sıvı girmesinden kaçının.
7. Şişeyi 37 °C'de %5 CO₂ inkübatörde 48 saat inkübe edin. Bir hücre görüntüleme floresan mikroskobu altında izlenen transfeksiyondan sonraki 24 saat içinde bir floresan işaretleyicinin, burada GFP'nin ortaya çıkmasıyla HEK293T hücrelerinin etkili transfeksiyonunu onaylayın.
   NOT: Floresan işaretleyicisi olmayan yapılar için, HEK293T hücreleri, kullanılan işaretleyici genin varlığı veya uygun tekniklerle, örneğin qPCR ile ilgilenilen gen/proteindeki ekspresyon değişikliği açısından test edilmelidir. Alternatif olarak, başarılı transfeksiyon, protokolün sonraki aşamalarında Jurkat hücreleri üzerindeki lentivirüs koleksiyonunun test edilmesi sırasında yukarıdaki tekniklerle dolaylı olarak doğrulanabilir.
   DİKKAT: Transfekte edilmiş HEK293T hücreleri bulaşıcı olarak kabul edilir ve bu hücrelerle işlem yapılırken uygun güvenlik önlemleri alınmalıdır. Tipik olarak bir kategori II biyoloji güvenlik kabini altında çalışmayı, çift eldiven kullanımını ve dezenfeksiyon için uygun dekontaminasyon solüsyonunu, örneğin kurumsal biyogüvenlik yönergelerine göre artan atık ağartıcı konsantrasyonu (2.000 ppm) veya eşdeğer çözeltiyi içerebilecek yerel kurallara uyulmalıdır. Lentivirüs preparatı ile temas eden tüm solüsyonlar ve plastikler kurumsal biyogüvenlik prosedürlerine göre dezenfekte edilmelidir.

3. Lentiviral partiküllerin toplanması

1. Dekontaminasyon solüsyonu, yüksek konsantrasyonlu (2.000 ppm) bir ağartıcı (sodyum hipoklorit) solüsyonu veya kurumsal biyogüvenlik yönergelerine göre eşdeğer bir ajanı bir kovada hazırlayın ve biyoloji güvenlik kabinine yerleştirin.
2. Boş tüp rafları vb. gibi fazla öğeleri çıkararak biyoloji güvenlik kabinini hazırlayın.
3. T175 HEK293T hücreleri şişesi başına 50 mL'lik bir santrifüj tüpünü önceden etiketleyin ve kapağı santrifüj tüpünden çıkarın. Tüpleri sabit bir rafa yerleştirin.
4. Şişeyi inkübatörden alın ve 488 nm lazerli bir floresan mikroskobu kullanarak GFP ekspresyonunu onaylayın (Şekil 1A). Sinyalin yoğunluğu, prosedürün transfeksiyon verimliliğine ve kullanılan yapılara bağlıdır.
5. Ortamı hücrelerden önceden etiketlenmiş 50 mL'lik santrifüj tüpüne toplayın. T175 HEK293T şişesini, ortamın şişenin alt köşesinde toplanacak şekilde transfekte edilmiş hücrelerle eğin. 25 mL'lik bir serolojik şerit kullanarak, hücre tek tabakasını rahatsız etmeden ortamı toplayın. Bu noktada bazı yüzen hücreler görünebilir. Ortamı 50 mL'lik temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve kapağı kapatın.
   1. 25 mL'lik bir serolojik şerit kullanarak, şişeye 25 mL taze, ılık cDMEM ekleyin. Hücre tek tabakasını rahatsız etmemek için orta akışını şişenin duvarlarına yönlendirdiğinizden emin olun. Transfekte edilmiş HEK293T hücreli şişeyi inkübatöre geri koyun (37 °C,% 5 CO₂).
      NOT: Yukarıdaki adımlarda belirtilen prosedürü takiben 24 saat daha sonra ikinci bir lentivirüs koleksiyonu ve daha fazla saflaştırma gerçekleştirilebilir.
6. Lentivirüs toplama işlemi 24 saat veya 48 saat sonra tamamlandığında, hücrelere dekontaminasyon solüsyonu ekleyin ve hücre tek tabakasını kapladığından emin olun. Şişeyi sonraki 24 saat boyunca yatay tutun, ardından uygun kategori II düzenlemelerine göre atın.

