Yöntem makalesi

Fonksiyonel 3D Küresel Hücre Kültürlerinin Yarı Otomatik Fenotipik Analizi

DOI:

10.3791/65086

⸱

18 Ağustos 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, 3CelVivo ApS

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Görüntü yakalama ve proteomik kullanarak yüksek tekrarlanabilirliğe sahip sferoidlerin yetiştirilmesi ve fenotipik karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D hücre kültürlerini büyütmek, tedavi etmek ve izlemek için bağımsız bir klinostat inkübatörü kullanmanın özelliklerini ve avantajlarını açıklayan bir protokol sunuyoruz. Klinostat, hücrelerin düşük kesme kuvvetleri ve aktif besin difüzyonu ile yüksek oranda tekrarlanabilir sferoidler olarak bir araya gelebildiği bir ortamı taklit eder. Hem kanserli hem de kanserli olmayan hepatositlerin (HepG2/C3A ve THLE-3 hücre hatları) karaciğer hücreleriyle karşılaştırılabilir işlevlere ulaşmadan önce 3 haftalık büyüme gerektirdiğini gösterdik. Bu protokol, hücre büyümesini izleyen kameralara sahip 3D hücreler için inkübatörlerin kullanılmasının rahatlığını vurgulamaktadır, çünkü tedavi sırasında sferoidleri saymak ve ölçmek için anlık görüntüler alınabilir. THLE-3 ve HepG2/C3A hücre hatlarının karşılaştırılmasını, kanserli olmayan hücre hatlarının ve ölümsüzleştirilmiş kanser hücrelerinin nasıl büyütülebileceğini gösteriyoruz. Proteomik deneylerin, hücre sinyalini bozmadan, yani tripsinizasyon gerektirmeden toplanabilen birkaç sferoidden nasıl yapılabileceğini gösteriyor ve gösteriyoruz. Proteomik analizin, solunum zinciri metabolizmasının tipik karaciğer fenotipini ve metal detoksifikasyonunda yer alan proteinlerin üretimini izlemek için kullanılabileceğini ve sferoid alanını saymak ve ölçmek için yarı otomatik bir sistemi tanımlamak için kullanılabileceğini gösterdik. Toplamda, protokol, görüntü yakalama yoluyla fenotipik bir karakterizasyon ve 3D hücre kültürü modelleri üzerinde deney yapmak için bir proteomik boru hattı içeren bir araç kutusu sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İn vitro hücre kültürlerinin biyolojide temel bilgilerin oluşturulmasında gerekli ve paha biçilmez olduğu kanıtlanmıştır. Biyoloji ve kanserdeki bilimsel anlayışın çoğu, özellikle tek tabakada büyüyen hücreler olan 2D kültür sisteminden gelmiştir. 2D kültür, baskın hücre kültürü sistemi olmasına rağmen, potansiyel olarak daha fazla biyolojik ilerlemeyi engelleyebilecek birçok dezavantaja sahiptir. Örneğin, 2D kültürler, hücre sinyalizasyonu ve proliferasyonu için önemli olan hücre-hücre etkileşimlerinden yoksundur1. Bugüne kadar, 3D kültür sistemlerinin farklılaşmayı, ilaç yanıtını, tümör invazyonunu ve biyolojiyi daha iyi modellediği gösterilmiştir 2,3,4,5. Kötü huylu kanserlerin 3 boyutlu modellenmesi, yaşlanan nüfus ve kanser ölümlerindeki artış nedeniyle özellikle hayati önem taşımaktadır. Hepatosellüler karsinom (HCC), dünya çapında kansere bağlı mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir ve sıklıkla berbat bir prognoza sahiptir6. HCC'nin düşük kür oranına, zayıf ilaç yanıtına ve yüksek tekrarlama oranına sahip olduğu bilinmektedir 6,7,8. Normal karaciğer ve HCC için in vivo normal ve malign karaciğer dokusunun fizyolojisini taklit eden çeşitli 3D modeller geliştirilmiştir 9,10.

Mevcut 3D sistemlerden bazıları sıvı kaplamalar, biyoreaktörler, hidrojel, iskeleler ve 3D baskılı yapıları içerir. Biyoreaktörlerde üretilen sferoidler, besin maruziyetinin, gaz değişiminin ve hücre proliferasyonunun/sessizliğinin tümör dağılımını taklit ettikleri için özellikle benzersiz avantajlar sağlar11. Biyoreaktörler, kullanım kolaylıkları, büyük ölçeklenebilirlikleri, besin yayılımları ve erişilebilirlikleri nedeniyle özellikle kanser modelleri için uygundur11. Ek olarak, biyoreaktörler yüksek verimli deneylere, daha fazla tekrarlanabilirliğe ve daha az insan hatasına izin verebilir. Bu çalışmada kullanılan biyoreaktör benzersizdir, çünkü tipik biyoreaktörlerde uygulanan yıkıcı kesme kuvvetlerini en aza indirgeyen ve daha iyi tekrarlanabilirlik sağlayan azaltılmış yerçekimi sistemini simüle eder12. Çok yönlü yerçekimi ve kesme kuvvetlerindeki azalma, hücrelerin daha fizyolojik bir şekilde gelişmesine izin verir. Kanıt olarak, bu metodoloji altında büyütülen HepG2/C3A hücreleri, in vivo ATP, adenilat kinaz, üre ve kolesterol13,14 seviyeleri üreten küresel organeller geliştirir. Ek olarak, bu 3D sistemdeki ilaç tedavileri, 2D kültürlere kıyasla daha gelişmiş ve otomatiktir. 2D kültürlerde, ilaç tedavileri, hücre sağlığını deneme ve koruma ihtiyacı nedeniyle genellikle kısa bir süreye sahip olmalıdır. Ancak bizim durumumuzda, hücrelerin yapısını ve fizyolojisini bozmaya gerek kalmadan sferoidlerin uzun süreli ilaç tedavilerini gerçekleştirebiliyoruz. Bu nedenle, in vivo biyolojik olayları daha iyi modellemek ve daha fazla bilimsel gelişme için 2B'den 3B'ye geçiş gereklidir.