4. Lentivirüsün saflaştırılması

1. Adım 3.5'ten itibaren filtre toplama ortamı.
   1. Pistonu 50 mL şırıngadan çıkarın ve şırınga ucuna düşük protein bağlayıcı polieter sülfon veya poliviniliden florür 0.45 μm steril filtre yerleştirin. 25 mL'lik bir serolojik şerit kullanarak, toplanan ortamı adım 3.5.1'den şırıngaya ekleyin ve pistonu yavaşça geri koyun.
   2. Ortamı filtreden 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne geçirmek için tapayı yavaşça itin. Akış önemli ölçüde azalırsa, şırıngayı filtre yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve ortamı filtreden temizlemek için pistonu yeterince dışarı çekin.
   3. Şırınga üzerindeki filtreyi dikkatlice yenisiyle değiştirin ve kullanılmış filtreyi dekontaminasyon solüsyonuna atın. Orta filtrasyona devam edin. Bittiğinde, filtreyi suya batırarak ve şırıngayı dekontaminasyon solüsyonu ile doldurarak filtreyi ve şırıngayı dekontamine edin.
2. Sıcaklığı 4 °C'ye ayarlayarak ultrasantrifüjü önceden soğutun ve sıcaklığın alışmasını sağlamak için kapağı kapatın.
3. Konik ultrasantrifüj tüpünün dibine 3 mL %20 sükroz çözeltisi (ultra saf suda %20 w/v, filtre 0.22 μm filtre kullanılarak sterilize edilmiştir) ekleyin.
4. 25 mL'lik bir serolojik şerit kullanarak, katmanları rahatsız etmemeye dikkat ederek sakaroz tabakasının üzerine filtrelenmiş ortamı kaplayın.
   1. Pipet çocuğundaki en düşük hız ayarını kullanın. Konik ultrasantrifüj tüpünü yaklaşık 45 ° C'ye getirin ve filtrelenmiş lentivirüs içeren ortamı adım 4.1'den tüp duvarına yavaşça ekleyin. Ortam ve sükrozun karışmadığından ve katmanların net bir şekilde ayrıldığından emin olun (Şekil 1B). Orta tabakanın hacmi arttıkça, ultrasantrifüj tüpünü yavaşça dik konuma geri eğin.
5. Ultrasantrifüj tüpündeki sükroz ve ortam dahil toplam hacim 29 mL'den azsa, sıkma sırasında tüpün çökmesini önlemek için taze cDMEM ile doldurun. Birden fazla T175 mL koleksiyonu için, filtrelenmiş ortam preparatlarını karıştırın ve birden fazla ultrasantrifüj tüpü kullanın. Son ultrasantrifüj tüpünü gerektiği gibi ortamla doldurun.
6. Ultrasantrifüj kovalarının temiz olduğundan emin olun; Kovanın dibinde veya kapaklarında orta kalıntı yoktur. Gerekirse ~%70 alkol ile silin. Her kovanın dibine uygun tüp adaptörleri koyun (Şekil 1C) ve ultrasantrifüj tüplerini yavaşça kovalara indirin.
7. Kovaları güvenli bir şekilde kapatın ve döndürme rotorunda ayrılan boşluklara asın.
8. Kovaların aynı hacimlerde sakaroz ve orta ile dengelendiğinden emin olun. Karşılıklı kovalar boş bırakılabilmesine rağmen, bir döner rotor asla kovalar olmadan çalıştırılmamalıdır²⁰ (Şekil 1D).
9. Rotoru dikkatlice ultrasantrifüje yerleştirin ve vakumu açın. Ultrasantrifüj hızlanma ve yavaşlama oranını en düşük ayara getirin ve lentivirüs preparatlarını 85.000 x g'da 90 ° C'de 4 dakika boyunca çalıştırın.
10. Rotorun düzgün bir şekilde yerleştirildiğinden ve dönüşün sona ermeyeceğinden emin olmak için uzaklaşmadan önce ultrasantrifüjün gerekli hıza (yaklaşık 3-5 dakika) ulaşmasını bekleyin.
11. Ultrasantrifüj çalışırken, çalışma alanını kategori II güvenlik gereksinimlerine göre temizleyin ve alanı sonraki adımlar için hazırlayın.
12. Sıkma işlemi bittiğinde, vakumu devre dışı bırakın ve numuneleri rahatsız etmemek için rotoru dikkatlice çıkarın.
13. Ultrasantrifüjde herhangi bir dökülme olup olmadığını araştırın ve kovalarda sızıntı olmadığını doğrulayın. Dökülme durumunda, çift eldiven ile santrifüjü ve kovaların dış yüzeyini antiviral ürünlerle dekontamine edin.
14. Kovaları ultrasantrifüjden çıkarın ve kovaları dikkatlice kategori II biyoloji güvenlik kabinine taşıyın.
    NOT: Lentivirus parçacıkları ultrasantrifüj tüpünün dibinde toplanır. Pelet çıplak gözle görülemez.
15. Sükroz ve besiyerini tek bir yumuşak hareketle doğrudan dekontaminasyon solüsyonu ile birlikte atık kabına dökün.
16. Ultrasantrifüj tüpünü ters çevirerek, çift doku tabakasına aktarın ve 10 dakika kurumaya bırakın. Bu arada, kovaların içini suya batırılmış mendille silin ve baş aşağı havayla kurutun.
17. Ultrasantrifüj tüpünün kenarından kalan sıvıyı dik konuma getirmeden önce doku ile dikkatlice kurulayın. Dokuyu ve altındaki yüzeyi dezenfekte edin.
18. Virüs peletini 1 mL serumsuz ortamda veya çözeltiyi yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek daha fazla deney için gereken çözeltide yeniden süspanse edin. Kategori II biyoloji güvenlik kabininin içindeki RT'de 15 dakika bekletin.
19. Lentivirüs preparatlarını 1.5 mL'lik vidalı tüplere (örn., kriyotüpler) ayırmadan önce 1 mL pipet kullanarak nazikçe karıştırın. Alikotları in vivo çalışma (100 μL'lik çokluk) ve Jurkat T hücrelerinde (1 x 20 μL) lentivirüs titresi için hazırlayın (bkz. adım 5).
20. Donma-çözülme döngülerinden kaçının; lentiviral preparatlar, bulaşıcılık üzerinde olumsuz bir etki olmaksızın -80 ° C'de 6 aya kadar saklanabilir.

5. Jurkat T hücrelerinde lentivirüs üretiminin titrasyonu

1. 500 mL RPMI-1640'ı %10 (h/h) fetal buzağı serumu ve son konsantrasyon 100 U/mL penisilin / streptomisin ile takviye ederek Jurkat T hücreleri için komple Roswell Park Memorial Institute 1640 ortamı (cRPMI-1640) hazırlayın.
2. Jurkat T hücrelerinin sağlıklı bir kültürünü sağlamak için, hücreleri enfeksiyondan önce 1 haftaya kadar kültürde tutun.
3. Lentivirüs titrasyonunun yapıldığı gün, cRPMI-1640 oyuğu başına 200 μL'de 2 x 10⁵ hücre / oyukta 24 oyuklu bir plakada canlı Jurkat T hücrelerini plakalayın.
4. Taze toplanmış lentivirüs kullanın veya 20 μL içeren lentivirüs şişesini buz üzerinde çözdürün ve yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın.
5. cRPMI-1640'ta seri seyreltme kullanarak, Jurkat T hücrelerini 0.25 μL, 0.5 μL, 1 μL, 2.5 μL, 5 μL ve 10 μL lentivirüs stoğu ile enfekte edin. Lentivirüsün eşit dağılımını sağlamak için plakayı hafifçe sallayın. Enfekte olmayan Jurkat T hücreleri negatif kontrol görevi görür.
6. Plakayı 37 °C'de inkübe edin. 4 saat sonra, her bir kuyucuğu cRPMI ile toplam 400 μL hacme kadar doldurun. Plakayı 3 gün boyunca 37 ° C'de inkübatöre geri koyun.
7. Enfeksiyondan 48 saat sonra, bir floresan görüntüleme sistemi altında GFP ekspresyonunu doğrulayın.
8. Enfeksiyondan 3 gün sonra, 24 oyuklu plakanın her bir oyuğu ayrı 1.5 mL toplama tüplerine toplayın ve hücreleri 5 dakika boyunca 4 ° C'de 350 x g'da santrifüjleyin.
9. Süpernatanı atın. Pelet, DPBS'de %2'ye (a/h) hazırlanmış 300 μL %2 paraformaldehit (PFA) içinde yeniden süspanse edin ve karanlıkta buz üzerinde 15 dakika bekletin.
10. Hücreleri 5 dakika boyunca 4 ° C'de 350 x g'da santrifüjleyin ve peleti floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponunda (steril DPBS +% 4 FCS + 1 mM steril EDTA) yeniden süspanse edin.
11. Akış sitometrisi kullanarak enfekte olmuş lentivirüs ve kontrol hücrelerinin GFP ekspresyon frekansını ve ortalama floresan yoğunluğunu analiz edin (Şekil 2).

6. Dokuda yerleşik peritoneal makrofajların in vivo lentivirüs enfeksiyonu

1. Kategori II biyolojik güvenlik kabininde, gerekli miktarda lentivirüs içeren toplam hacim 200 μL serumsuz ortam ortamı ile insülin iğneleri yükleyin (tek kullanımlık iğneler, hayvan refahı için ve iğnede sıvı kaybını önlemek için 30 G kullanın).
2. Tek elle kepçe tekniğini kullanarak iğne kılıfını iğnenin üzerine geri yerleştirin. İğneyi buz üzerinde tutun ve 30 dakika içinde enjekte edin.
3. Hayvan tesisinde, enjeksiyonlardan önce bir kategori II biyolojik güvenlik kabini kurun (Şekil 1E).
   1. Temiz bir doku tabakası koyun. Lentivirüs içeren insülin iğnesinin üzerindeki kılıfı gevşetin.
   2. Küçük doku parçaları ve klorheksidin glukonat bazlı dezenfektan, dekontaminasyon solüsyonu (2.000 ppm çamaşır suyu solüsyonu) içeren 50 mL'lik bir tüp ve keskin bir güvenli kap içeren bir Petri kabı hazırlayın.
4. Boynun ensesindeki cildi kavrayarak fareyi dizginleyin²¹. Düzgün bir şekilde kısıtlanmış fare hareketsizdir ve bu güvenlik için gereklidir.
5. Karın yukarı bakacak şekilde, hayvanın başını hafifçe aşağı doğru çevirin. Lentivirüsü intraperitoneal olarak karın boşluğunun sağ alt kadranına enjekte edin. Bu, herhangi bir periton boşluğu organına enjeksiyondan kaçınmak içindir.
6. Fareyi serbest bırakmadan önce, şırıngayı dekontaminasyon solüsyonu ile doldurun ve keskin güvenli bir kutuya atın.
7. Farenin karnındaki enjeksiyon bölgesini dezenfektana batırılmış doku ile silin ve hayvanı kafese geri koyun.
8. Lentivirüs enjekte edilen fareyi, enjeksiyondan sonra en az 72 saat boyunca kategori II scantainer veya ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde (IVC) (yüksek verimli hava filtrasyonlu izole kafesler) barındırın. Kafesin ön tarafına uygun bir bilgi kartı yerleştirin.
9. Yerel güvenlik onaylarına bağlı olarak, enfeksiyondan 72 saat sonra fareyi yeni kategori I tutma kafesine taşıyın. Fareleri enjeksiyondan itibaren toplam 3 gün boyunca günlük olarak izleyin.

7. Lentivirüs ile enfekte olmuş fareden periton hücrelerinin toplanması

DİKKAT: Lentivirüs enjeksiyonundan sonraki 72 saat içindeki koleksiyonlar için kurumsal kategori II biyolojik güvenlik kurallarına uyun. Enfekte hayvanların lentivirüs enjeksiyonundan sonraki ilk 72 saat içinde tutulduğu yatak takımları ve tutma kafesi, kurumsal kategori II biyolojik güvenlik kurallarına göre dekontamine edilmelidir.

1. Kurumsal düzenlemelere uygun olarak farelere ötenazi yapın, örneğin, artan CO₂ konsantrasyonunun solunması ve ardından servikal çıkık ile ölümün doğrulanması.
2. Farenin karnını %70 izopropanol ile temizleyin ve periton boşluğu zarını ortaya çıkarmak için cildi dikkatlice kesin.
3. 10 mL'lik bir şırınga ve 23 G iğne kullanarak periton boşluğunu 6 mL buz gibi soğuk FACS tamponu ile lavajlayın. Herhangi bir organı delmekten kaçının.
4. Hücreleri FACS tamponuna çıkarmak için peritona hafifçe masaj yapın.
5. Aynı şırınga ve iğneyi kullanarak periton sıvısını toplayın.
6. İğneyi çıkarın ve hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
7. Periton lavajlarını buz üzerinde tutun.
8. Gerekli diğer organları toplayın ve çalışmaya uygun şekilde saklayın.
9. Hayvan leşlerini yerel hayvan ve güvenlik yönergelerine göre atın.

8. Peritoneal hücre boyama ve analizi

1. Periton lavajını 5 dakika boyunca 4 ° C'de 350 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı dekontaminasyon solüsyonunda atın ve hücreleri 1 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
2. Toplanan hücreleri ve plakayı sayın: V tabanlı 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 4 x^{10 5} hücre.
3. Üretici talimatlarına göre sabitlenebilir bir reaktif (örneğin, burada kullanılan Sabitlenebilir Yakın IR Ölü Hücre Leke Kiti) kullanarak canlılık boyama yapın.
4. Hücreler son 72 saat içinde enfekte olmuşsa, hücreleri 15 dakika boyunca% 2 PFA'da buz üzerinde sabitleyin. Eşit hacimde soğuk DPBS ekleyin ve 350 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
5. Bloke edici tamponu hazırlayın: 4 μg / mL 2.4G2 antikoru% 10 (h / h) sıçan serumunda yüzey boyama için FACS tamponunda veya hücre içi boyama için geçirgenlik tamponunda karıştırın.
6. Her bir kuyucuk içeren hücre peletini 50 μL bloke edici tampon içinde yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
7. Her numune için 50 μL FACS tamponunda (yüzey boyama için) veya geçirgenlik tamponunda (hücre içi boyama için) antikor karışımı hazırlayın. Her numune için son boyama hacmi, 50 μL bloke edici tampon dahil olmak üzere 100 μL olacaktır. Antikor konsantrasyonlarını buna göre hesaplayın (Tablo 1).
8. Numunelere 50 μL antikor karışımı ve numuneleri kontrol etmek için 50 μL izotip kontrolleri ve kontrol tamponu ekleyin. Numuneleri karanlıkta buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Boyanmamış hücreleri ve izotip denetimlerini gerektiği gibi dahil edin.
9. Her kuyuyu 100-200 μL buz gibi soğuk DPBS ile yıkayın ve plakayı 5 dakika boyunca 4 ° C'de 350 x g'da santrifüjleyin. Bağlanmamış antikorları yıkamak için bu adımı tekrarlayın. Numuneleri bir akış sitometresinde analiz edin.

9. Organlardan hücrelerin çıkarılması

1. Organ başına 1 mL sindirim karışımı hazırlayın: Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS), 2 mg / mL kollajenaz tip IV ve 0.03 mg / mL DNaz I'i (akciğer sindirimi için 1.5 mg / mL hyaluronidaz içerir) karıştırın.
2. Toplanan organı 1 mL sindirim karışımına aktarın ve makasla kıyın.
3. Hücreleri 40 μm'lik bir süzgeçten geçirin ve 350 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
4. Hücreleri akciğer, dalak veya karaciğerden izole ediyorsanız, ACK lizis tamponu (150 mM_NH4Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM_Na2EDTA pH = 7.4) kullanarak kırmızı kan hücrelerini parçalayın. Hücreleri 40 μm'lik bir süzgeçten geçirin ve 350 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
5. Hücreleri bölüm 8'de açıklandığı gibi boyayın ve analiz edin.