Bu makale, yüksek tekrarlanabilirliğe sahip sferoidlerin yetiştirilmesi için bir metodoloji sunar (Şekil 1 ve Şekil 2) ve 3D yapıları fenotipik olarak karakterize etmek için yarı otomatik bir sistemi gösterir (Şekil 3). Görüntü düzeyinde, sferoidlerin alanını sayma ve ölçme hakkında bilgi veriyoruz (Şekil 3). Kütle spektrometresi yöntemlerini kullanarak, proteomiklerin spesifik biyolojik fonksiyonları değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz (Şekil 4). Bu verileri toplayarak ve analiz ederek, 3D hücre kültürü sistemlerinin arkasındaki biyolojinin anlaşılmasını geliştirmeyi umuyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tamponlar ve reaktifler

  1. HepG2 / C3A hücreleri için hücre büyüme ortamı: Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamını hazırlayın (DMEM, 4.5 g / L glikoz)% 10 fetal sığır serumu (FBS), esansiyel olmayan amino asitler (% 1 v / v), L-glutamin (% 1 v / v) ve% 1 v / streptomisin (% 0.5 v / v). Büyüme ortamını 4 °C'de saklayın.
  2. THLE-3 hücreleri için hücre büyüme ortamı: Takviyelerini (sığır hipofiz ekstresi [BPE], hidrokortizon, insan epidermal büyüme faktörü [hEGF], epinefrin, transferrin, insülin, retinoik asit, triiyodotironin, gentamisin sülfat-amfoterisin [GA]) ve ayrıca %10 FBS, 5 ng/mL hEGF ve 70 ng/mL fosfoetanolamin içeren bronşiyal epitel hücre büyüme ortamı [BEGM] hazırlayın.
  3. 500 mM DL-Ditiyotreitol (DTT): 10 mL hazırlamak için, 10 mL HPLC sınıfı suda 0.771 g DTT'yi yeniden süspanse edin. 100 μL'lik alikotları -20 °C'de saklayın.
  4. 200 mM iyodoasetamid: 1 mL hazırlamak için, 1 mL 50 mM amonyum bikarbonat içinde 36 mg iyodoasetamid yeniden süspanse edilir. Yeniden süspanse edilmiş iyodoasetamidi saklamayın.
  5. % 5 sodyum dodesil sülfat (SDS): 50 mL hazırlamak için, 50 mL 50 mM amonyum bikarbonat içinde 2,5 g SDS'yi yeniden süspanse edin. 4 °C'de saklayın.
  6. %12 fosforik asit: 100 mL hazırlamak için 14.1 mL %85 fosforik asidi 85.9 mL HPLC sınıfı su ile seyreltin. Oda sıcaklığında (RT) bir cam şişede saklayın.
  7. Bağlayıcı tampon: 1 L hazırlamak için, 100 mL 10 mM amonyum bikarbonat veya TEAB'ye 900 mL konsantre metanol ekleyin.
  8. % 0.1 Trifloroasetik asit (TFA) çözeltisi: 999 mL HPLC sınıfı suya 1 mL konsantre TFA ekleyin. 4 °C'de saklayın.
  9. %60 asetonitril/%0.1 TFA çözeltisi: 399 mL HPLC sınıfı suya 600 mL HPLC sınıfı asetonitril (%60 v/h) ekleyin. Daha sonra, bu çözeltiye 1 mL konsantre TFA ekleyin, ardından 4 °C'de saklayın.
  10. Mobil Faz A (MPA) -% 0.1 formik asit: 999 mL HPLC sınıfı suya 1 mL konsantre formik asit ekleyin ve iyice karıştırın.
  11. Mobil Faz B (MPB) - %80 HPLC sınıfı asetonitril + %0,1 formik asit: 199 mL HPLC sınıfı suya 800 mL HPLC sınıfı asetonitril ekleyin. Daha sonra, bu çözeltiye 1 mL konsantre formik asit ekleyin ve karıştırın.

2. Sferoidlerin hazırlanması

NOT: Şekil 1A , hücre hatlarından 3B sferoidlerin hazırlanması ve kültürlenmesi için ilk adımları temsil eder.

  1. Dondurulmuş HepG2 / C3A ve THLE-3 hücrelerini çözün ve yaklaşık% 80 birleşmeye ulaşana kadar bir doku kültürü şişesinde veya kabında standart büyüme ortamı kullanarak tek tabaka olarak büyütün.
    NOT: Hücreler birleştiğinde, bir mikroskop kullanarak genel hücresel morfolojiyi ve büyüme modellerini kontrol edin. Yüksek geçiş sayılarında hücrelerin kullanılması önerilmez.
  2. Hücreleri Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi ile iki kez yıkayın (HBSS, T75 cm2 şişe veya 10 cm tabak için 5 mL kullanın).
  3. HBSS (1: 2 seyreltme) ile seyreltilmiş 5 mL %0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve %5 CO2 ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Hücre ayrılmasını değerlendirmek için bir mikroskop kullanın ve tripsin reaksiyonunu nötralize etmek için 3 mL FBS veya büyüme ortamı (% 10 FBS içeren) ekleyin.
  4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın. RT'de 270 x g'de 5 dakika aşağı çevirin.
  5. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 5 mL tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin.
    NOT: Çok fazla hücre varsa, saymadan önce hücre süspansiyonunu seyreltin.
  6. Hücre sayısını sayın ve maksimum 1.5 mL hacimde 1 x 106 elde etmek için hücre süspansiyonunu tam büyüme ortamında seyreltin.
  7. Mikro kuyular içeren ultra düşük ataşmanlı 24 oyuklu yuvarlak alt plakayı dengeleyin.
    1. Kuyucukları 0,5 mL büyüme ortamı ile yıkayın.
    2. Plakayı 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin (bu, kuyucukların yüzeyindeki hava kabarcıklarını giderir).
  8. Hücre süspansiyonunu (adım 1.4'te hazırlanan) plakaya aktarın ve 120 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Hücre süspansiyon hacmi, hücre sayısına bağlı olarak değişebilir, ancak bunu 1,5 mL ile sınırlamak önemlidir.
  9. Küresel oluşumu başlatmak için plakayı 37 ° C'de% 5 CO 2 ile 24 saat inkübe edin.

3. Biyoreaktörlere sferoid kültürü (Şekil 2)

NOT: Kürelerin yapısını korumak için, 3D küreleri tutarken geniş çaplı uçlar kullanın.

  1. Sferoidleri aktarmadan 24 saat önce nem odasını 25 mL steril su ve hücre odasını 9 mL büyüme ortamı ile doldurarak biyoreaktörü dengeleyin (Şekil 2A). Nemi ve hücre odalarını doldururken uzun bir iğneye bağlı 10 mL'lik bir şırınga kullandığınızdan emin olun.
  2. Biyoreaktörü 3D inkübatörde (Şekil 15 rpm) döndürerek (Şekil 2D,F), %5 CO 2 ile 37 °C'de 24 saat inkübeedin.
  3. 1 mL genişliğinde delikler kullanarak, sferoidleri ultra düşük bağlantı plakasından ayırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin ve sferoidleri bir doku kültürü kabına aktarın.
  4. Kalan sferoidleri yakalamak ve bunları adım 3.3'ten itibaren aynı kaba aktarmak için ultra düşük bağlantı plakasını 0,5 mL önceden ısıtılmış büyüme ortamı ile yıkayın.
  5. Bir ışık mikroskobu (4x büyütme) kullanarak sferoidlerin boyutunu, kompaktlığını ve yuvarlaklığını değerlendirin ve yeterince şekillendirilmiş olanları seçin.
    NOT: Hücreler, kompakt olduklarında yeterince oluşur ve kullanım sırasında dağılmazlar. Sferoidlerin tek bir birim olması ve bir araya toplanmaması da önemlidir. Biyoreaktöre aktarılırken 100-200 μm arasında bir küresel boyut tercih edilir.
  6. Sferoidleri 5 mL taze büyüme ortamı ile doldurulmuş dengelenmiş biyoreaktöre aktarın. Sferoidleri aktardıktan sonra, biyoreaktörü tamamen taze büyüme ortamıyla doldurun ve ortamla doldururken biyoreaktöre kabarcık eklemekten kaçındığınızdan emin olun.
  7. Biyoreaktörü 3D inkübatöre yerleştirin ve kontrol ünitesini kullanarak dönüş hızını ayarlayın (Şekil 2C). HepG2/C3A sferoidleri için dönüş hızını 10-11 rpm'ye ayarlayın; THLE-3 sferoidler için 11-12 rpm'ye ayarlayın.
    NOT: Dönüş hızı, sferoidler biyoreaktörün ortasına eşit olarak dağıldığında ve duvarlarına değmediğinde doğru şekilde ayarlanır. Şekil 2E, dönen bir biyoreaktörü göstermektedir.
  8. Her 2-3 günde bir, 10 mL eski besiyerini çıkarıp yerine 10 mL taze besiyeri koyarak büyüme ortamını değiştirin; medya alışverişi yaparken sferoidleri çıkarmadığınızdan emin olun (Şekil 2B).
    NOT: Rutin bir medya alışverişine sahip olmanız (örneğin, 48 saat/48 saat/72 saat) ve ayrıntılı bir kayıt tutmanız önerilir.
  9. Ortam her değiştirildiğinde dönüş hızını ayarlayın. Kürelerin boyutu ve sayısı büyüdükçe hızı artırın.
  10. Kültürde 15 gün geçirdikten sonra, sferoidleri iki yeni biyoreaktöre ayırın.
    NOT: Hücre hattına ve büyüme hızına bağlı olarak, süre değişebilir ve ayrı ayrı optimize edilmelidir.
  11. 20 gün sonra, sferoidler toplanmaya hazırdır.