Sonuçlar

Tam ve doğru bir şekilde takip edildiğinde, bu protokol, bu çalışmada belirlenen optimal hacimde on iki in vivo enjeksiyon için yeterli olan, tek bir preparat başına toplam 1.5 mL yüksek kaliteli lentivirüs stoğu verir¹⁸. Transfeksiyonun başarısı protokolün erken aşamalarında değerlendirilebilir. Sağlıklı ve birleşen HEK293T hücreleri, plazmitlerde mevcutsa, plazmit transfeksiyonundan 48 saat sonra kolayca tespit edilebilir bir işaretleyici sinyal (örneğin, bu çalışmada kullanılan GFP) göstermelidir (Şekil 1A). Sinyalin düşük yoğunluğu, aşırı hücre dekolmanı ve protokolün erken aşamalarında düşük birleşme, hücre ölümünü gösterebilir ve lentivirüs preparatının düşük verimine neden olabilir. İsteğe bağlı toplama II'den (adım 3.5.1.) önceki hücre ayrılmasının bir kısmı görülebilir ve beklenir.

Bu protokolde lentivirüs partiküllerinin üretilmesi için üç plazmit kullanılır: yapısal HIV-1 proteinini (Gag), aksesuar proteinler Tat ve Rev'i kodlayan pCMV-ΔR8.91 paketleme plazmidi ve ters transkriptaz polimeraz (Pol)²²; CMV promotörü¹³ altında VSV-G zarfını kodlayan pMD2.G; ve pHR'SIN-cPPT-SEW plazmidi (kodlayan gelişmiş GFP markörü)¹⁹ shRNA veya mikroRNA ekspresyonu için uygun şekilde modifiye edilmiştir.

Lentivirus preparatları, yüksek enfektiviteleri nedeniyle Jurkat T hücre hattında titre edilir²³. Başarılı lentivirüs hazırlığı, 5 μL kadar küçük bir dozla% 95'in üzerinde bir enfeksiyon oranı elde edecektir (Şekil 2A). Enfekte hücrelerin ortalama floresan yoğunluğu daha yüksek dozlarla artmaya devam eder (Şekil 2B, C). Gerekirse, viral titreler, entegre viral bileşenlerin gerçek zamanlı PCR'si kullanılarak ölçülebilir, ör., yüzde GFP eksprese eden hücreler ile doğrusal olarak ve GFP MFI ile logaritmik olarak ilişkili olan SFFV promotörü (Şekil 2D). Yapıya bağlı olarak, özellikle büyük bir ek^24'e sahip olanlar, bazı lentivirüs preparatları, bu çalışmada kullanılan Cre-GFP yapısı için gösterildiği gibi, Jurkat T hücrelerinde azalmış enfektivite gösterebilir (Şekil 2E, F). Böyle bir durumda, lentivirüs partiküllerinin çoklu preparatları birleştirilebilir ve 1 mL'de yeniden süspanse edilebilir. Deneyden önce bu preparatlara karşı bağışıklık tepkilerini in vivo olarak doğrulamanızı öneririz. Doğal olarak, burada kullanılan VSV-G'ye alternatif giriş reseptörlerine sahip lentivirüs preparatları, hücreler üzerindeki reseptör ekspresyonuna bağlı olarak Jurkat T hücre hattında farklı enfeksiyon etkinliği gösterebilir. Titrasyon için kullanılan hücre hatları, lentivirüs partikülleri tarafından hücrelere girmek için kullanılan reseptörü eksprese edecek ve tercihen kısıtlama faktörlerinin²⁵ ekspresyonundan yoksun veya çok düşük ekspresyona sahip olacak şekilde seçilmelidir.

Lentiviral partiküllerin başarılı üretimi, pMφ enfeksiyonu (CD11b + F4 ^/ 80 ⁺ ve Tim4 ⁺ popülasyonu olarak tanımlanır) ¹⁸ ile daha da kanıtlanmıştır (Şekil 3A). 100 μL lentivirüs preparatının intraperitoneal enjeksiyonunun (toplam 200 μL serumsuz ortam hacminde) bu hücrelerde GFP sinyalinin en yüksek yüzdesini ve yoğunluğunu verdiğini belirledik (Şekil 3B,C). Daha yüksek doz enjeksiyonlarının (150 μL ve 200 μL lentivirüs preparatı) pMφ'deki GFP ekspresyonu üzerinde yararlı bir etkisi olmamıştır. 100 μL lentivirüs ile intraperitoneal (ip) enjeksiyondan 4 saat, 3 gün, 7 gün ve 14 gün sonra yapılan zaman seyri deneyleri, 3. ve 7. günlerde GFP eksprese eden yerleşik pMφ'nin önemli bir yüzdesini ortaya çıkardı, ardından enfekte popülasyonun 14. günde kaybolması izledi (Şekil 3D, E). İlginç bir şekilde, GFP eksprese eden pMφ, kısmen GFP markörünün immün olarak tanınmasına bağlı olarak, enfeksiyondan sonraki 14. günde çoğunlukla kaybolur. Gerçekten de, T-Reg seçici, Foxp3-DTR-eGFP farelerinde GFP markörü ile lentivirüs deneyleri, enfekte yerleşik pMφ'nin en az 21. güne kadar reddedilmesini önler (Şekil 3F). Jurkat hücrelerinde etkinliği azalmış lentivirüs preparatları için, in vivo olarak beklenen enfeksiyon oranını elde etmek için daha yüksek bir miktar gerekecektir. Bununla birlikte, Cre-GFP lentivirüs preparatı ile gösterildiği gibi, yapı tasarımına bağlı olarak, i.p enjeksiyonundan 7 gün sonra 300 μL'lik bir doz bile kötü bir sonuç verebilir (Şekil 3G). Daha önce, lentiviral shRNA aracılı Map3k8 ve Gata6 yıkımı ve Gata6 aşırı ekspresyonu¹⁹ dahil olmak üzere, fare pMφ'de in vivo genlerin aşırı ekspresyonu ve yıkılması için bu protokolün başarılı bir şekilde kullanıldığını göstermiştik. Burada, bu protokolün, murin mikroRNA 146b'nin (mmu-miR-146b) aşırı ekspresyonu ve yerleşik pMφ'de lentiviral türevli shRNA kullanılarak hücreler arası adezyon molekülü 1'in (ICAM1, CD54) yıkılması için de başarıyla kullanılabileceğini gösteriyoruz (Şekil 3H,I).

Makrofajlar gibi birincil hücrelerin enfeksiyonu, muhtemelen bu hücrelerde kısıtlama faktörlerinin varlığına bağlı olarak daha yüksek lentivirüs girişi gerektirir. Kısıtlama faktörleri, ters transkripsiyon veya entegrasyon gibi virüslerin yaşam döngüsü adımlarına müdahale eden ve yapılardan gen ekspresyonunun inhibisyonuna yol açan hücrelerin doğal koruyucu mekanizmalarıdır.