4. Görüntü yakalama ve sferoidlerin sayımı

NOT: Sferoid sayımı için basitleştirilmiş boru hattı Şekil 3A'da gösterilmektedir. Sferoid sayımı ve alan belirleme (bölüm 5) için, 3D yapıların kompaktlığını değerlendirmek çok önemlidir. Bu, yöntemin doğru olması için gerekli olan daha gelişmiş bir renk kontrastına katkıda bulunacaktır.

  1. Tablette yüklü olan 3D uygulamasını açın.
  2. Biyoreaktörü seçin ve anlık görüntü alın.
    NOT: Alternatif olarak bir resim de çekilebilir. Aşağıdaki parametreler dikkate alınmalıdır.
    1. Biyoreaktörün arkasına siyah bir arka plan yerleştirin (biyoreaktör kutusunda siyah destek sağlanır).
    2. Hücre odasında ışık yansıması olmadığından emin olun.
    3. Fotoğrafı biyoreaktöre mümkün olduğunca yakın çekin.
  3. FIJI'de (ImageJ) bir resim açın.
  4. Resmi analiz için hazırlayın:
    1. Oval aracını seçin. Fişin etrafına bir daire çizin.
    2. Dairenin içindeki her şeyi siyah yapmak için klavyede Sil'i tıklayın. Hücre odasının etrafına bir daire çizin. Tüm sferoidlerin dairenin içinde olduğundan emin olun.
  5. Sferoidleri saymak için makroyu çalıştırın:
    1. Makro > Kaydı > Eklentiler'e tıklayın. Makro metnini Ek Dosya 1'den kaydediciye kopyalayın.
    2. Oluştur'a basın, yeni bir pencere açılacaktır. Açılan resmi analiz etmek için Çalıştır'a basın.
    3. Sonuçları (sayı, toplam alan, ortalama boyut ve yüzde alanı) içeren yeni bir pencere açılacaktır.
  6. Görüntüyü kapatın ve küresel sayımın gerekli olduğu her görüntü için 4.4 ve 4.5 adımlarını yineleyin. Daha kolay ve hızlı işlem için makroyu kaydedin ve Eklentiler > Makro > Çalıştır'ı tıklatarak çalıştırın ve kaydedilen makroyu seçin.

5. Küresel alanın planimetrik olarak belirlenmesi

NOT: Küresel alanı belirlemek için basitleştirilmiş boru hattı Şekil 3B'de gösterilmektedir.

  1. Görüntüleri adım 3.5'te açıklandığı gibi çekin.
  2. Başlamadan önce, sferoidlerin alanını ölçmek için küresel bir ölçek ayarlayın.
    1. FIJI'de, istenen büyütme oranına sahip bir ölçek çubuğuna sahip bir resim açın. Çizgi aracını seçin. Ölçek çubuğunun üzerine çizin (çizginin ölçek çubuğu kadar uzun olması gerekir).
    2. Analizi açın > ölçeği ayarlayın. Bilinen mesafeyi yazın (çizginin uzunluğu otomatik olarak Piksel cinsinden Mesafe'ye girilir. Global'i işaretlediğinizden emin olun.
    3. Tamam'a basın. Şimdi analiz edilecek resim için ölçek ayarlanmıştır.
  3. Planimetrik belirlemeyi başlatmak için makroyu çalıştırın (Ek Dosya 2).
    1. Toplu > Makro > İşleme'yi tıklatın. Analiz edilecek resimleri içeren klasörü seçin. Bu klasör Giriş olacaktır.
    2. Adım 5.3.1'de oluşturulan klasörü Çıktı olarak seçin. İşlem'e basın.
  4. Kalite kontrolü olarak, ölçülen küresel alanın orijinal görüntüye karşılık gelip gelmediğini değerlendirin.
    NOT: Makro, kürenin yalnızca bir kısmının ölçülebildiği kenardaki sferoidleri hariç tutar.

6. Sferoidlerin toplanması

NOT: Sferoidlerin 3D yapılarını korumak için geniş delikli uçlar kullanılarak toplanması şiddetle tavsiye edilir. Toplama, biyoreaktörün önündeki tapa kullanılarak yapılabilir (Şekil 2A).

Toplama sırasındaki sferoidlerin boyutu, hücre hattına, başlangıç hücre sayısına ve bölünme sürecine (kültürdeki gün sayısı, biyoreaktör başına sferoid sayısı ve bölünme oranı) bağlı olarak değişebilir.

  1. Sferoidleri toplamak için, uzun bir iğneye bağlı bir şırınga kullanarak biyoreaktörden üst porttan 5 mL ortam çıkarın. Sferoidlerin biyoreaktörün alt ortasına (alt portun yakınında) batmasına izin verdiğinizden emin olun.
  2. Ön portu açın ve 1 mL genişliğinde bir delik ucu kullanarak sferoidleri toplayın. Sferoidleri mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin. Sferoidleri 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin ve ortamı atın.
  3. FBS'yi çıkarmak için sferoidleri 200 μL HBSS ile yıkayın. 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  4. Küresel peleti sıvı nitrojen ile dondurun ve işlenene kadar -80 °C'de saklayın.

7. Sferoidlerin canlılığı

NOT: Sferoid canlılığı, hasarlı hücreler tarafından salınan adenilat kinazın (AK) aktivitesi ölçülerek belirlendi (Şekil 4A). Difüzyon gradyanı nedeniyle, sferoidlerin çapı 900 μm'den küçük olduğunda AK ölçümü etkilidir12. Sferoidler büyürse veya canlılık ölçümü ile ilgili herhangi bir şüphe varsa, bir ATP testi yapılabilir15.

  1. Sferoid süpernatanı toplayın ve 20 μL'yi 96 oyuklu beyaz duvarlı bir plakaya aktarın (düz dipli açık). Her bir oyuğa 100 μL adenilat kinaz tespit reaktifi ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin.
  2. RT'de 2 dakika boyunca hız vakumunda santrifüjleme ile kabarcıkları çıkarın. Plakaları RT'de 20 dakika inkübe edin.
  3. Plakayı luminometreye (plaka okuyucu, lüminesans modu) yerleştirin ve programı başlatın. Parametreleri kit üreticisinin talimatlarına göre ayarlayın.
    NOT: Biyolüminesan canlılık deneylerinde, hücre yanıtını hesaplamak için doğrudan luminometre ışık çıkışı (genellikle RLU'lar) kullanılabilir. Adenilat kinaz sadece hücre bütünlüğü bozulmuş hücrelerden sızacağından, bir lizis reaktifi kullanarak toplam adenilat kinaz kontrolü elde etmek mümkündür.

8. Protein ekstraksiyonu

NOT: Şekil 1B , sferoidlerin işlenmesi ve protein ekstraksiyonu için iş akışını temsil eder.

  1. 36. günde sferoidleri (bölüm 6) toplayın. Hücreleri parçalamak için sferoidleri 25 μL% 5 SDS'de yeniden süspanse edin.
    1. %5 SDS ekledikten sonra, peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin. Bazı durumlarda, sferoidleri parçalamak zor olduğunda, küçük bir havaneli kullanın.
  2. Proteinleri azaltmak için numuneleri 1 saat boyunca 20 mM DTT ile inkübe edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
  3. Numuneleri 40 mM iyodoasetamid ile 30 dakika boyunca inkübe edin, hafif ila alkilat proteinlerinden korunun. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
  4. Numunelere %1,2'lik bir nihai konsantrasyonda %12 fosforik asit çözeltisi (10x) ekleyin.
  5. Numuneleri altı hacim bağlayıcı tampon içinde seyreltin ve hafifçe karıştırın.
  6. Numuneyi bir S-Trap filtre plakasına yükleyin ve 30 saniye boyunca 500 x g'da döndürün.
    NOT: Adım 8.4'teki numunenin toplam hacmi kolon hacim kapasitesini aşarsa, numuneleri gruplar halinde yükleyin ve her şey kolondan geçene kadar 8.6 adımını tekrarlayın.
  7. Numuneleri 150 μL bağlayıcı tampon ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra, 30 saniye boyunca 500 x g'da döndürün ve akışı boşaltın.
  8. Numuneleri, gece boyunca 37 °C'de 50 mM amonyum bikarbonat içinde seyreltilmiş 1 μg dizileme dereceli tripsin ile inkübe edin.
    NOT: Kapsamlı proteom analizi için başlangıç materyali olarak en az 20 μg protein önerilir. Bunun için 1 μg tripsin, verimli sindirim için ideal miktardır. Tampon ve sütun yatağı arasındaki kabarcıkları çıkarın.
  9. Peptitleri 40 μL 50 mM amonyum bikarbonat ile elute edin ve aynı toplama tüpüne toplayın.
  10. 30 saniye boyunca 500 x g'da döndürün. Peptitleri 40 μL% 0.1 TFA ile elute edin ve bunları aynı toplama tüpüne koyun.
  11. 30 saniye boyunca 500 x g'da döndürün. Peptitleri 40 μL %60 asetonitril ve %0.1 TFA ile elute edin ve aynı toplama tüpüne toplayın.
  12. 30 saniye boyunca 500 x g'da döndürün. Kuru havuzlanmış elüatlar hız vakumunda ve numuneleri işlenene kadar -80 °C'de saklayın.