Ayrıca, protokolün in vivo validasyonu, i.p lentivirüs iletiminin peritoneal immün hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösterdi (Şekil 4A) ve yerleşik pMφ alt popülasyonlarının (CD73 ve Tim4 belirteçlerinin ekspresyonu ile tanımlanan) belirgin enfektivitesini gösterdi (Şekil 4B, C). Daha da önemlisi, üretken lentivirüs enfeksiyonu, meydan okumadan 7 gün sonra mezenterik lenf nodu (mLN), akciğer, karaciğer veya dalak Mφ'de önemli GFP ekspresyonunun olmaması ile kanıtlandığı gibi, enjeksiyon bölgesinde yerleşik Mφ ile sınırlıydı (Şekil 4D). Birçok durumda, Mφ'nin genetik hedeflemesinin enflamatuar koşullar altında gerçekleştirilmesi gerektiği göz önüne alındığında, bu protokolün etkinliğini, 0.1 mL% 4 tiyoglikolat ile intraperitoneal olarak zorlanan farelerde araştırdık. Tiyoglikolat enjeksiyonu, 5 farklı popülasyona bölünebilen inflamatuar monosit türevli Mφ ve monositik hücrelerin akışını tetikler (Şekil 4E). Akış sitometrisi analizi, insan hücrelerindeki önceki bulgularla uyumlu olarak, monositik benzeri hücrelerin (Ly6C^hi popülasyonları 1 ve 2) lentivirüs enfeksiyonuna dirençli bir fenotipini ortaya çıkardı²⁶. Buna karşılık, yerleşik Mφ ve monositler (grup 3-5) enfeksiyona en duyarlı olmaya devam etti (Şekil 4F).

Ayrıntılı akış sitometrik analizi, GFP ekspresyonunu ağırlıklı olarak yerleşik peritoneal Mφ ve majör histouyumluluk kompleksi (MHC) sınıf II⁺ yerleşik pMφ'de (MHCII⁺ F4 / 80 ⁺ Tim4 ⁺) tespit etti (enjeksiyondan sonraki 3. günde% 60'a kadar) (Şekil 5A). Kemik iliği kaynaklı peritoneal Mφs/DC'ler (MHCII⁺, CD11b⁺, CD11c⁺), B hücreleri (CD19⁺), T hücreleri (CD3⁺), mast hücreleri (CD11b^-, FcεR1⁺), eozinofiller (Siglec-F⁺), NK hücreleri (CD19^-, NK1.1⁺) ve nötrofiller (^Ly6G+) dahil olmak üzere diğer peritoneal hücre popülasyonlarında çok az GFP sinyali tespit edildi veya hiç tespit edilmedi (Şekil 5A,B). Tüm popülasyonlarda GFP ekspresyonu uzun ömürlülüğü (Şekil 5C), yerleşik peritoneal Mφ'nin bunu takip etti (Şekil 1D). 100 μL (toplam 200 μL serumsuz ortam hacminde) lentivirüs enjeksiyonundan 4 saat sonra nötrofil frekansında geçici bir artış kaydedildi (Şekil 5D), bu da zorlu hayvanlarda mevcut olan erken hafif inflamasyonu gösterir. Son olarak, yerleşik pMφ, enfeksiyondan sonraki 7. ve 14. günler arasında sıklıkta büyük bir düşüş yaşadı (Şekil 5E), bu da enjeksiyondan sonraki 3. ve 7. günler arasındaki en iyi deneysel pencereyi düşündürdü.