9. Örnek temizleme

NOT: Proteomik analize geçmeden önce numunelerde bulunan tuzun uzaklaştırılması gerekmektedir. Tuzlar, elektrosprey sırasında iyonlaştıkları için yüksek performanslı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (HPLC-MS) analizine müdahale edebilir ve peptitlerden gelen sinyali bastırabilir. Bu çalışmada kullanılan tuzdan arındırma kurulumu daha önce Joseph-Chowdhury ve meslektaşlarıtarafından gösterilmiştir 16.

  1. Başlamadan önce, aşağıdaki adımlar sırasında akışı toplamak için temiz bir 96 kuyulu toplama plakası olduğundan emin olun. C18 reçinesini (%100 asetonitril içinde 50 mg/mL) manyetik bir karıştırma plakasında karıştırın.
  2. 96 oyuklu filtre plakasının oyuğuna 70 μL C18 reçine süspansiyonu ekleyin, C18 reçinesinin pipetin dibinde birikmemesini sağlamak için bunu hızlı bir şekilde yapın.
  3. Sıçramayı önlemek için vakumu yavaşça açın. 96 oyuklu toplama plakasında toplanan akışı atın.
  4. Reçineyi 100 μL% 0.1 TFA ile yıkayın. Numunelerin sıçramasını ve karışmasını önlemek için vakumu yavaşça açın ve akışı atın.
  5. Her numuneyi 100 μL% 0.1 TFA'da yeniden süspanse edin. PH'ın 2-3 arasında olduğundan emin olun.
  6. Her numuneyi filtre plakasının her bir kuyucuğuna yükleyin. Numunelerin sıçramasını ve karışmasını önlemek için vakumu yavaşça açın ve akışı atın.
  7. 100 μL% 0.1 TFA ile yıkayın. Numunelerin sıçramasını ve karışmasını önlemek için vakumu yavaşça açın. Akışı atın.
  8. Tuzdan arındırılmış numuneleri toplamak için 96 oyuklu toplama plakasını yeni bir 96 oyuklu plaka ile değiştirin.
  9. Oyuk başına 60 μL asetonitril /% 0.1 TFA ekleyin. Numuneleri C18 reçinesinden çıkarmak için, sıçramayı önlemek için vakumu hafifçe açın.
  10. Akışı toplayın ve RT'de hızlı bir vakumda kurutun. LC-MS/MS'ye geçin veya numuneleri işlemeye hazır olana kadar plakayı -80 °C'de saklayın.

10. Kütle spektrometresi ile birleştirilmiş sıvı kromatografisi ile proteomik analiz

NOT: Bu makalenin verilerini oluşturmak için, 300 μm ID x 0,5 cm C18 tuzak kolonu ve 75 μm ID x 25 cm C18-AQ (3 μm) analitik nano-kolon ile iki sütunlu sistem kurulumuna sahip bir nLC-MS/MS sistemi kullanıldı.

  1. Mobil aşamaları HPLC'de çalışacak şekilde hazırlayın:
    Mobil Faz A (MPA): HPLC sınıfı suda %0,1 formik asit
    Mobil Faz B (MPB): HPLC dereceli asetonitrilde %0,1 formik asit
  2. HPLC yöntemini şu şekilde programlayın: 120 dakika boyunca% 4 -% 34 MPB, 5 dakika boyunca% 34 -% 90 MPB, 5 dakika boyunca% 90 MPB; akış hızı: 300 nL/dak.
  3. Tespit edilen peptit sinyallerinin MS/MS spektrumlarını oluşturmak için veriden bağımsız edinim (DIA) gerçekleştirmek için MS toplama yöntemini ayarlayın.
  4. Numuneleri nLC otomatik numune alma cihazına yerleştirmeden önce 1 μg numuneyi 10 μL %0.1 TFA içinde yeniden süspanse edin.
  5. nLC-MS yöntemini kanonik proteomik edinimi için programlandığı gibi çalıştırın:
    1. 120.000 çözünürlük (200 m/z'de) ve 125 otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefi ile orbitrap'ta tam MS taramasını 300-1100 m/z'ye ayarlayın.
    2. 50 AGC hedefi 400 ve Yüksek enerjili çarpışma ayrışması (HCD) enerjisi 30 olan 30 m/z'lik sıralı izolasyon penceresine sahip yörüngede MS/MS'yi ayarlayın.

11. Veri analizi

  1. nLC-MS/MS ham veri dosyalarını, kullanılan MS platformuyla uyumlu bir tepe algılama yazılımına aktarın.
  2. Uygun veritabanını seçin (insan, fare vb.).
  3. N-terminal asetilasyonunu değişken modifikasyon olarak ve karbamidometil sisteini sabit modifikasyon olarak ayarlayın.
  4. Tripsin'i, izin verilen iki kaçırılmış bölünme ile sindirim enzimi olarak belirtin.
  5. Kütle toleransını, spektrum alımı için kullanılan kütle analizörüne göre ayarlayın.
  6. Analizi bir elektronik tablo olarak dışa aktarın ve verileri gerektiği gibi daha fazla işleyin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, özellikle 3D sferoidlerin kültürlenmesi için tasarlanmış bir sistem olan yenilikçi, stressiz bir 3D hücre inkübatörünün özelliklerini açıklıyoruz (Şekil 2). THLE-3 ve HepG2/C3A hücre hatlarının 3D kültürü için protokolü optimize ettik. Burada açıklanan protokolün kullanımı kolaydır ve biyoreaktör başına > 100 sferoidin tekrarlanabilirliğine ve uygun maliyetli kültürüne izin verir. Biyoreaktöre girdikten sonra, sferoidler 2D kültürde tutulan hücrelere benzer şekilde muamele edilir. Optimum büyüme koşulları, ortamın haftada iki ila üç kez değiştirilmesiyle (Şekil 2B) ve dönüş hızının sferoidlerin büyümesine ve boyutuna göre ayarlanmasıyla elde edilir (Şekil 2C). 3 boyutlu sferoidlerin dönen biyoreaktörlerde kültürlendiği bu sistem (Şekil 2E,F), sferoidi eşit ve çok düşük miktarda kesme kuvvetine maruz bırakarak 3 boyutlu yapılar için optimal bir büyüme ortamı sağlar.

Kromatin modifikasyonu16'nın analizi için sferoidlerin nasıl kullanılabileceğini daha önce göstermiştik. Burada, karaciğer sferoidlerinin nasıl elde edileceğini ve tam proteomun analizi için proteomik deneylerin nasıl yapılabileceğini ayrıntılı olarak gösteriyoruz (Şekil 1

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üç boyutlu (3D) hücresel yapıların arkasındaki biyolojiyi anlamak, işlevleri hakkında daha kapsamlı bilgi için son derece önemlidir. Karmaşık biyolojiyi incelemek ve toksisite taraması yapmak için 3B modellerin kullanılmasına artan bir ilgi var. Hücreleri 3D olarak yetiştirirken, model sistemin fenotipik değerlendirmesi de dahil olmak üzere birçok faktörün dikkate alınması gerekir. Bir fenotip, belirli bir organizmanın morfolojisi, davranışı, fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri gibi gözlemlenebilir özellikleri grubu olarak tanımlanır20.

Bu protokolde, proteomik deneylerin birkaç sferoidden nasıl yapılabileceğini ve tipik karaciğer fenotipini izlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Kütle spektrometresi, 3D hücre karakterizasyonu için yaygın olarak uygulanan bir yöntem haline geldi ve çeşitli biyolojik sorularınaraştırılmasına izin verdi 12,16,21,22. Kapsamlı bir proteom analizi için, kütle spektrometresine 1 μg enjekte edilen en az 20 μg protein başlangıç materyali kullanılması önerilir. Daha az numune eklemenin hassasiyet kaybına yol açabileceğini ve daha fazla numune eklemenin kromatografinin kalitesini kademeli olarak kötüleştireceğini ve sonunda kolonun tıkanmasına yol açacağını belirtmek önemlidir. Bu çalışmada, HepG2/C3A ve THLE-3 sferoidlerinin, spesifik karaciğer yolları olan ve kan şekeri düzeylerini korumak ve enerji üretimi için kritik olan glikoliz ve TCA döngüsünden önemli proteinlerle zenginleştirildiğini gösterdik23,24. Aslında, kütle spektrometresi analizi sadece protein düzeyinde bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda daha öncegrubumuz 16 tarafından gösterildiği gibi, protein translasyon sonrası modifikasyonların araştırılmasına da izin verir.

3 boyutlu fenotipik çalışmalarda dikkat edilmesi gereken bir diğer husus da sferoidlerin sayısı ve boyutudur. Deneyleri daha tekrarlanabilir hale getirmenin yanı sıra, bir kap içindeki 3D yapıların sayısı sferoidlerin boyutunu ve metabolik aktivite seviyelerini etkileyebileceğinden, kültürün ne zaman çoklu biyoreaktörlere bölüneceğini belirlemek için sferoidlerin sayısını saymak ve boyutlarını belirlemek çok önemlidir. Bununla birlikte, sferoidlerin sayısının ve boyutunun hücre hattına, başlangıç hücre sayısına, bölme işlemine ve toplama zamanına bağlı olduğunu vurgulamak önemlidir. HepG2 / C3A küresel kültürünün, sferoid başına hücre sayısı, protein içeriği ve yaşın bir fonksiyonu olarak büyüklüğü gibi ayrıntıları Fey, Korzeniowska ve Wrzesinski25 tarafından sağlanmıştır. Burada açıklanan yarı otomatik yöntemi kullanarak doğru ve başarılı bir analiz için en kritik adım iyi bir sferoid resmidir. Basitlik için, resim bir telefon veya tablet ile çekilebilir, ancak çözünürlüğü mümkün olduğunca yüksek tutulmalıdır. Görüntülerin elde edilmesi hızlı olduğundan, belirli fenotipik özellikleri görselleştirmek veya ilaç tedavisine verilen yanıtları araştırmak için büyük ölçekli tarama deneylerine izin verirler. Bu nedenle, hücre tabanlı tahlillerin sayısının artması nedeniyle, son 10 yılda görüntü analizi için bir dizi açık kaynaklı yazılım geliştirilmiştir26. Bu protokolde, sferoidlerin boyutlarını saymak ve ölçmek için FIJI18 yazılımını kullanan yarı otomatik bir sistemi tanımlıyoruz. Bir görüntü koleksiyonuna uygulanabilecek bir dizi algoritmik işlem tanımlamak için komut dosyaları (basit programlama komutları) sunduk ve analizi kolay ve hızlı bir süreç haline getirdik. Bununla birlikte, sferoidin özelliğine bağlı olarak, manuel bir ölçüm kullanılmalıdır. Örneğin, sferoidler çok yarı saydamsa, FIJI yazısı kesin olmayacaktır. Bu arada, bu yöntemin çalışması için en önemli kriterlerden biri sferoidlerin kompaktlığıdır. Bu özellik, yöntemin doğru olması için gerekli olan sferoidler ve arka plan arasında daha gelişmiş bir renk kontrastına katkıda bulunacaktır.