Şekil 1: HEK293T hücrelerinde lentivirüs üretimi. (A) Başarılı transfeksiyondan 48 saat sonra HEK293T hücrelerinin temsili immünofloresan resimleri (floresan mikroskop [488 nm uyarma zirvesi, 510 nm emisyon zirvesi], 20x büyütme, ölçek çubuğu = 400 μm). (B) % 20 sükroz tabakası (alt, şeffaf) ve transfekte edilmiş HEK293T hücrelerinden toplanan bir ortam tabakası (üst, kırmızı) içeren ultrasantrifüj konik tüpün fotoğrafı. (C) Adaptör de dahil olmak üzere konik ultrasantrifüjün kovaya doğru yerleştirildiğinin fotoğrafı. (D) Ultrasantrifüj rotorunun doğru ve yanlış balansını gösteren fotoğraflar. (E) Sağ elini kullanan bir kişi için in vivo enjeksiyonlar için Cat II kabininin ve malzemelerinin optimum kurulumunun fotoğrafı. Bu şekil Ipseiz N ve ^ark.18'in izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Jurkat T hücrelerinde Lentivirus titrasyonu. (A) ^GFP + hücrelerinin yüzdesini (GFP ⁺) gösteren bir GFP plazmidi içeren artan dozlarda lentivirus ile enfeksiyondan 72 saat sonra Jurkat T hücrelerinin temsili akış sitometrik analizi, (B) GFP ⁺ hücrelerinin ortalama floresan yoğunluğu (MFI) ve (C) GFP ekspresyonunun temsili bir histogramı. (D) MFI'yi (sol Y) ve GFP eksprese eden bir lentivirüs (sağ Y) ile enfekte olmuş hücrelerin yüzdesini ve DNA'nın pg'si başına tespit edilen virüsün kopya sayısını (x ekseni) gösteren dağılım grafiği. (E) Suboptimal Cre-GFP lentivirus (Cre-GFP LV) hazırlama ve kontrol GFP lentivirus (GFP LV) ile Jurkat T hücresi enfeksiyonunun temsili bir histogramı ve (F) Cre-GFP lentivirus ile enfekte olmuş Jurkat T hücrelerinin yüzdesini gösteren özet veriler (GFP ⁺). Bu şekil Ipseiz N ve ^ark.18'in izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Yerleşik pMФ'nin enfeksiyon etkinliği. (A) Yerleşik pMφ (CD11b⁺, Tim4+, F4^/80⁺) ve Tim4^-, F4/80⁺ hücrelerinin geçit stratejisi. Hücreler singletler üzerine kapatıldı, ardından CD11b⁺ izledi. (B) Temsili nokta grafikleri ve (C) farklı miktarlarda GFP lentivirüs preparatı ile in vivo enfeksiyondan 3 gün sonra izole edilen GFP ⁺ hücrelerinin enfeksiyon sıklığının (% GFP + hücreleri) ve yoğunluğunun (MFI) bir özeti. (D) Temsili nokta grafiği ve (E) toplam 200 μL serumsuz ortam ortamında 100 μL lentivirüs ile in vivo enfeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında izole edilen GFP + hücrelerinin enfeksiyon sıklığının (% GFP + hücreleri) ve yoğunluğunun (MFI) bir özeti. (F) Foxp3-DTR-eGFP farelerinde GFP eksprese eden pMφ ve inflamatuar makrofajların ve dendritik hücrelerin sayısını gösteren GFP eksprese eden lentivirüsün intra-peritoneal verilmesinden sonraki 7, 14 ve 21. günlerdeki hücre sayılarının bir özeti (InfMØ'lar / DC'ler [F480^düşük]). (n= grup başına 1-2). (G) I.p enjeksiyonundan 7 gün sonra 300 μL Cre-GFP lentivirus ile Gata6-KO ^{mye 19} resident pMφ'nin suboptimal in vivo enfeksiyonunun temsili nokta grafiği. (H) Murin mikroRNA-146b'yi (miR-146b) kodlayan 100 μL lentivirüs veya kontrol (C) ile in vivo olarak zorlanan yerleşik peritoneal Mφ'nin mmu-miR-146b-5p ekspresyonunun RT-qPCR miktar tayini. Yerleşik pMφ (beyaz daireler) ve Tim4^-, F4/80⁺ hücreleri (gri daireler). (I) Dişi 129S6 farelerinde, hedefleme shRNA'sının i.p enjeksiyonundan 7 gün sonra, pMφ üzerinde ICAM1'in başarılı bir şekilde aşağı regülasyonunun temsili bir nokta grafiği. Kontrol shRNA'sı gösterilir. Kaplama, izotip kontrolünü gösterir. Ortalama ± SEM, n≥2 fare olarak ifade edilen veriler. Bu şekil Ipseiz N ve ^ark.18'in izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Yerleşik pMφ alt popülasyonlarının enfeksiyon etkinliği. (A) 100 μL serumsuz ortam (-) veya GFP lentivirüs (+) ip enjeksiyonundan 7 gün sonra canlı olan toplam tek hücrelerin ve yerleşik Mφ yüzdesi. (B) İn vivo bulunan dört ana pMφ popülasyonunu gösteren geçit stratejisi: CD73 ⁺ Tim4 ⁺, CD73-Tim4^-, CD73 ⁺ Tim4^-, CD73-Tim4 ⁺ ve (C) karşılık gelen enfeksiyon sıklığı (% GFP + hücreleri) ve yoğunluğu (GFP + hücrelerinin MFI'si) bu popülasyonların. (D) 100 μL lentivirüs i.p enjeksiyonundan 7 gün sonra birden fazla organdaki GFP + hücrelerinin yüzdesi. Kısaltmalar: mLN, mezenterik lenf nodu. (E) Farelere 5 gün boyunca 0.1 mL% 4 tiyoglikolat ile i.p enjekte edildi, ardından lentivirüs ile i.p enjeksiyonu yapıldı. Lentivirus i.p enjeksiyonundan 3 gün sonra pMφ ve monositlerin geçit stratejisi. (F) GFP + monositlerinin (Ly6C ⁺) ve Mφ'nin (Ly6C^-) enfeksiyon sıklığı, MFI ve hücre sayısı analizi. Ortalama ± SEM, n≥3 fare olarak ifade edilen veriler. Bu şekil Ipseiz N ve ^ark.18'in izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Lentivirüs enjeksiyonunun periton iltihabı üzerindeki etkisi. Farelere enjekte edildi in vivo ip ile GFP lentivirüs eksprese eder. (A) Çeşitli miktarlarda lentivirüs enjeksiyonlarını (50 μL, 100 μL, 150 μL veya 200 μL) takiben periton boşluğundaki hücre popülasyonlarının enfeksiyon sıklığı. (B) I.p enjeksiyonundan 7 gün sonra üretken olarak enfekte olmuş hücre popülasyonlarında GFP ekspresyonunun yoğunluğu. (C) I.p enjeksiyonundan sonra çeşitli zaman noktalarında periton boşluğundaki hücre popülasyonlarının enfeksiyon sıklığı. (D) ve (E) IP enjeksiyonundan sonra çeşitli zaman noktalarındaki hücrelerin yüzdesi. Tüm lentivirüs enjeksiyonları, serumsuz ortam ortamı ile tamamlanan aynı toplam 200 μL hacimle gerçekleştirildi. Aksi belirtilmedikçe 100 μL lentivirüs dozu kullanıldı. Kontrol fareleri ("C") 200 μL saf serumsuz ortam ortamı aldı. Ortalama ± SEM, n≥3 fare olarak ifade edilen veriler. Bu şekil Ipseiz N ve ^ark.18'in izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Antikor hedefi	Florofor	Klon	Kullanılan seyreltme	nihai konsantrasyon [μg/mL]
HIV-1 Çekirdek antijeni	RD1 Serisi	FH190-1-1 Serisi	1/100	1
I-A/I-E	PerCpCy5.5	M5/114.15.2	1/400	0.5
Ly6G (İngilizce)	PerCpCy5.5	1A8 Serisi	1/400	0.5
CD3e (İngilizce)	PerCpCy5.5	17A2 Serisi	1/200	1
CD3e (İngilizce)	PE/CY7	500A2 Serisi	1/400	0.5
CD11c (İngilizce)	PE/CY7	N418 Serisi	1/800	0.25
CD11c (İngilizce)	BV605 Serisi	N418 Serisi	1/400	0.5
CD226 Serisi	AF647 Serisi	10 E 5	1/400	1.25
Tim4	AF647 Serisi	RTM4-54 Serisi	1/600	0.83
CD4 (İngilizce)	APC	GK1.5 Serisi	1/400	0.5
CD11b	AF700 Serisi	M1/70 Serisi	1/700	0.71
CD11b	PerCpCy5.5	M1/70 Serisi	1/400	0.5
F4/80 Serisi	Pasifik Mavisi	BM8 Serisi	1/700	0.71
F4/80 Serisi	BV605 Serisi	BM8 Serisi	1/400	0.25
F4/80 Serisi	BV711 Serisi	BM8 Serisi	1/400	0.5
CD73 Serisi	eFluor450 Serisi	TY/11.8	1/400	2.5
CD19 Serisi	V450 Serisi	1D3	1/400	0.5
CD19 Serisi	APC	1D3	1/400	0.5
CD8a (İngilizce)	eFluor450 Serisi	53-6.7	1/400	0.5
SiglecF	BV421 Serisi	E50-2440 Serisi	1/400	0.5
NK1.1	APC/CY7 Serisi	PK136 Serisi	1/400	0.5
FceR1	eFluor450 Serisi	MAR-1	1/400	0.5
ICAM1 (İngilizce)	PE	1A29 Serisi	1/100	2
Sıçan IgG1, κ izotip kontrolü	PE		1/100	2

Tablo 1: Antikorların listesi

Tartışma

Dokuda yerleşik makrofajlar, fizyolojik çevreleri ^6,7,8,9 tarafından belirlenen bir dizi homeostatik ve inflamatuar dokuya özgü işlevi ^1,2 yerine getirir. Bu protokolde, peritoneal yerleşik makrofajların lentivirüs partikülleri kullanılarak in vivo olarak manipülasyonu için etkili bir yöntem¹⁸, biyolojik mikroçevrelerindeki makrofaj fonksiyonunu araştırmak için tanıtıldı.

Sağlıklı HEK293T hücrelerinin kullanılması protokolün başarısı için şarttır. Hücre iyileşmesini ve iyi sayıları sağlamak için bu protokolün başlamasından en az bir hafta önce hücrelerin buzunu çözmek en iyi uygulamadır. Hücreler, planlanan transfeksiyondan bir gün önce uygun bir hacimde tohumlanmalı ve transfeksiyon gününde yaklaşık% 80 birleşmeye ulaşmalıdır. Az veya aşırı birleşen hücre preparatları, lentivirüs veriminin azalmasına neden olacaktır. En iyi sonuçlar için HEK293T hücrelerinin transfeksiyon reaktifi ile üreticinin talimatlarına göre transfekte edilmesini öneririz. Transfeksiyonun temel adımları, plazmitlerin ve reaktiflerin uygun şekilde karıştırılmasını ve karışımın doğrudan HEK293T hücre tek tabakasına damla damla eklenmesini içerir. Bu protokolde HEK293T hücrelerinin^27,28 kalsiyum fosfat transfeksiyonu kullanılabilir. Bununla birlikte, kullanıcı bu yöntemin etkinliğinin değişebileceğinin ve transfeksiyon verimliliğinin azalmasına neden olabileceğinin farkında olmalıdır.

Güvenlik önlemleri, HEK293T hücresi transfeksiyonunun yapıldığı günden itibaren protokolde dikkate alınmalıdır. Bunlar, kategori II güvenlik kabininde çalışmayı, kontamine materyali tutarken çift eldiven giymeyi ve kontamine materyalin en az 4 saat boyunca uygun şekilde ağartılmasını (dekontaminasyon solüsyonu, örneğin 2.000 ppm ağartma solüsyonu ile) içerir. Kullanıcılar, kategori II patojenler ve atıklarla çalışma ile ilgili kurumsal düzenlemelerine başvurmalıdır.

Bu protokolde, lentivirüs preparatı ilk olarak HEK293T hücre kalıntılarını gidermek için 0.45 μm'lik bir filtre kullanılarak saflaştırılır. Daha küçük filtrelerin (0.22 μm) ve selüloz ester membranlarının kullanılması, lentivirüs partiküllerinin kaybına neden olacağından kaçınılmalıdır. Düşük protein bağlayıcı polieter sülfon veya poliviniliden florür filtrelerinin²⁹ kullanılması tavsiye edilir. İkinci saflaştırma adımı, kalan safsızlıkları gidermek için bir ultrasantrifüjde tek %20'lik sükroz tabakası üzerinde gerçekleştirilir, bu da lentivirüs preparatının in vivo uygulanması için özellikle önemlidir. Bir ultrasantrifüjün bulunmadığı kurumlarda, diğerleri³⁰ standart bir laboratuvar santrifüjü kullanarak sakaroz bazlı lentivirüs saflaştırmasını tanımlamıştır. Bu, bu protokolde bir alternatif olarak uygulanabilir. Lentivirus hazırlığı, işaretleyici sinyalin ekspresyonu üzerine Jurkat T hücrelerinde titre edilir (örneğin, bu protokolde kullanılan GFP). Belirteçleri olmayan yapılar için, fiziksel lentivirüs parçacıkları, HIV-1 p24gag proteininin ELISA kit³¹ ile niceliklendirilmesi, HIV-1 çekirdek antijeni^18'in akış sitometrisi analizi veya hedeflenen gendeki değişikliklerin ölçülmesi (tercihen tek tek hücrelerdeki değişikliklerin ölçülmesine izin veren yöntemler kullanılarak, örneğin akış sitometrisi veya mikroskopi) ile değerlendirilebilir. Kontrol ve lentivirüsün titrasyonu Jurkat T hücrelerinde önemli ölçüde farklılık gösteriyorsa, in vivo çalışmalar için kullanılan hacimler, lentivirüs preparatları arasındaki en karşılaştırılabilir enfeksiyona ulaşmak için ayarlanabilir.

Protokolün en önemli sınırlaması, i.p lentivirüs enjeksiyonundan sonraki 14 gün içinde GFP ⁺ resident peritoneal Mφ'nin gözlenen kaybolmasıdır. Uzun süreli çalışmalar için, belirli bir hücre tipinde veya dokularda stabil genetik değişikliğe sahip fare hatları düşünülmelidir³². Örneğin, peritoneal makrofajlar Foxp3'ü (bir T-Reg proteini) eksprese etmediğinden, Foxp3-DTR-eGFP farelerini³³ kullandık ve GFP ekspresyonunun enfeksiyondan 21 gün sonra peritoneal Mφ'de korunduğunu doğruladık (Şekil 3F). Bununla birlikte, lentivirüslerin başka yabancı bileşenler içerdiğine ve Foxp3-DTR-GFP farelerinde enfekte olmuş hücrelerin kalıcılığındaki bu uzantının kalıcı olmayabileceğine dikkat etmek önemlidir. Bu yöntemin ek bir zayıflığı, enjeksiyondan 4 saat sonra nötrofil akışının tanık olduğu gibi, lentivirüs enjeksiyonunu takiben periton boşluğunda gözlenebilen düşük bir inflamasyon seviyesidir (Şekil 5D), bu da tekrarlanan enfeksiyonların GFP eksprese eden yerleşik peritoneal Mφ'nin inflamasyonla ilişkili kaybını hızlandıracağı anlamına gelebilir. Periton boşluğunda tip I interferonlar (IFN'ler) tespit etmemiş olsak da, VSV-G psödotipli lentivirüs partiküllerinin, saptanabilir IFN'lerin yokluğunda insan Mφ'sinde IFN ile uyarılan genlerin bir kısmını indüklediği daha önce gösterilmiştir³⁴. Antiviral bağışıklık tepkilerini araştıran deneyler için bu protokolü kullanırken bu dikkate alınmalıdır. Lentivirüs preparatının i.p enjeksiyonundan sonra akut ve sürekli inflamasyonun ortaya çıkması, preparatın kontaminasyonunu gösterebilir.

Sorun giderme alanları şunları içerir: 1) düşük lentivirüs titresi için, HEK293T hücrelerinin sağlığını ve etkili transfeksiyonu sağlayın (örneğin, HEK293T hücrelerde varsa belirteç ifadesi). Enfeksiyon oranı düşük kalırsa, yapının boyutunu göz önünde bulundurun. Daha büyük eklere veya daha karmaşık ikincil yapılara sahip yapılar, nihai lentivirüs titresini ve enfektivitesini etkileyebilir²⁴. Bu nedenle, her yapı bağımsız olarak ve ilgili kontrol vektörüne paralel olarak test edilmelidir; 2) Yüksek miktarda lentivirüs gerekiyorsa, HEK293T hücrelerden oluşan birden fazla T175 şişesi hazırlanması ve üretimin buna göre ölçeklendirilmesi önerilir. Lentivirüs preparatlarının çeşitlenmesini önlemek için, alıntılama ve depolamadan önce son koleksiyonları birleştirmek en iyi uygulamadır. Bu tür daha büyük üretim için, bileşenlerin etkili bir şekilde karıştırılmasını sağlamak için plazmit karışımı (bölüm 2) 50 mL'lik tüplerde hazırlanmalıdır.

Geniş tropizmine rağmen, VSV-G psödotipli lentiviral partiküller, daha önce alveolar³⁵ için gösterildiği gibi doku makrofajlarını ve burada ilgili yollarla uygulandığında pMФ için^18'i hedef alır. Lentivirüs partikülleri üzerindeki zarfta yapılan değişiklikler, bazı durumlarda, makrofajların transdüksiyonunun azalmasına neden olabilir in vivo³⁶ ve bu protokol için gereksizdir. Makrofajlarda in vivo gen manipülasyonu için diğer viral yaklaşımlarla karşılaştırıldığında (^37'de gözden geçirilmiştir), lentiviral vektörlerin kullanımı, transgenin doku makrofajlarında³⁵ stabil entegrasyonunu, verimli transgen ekspresyonunu ve en büyük vektör boyutu sınırını (yaklaşık 8 Kb) sunar.

Peritoneal Mφ, karın kanserleri, pankreatit ve peritonit dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların önlenmesinde, başlamasında, ilerlemesinde ve çözülmesinde önemli bir rol oynar³⁸. Bu protokol, murin pMφ'de gen modifikasyonu için etkili bir aracı tanımlar ve bu patolojilerin arkasındaki biyolojik süreçlerin fizyolojik olarak ilgili bir mikro çevre içinde araştırılmasına izin verir. Lentiviral vektörlerin kendileri, immün yetmezlik virüsünden kaynaklanan köken ve stabil bir genom entegrasyonu nedeniyle^klinik müdahaleler için bir ilgi aracı haline gelirken39, güvenlik endişeleri terapötik uygulamalarını engellemektedir. Lentiviral gen modülasyonuna makrofaj yanıtlarının daha iyi anlaşılması, bu oldukça etkili aracın klinik bir ortamda uygulanmasını ilerletebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 0.05 Tripsin-EDTA (1x) (Tripsin 500 mg / L veya 0.02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0.22 & mu; m steril millex GP filtresi	Merck	SLGS033SS
0.45 μ m steril millex GP filtre	Merck	SLHP033RS
0,5 mL U-100 iğneli insülin şırıngası, 0,33 mm x 12,7 mm (29 G)	BD	324892
1 Litre Kesici-Delici Alet Kabı	N/A	N/A
2.4G2 antikoru (TruStain FcX anti-fare CD16/32)	Biolegend	101320
40 μ m süzgeç	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV ortamı (araştırma sınıfı), AlbuMax Takviyesi	Thermo Fisher Scientific	31035025
Evde			engelleme tamponu
Brewer tiyoglikolat ortamı	Sigma-Aldrich	B2551	Suda hazırlanan, otoklavlanan ve donmuş halde tutulan% 4 stok çözeltisi.
CD11b	Biolegend	101222	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
CD11b	BD	550993	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo
1'e bakın CD11c	Biolegend	117317	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
CD11c	Biolegend	117333	Seyreltme ve konsantrasyon CD19 BD için Tablo 1'e bakın
		560375	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
CD19	Biolegend	152410	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
CD226	Biolegend	128808	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo
1'e bakın CD3e	BD	560527	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo
1'e bakın CD3e	Biolegend	152313	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
CD4	Biolegend	100412	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
CD73	eBioscience	16-0731-82	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
CD8a	eBioscience	48-0081-82	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
Hücre kültürü şişesi (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One	658175
Santrifüj tüpleri, konik tabanlı tüpler 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	358126
Santrifüjler	Beckman Coulter		Ultrasantrifüj ve TC santrifüj
Kollajenaz tip IV	Sigma-Aldrich	C5138
Konik santrifüj tüpleri (15 mL ve 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Kriyotüpler	Greiner Bio One	123277	veya kriyotüpler
DMEM ortamı (1x) + 4.5g / L D-glikoz, 400 ve mikro; ML-glutamin	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Effectene transfeksiyon reaktifi	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
F4/80	Biolegend	123133	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
F4/80	Biolegend	123147	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
FceR1	eBioscience	48-5898-80	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
Fetal buzağı serumu (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	ısı, 56 ° C'de 30 dakika boyunca inaktive edilir; C ve steril 0.22 & ile filtrelenmiş; m filtre
Akış sitometresi	Thermo Fisher Scientific	Evde hazırlanan Attune NxT
Akış sitometrisi (FACS) tamponu
			Transfeksiyondan en az bir hafta önce yetiştirilir. Mikoplazma içermeyen
HIV-1 Çekirdek antijeni	Beckman Coulter	6604667
Hyaluronidaz	Sigma-Aldrich	H3506
Hydrex cerrahi ovma, klorheksiding glukonat %4 w/v cilt temizleyici	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
ICAM1	Becton Dickinson	554970
			Tablo 1'e bakın. Mikoplazma içermeyen
CANLI/ÖLÜ sabitlenebilir yakın IR ölü hücre leke kiti	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
Buradaki fareler			, farklı şekilde belirtilmedikçe 8-12 haftalık C57BL/6 dişileri (Charles Rivers) kullandı
Mikrokılcal pipetler (hacim aralığı 0.5-1.000 μ L)	Fisher Bilimsel & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biyoefsane	108724	seyreltilmesi ve konsantrasyonu için Tablo
			1'e
; R8.91 ambalaj plazmidi		Zuffrey, R., et al. 1997,	sitomegalovirüs promotörü tarafından yönlendirilen Gag-Pol HIV proteinini kodlar. Ampisilin direnci.
Penisilin / Streptomisin (100x, 10.000 U / mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri kabı	Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plazmid		Rosas, M. ve ark. 2014	shRNA ve miR ekspresyon çalışmaları için modifiye edilmiştir. Woodchuck hepatitiv virüs arttırıcısının aşağı akış SFFV promotörü ve yukarı akışında EGFP işaretleyicisini kodlar. Ampisilin direnci.
pMD2.G plazmid		Naldini, L. ve ark. 1996,	veziküler stomatis virüsü g-glikoprotein (VSV-G) zarfını kodlar. Ampisilin direnci.
Sıçan IgG1, κ izotip kontrolü	Becton Dickinson	550617	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
Sıçan serumu	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
Evde			kırmızı kan ACK lizis tamponu
RPMI 1640 orta (1x) + 400 uM L-glutamin	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	seyreltilmesi ve konsantrasyonu için Tablo 1'e bakın
(çamaşır suyu, 2.000 ppm)	Guest Medical	H8818
Steril 24 oyuklu hücre kültürü plakası	Greiner Bio One	662160
Steril Dulbecco'nun PBS'si (DPBS) (1x) Mg++ ve Ca2+ - ücretsiz	Thermo Fisher Scientific	14190144
Steril EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
Steril VWR tek kullanımlık transfer pipetleri (23,0 mL, 30 cm)	VWR	612-4515
Sükroz	Thermo Fisher Scientific	15503022
cerrahi makas	N/A	N/A	Kullanıcı tercihi
Şırıngalar (50 mL ve 1 0mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	Seyreltme ve konsantrasyon için Tablo 1'e bakın
U-dipli 96 oyuklu hücre kültürü plakası	Greiner Bio One	650180