Özetle, yüksek tekrarlanabilirliğe sahip sferoidlerin yetiştirilmesi için bir metodoloji sunmanın yanı sıra, görüntü yakalama ve proteomik yoluyla fenotipik karakterizasyon ile birleştirilmiş yarı otomatik bir sistem de tanımlanmıştır. 3D hücreleri analiz etmek için bu araç kutusunun, tam otomatik görüntü analiz yazılımı ve yeni nesil kütle spektrometreleri ile daha sağlam hale gelmesini bekliyoruz.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Helle Sedighi Frandsen, ClinoStar sisteminin üreticisi CelVivo ApS'de araştırmacı bilim adamı olarak çalışmaktadır. Karoline Mikkelsen, CelVivo ApS'de çalışan ve doktora çalışmasını SDU, Odense, Danimarka'da yapan bir endüstri doktora öğrencisidir. Diğer tüm yazarların rekabet eden mali çıkarları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sidoli laboratuvarı, Lösemi Araştırma Vakfı'na (Hollis Brownstein Yeni Araştırmacı Araştırma Bursu), AFAR'a (Sagol Network GerOmics ödülü), Deerfield'a (Xseed ödülü), Relay Therapeutics'e, Merck'e ve NIH Direktörlük Ofisi'ne (1S10OD030286-01) minnetle teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL mikrosantrifüj tüpleriBio-Rad2239480
10 mL şırıngaFisher Scientific1481754Luer kilit ucu, 12 mL
1000 & mikro; L geniş çaplı pipet uçlarıFisher Scientific14222703
200 & L geniş çaplı pipet uçlarıFisher Scientific14222730
96 oyuklu Orochem filtre plakasıOrochem OF1100
96 kuyulu etekli plakaAxygenPCR-96-FS-C
96 kuyulu vakum manifolduMilliporeMAVM0960R
Amonyum bikarbonatSigmaA6141-25G
Bronşiyal Epitel Hücre Büyüme Ortamı (BEGM)LonzaCC-3170
Hücre kültürü sınıfı suCorning25-055-CV
3D hücre kültürü içinClinoReactorCelVivoN/A
ClinoStar inkübatörüCelVivoN/ACO2 3D hücre kültürü için inkübatör
DTTSigmaD0632-5G
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)Fisher ScientificMT17205CV
Elplasia 24 kuyulu yuvarlak tabanlı mikro kuyular içeren ultra düşük bağlantı plakasıCorning4441
Fetal Sığır SerumuFisher ScientificMT35010CV
Formik asitThermo28905
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Fisher ScientificMT21022CV
hEGFCorning354052
HERAcell vios 160iThermo51033557CO2 2D hücre kültürü
HPLC sınıfı asetonitrilFisher ScientificA955-4
HPLC sınıfı metanolFisher ScientificA452-1
HPLC sınıfı suFisher ScientificW5-4
İyodoasetamidSigmaI1149-5G
L-glutaminFisher ScientificMT25015CI
Esansiyel olmayan amino asitlerFisher ScientificMT25025CI
Oasis HLB Reçine 30 ve mikro; mSular186007549
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid kütle spektrometresiThermoIQLAAEGAAPFADBMBHQYüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi
PAULA mikroskobuLeica
Penisilin-StreptomisinFisher ScientificMT3002CI
PerkinElmer Victor X2 çok etiketli mikroplaka okuyucuPerkinElmer
pH kağıdıHydrion93
FosfoetanolaminSigmaP0503
Fosforik asitFisher ScientificA260-500
Pipet tabancasıEppendorfZ666467 (Milipore Sigma)
Soğutmalı santrifüjThermo75-217-420
Reprosil-Pur reçinesiMSWILR13. AQ.003120 Å gözenek boyutu, C18-AQ fazı, 3 & mu; M boncuk boyutu
SDSBio-Rad1610301
Sıralama sınıfı modifiye tripsinPromegaV511A
SpeedVac vakum konsantratörü (96 kuyucuklu plakalar)Thermo15308325Savant SPD1010
Steril başlıkThermo1375
Steril serolojik pipetlerFisher Scientific1367549
S-trapProtifiC02-micro-80
Şırınga iğnesi (18 G)Fisher Scientific148171003 "uzunluk, 0.05" çap
Trifloroasetik asit (TFA)Thermo28904
Tripsin-EDTAGibco25300-054
VorteksSigmaZ258415
Su banyosuFisher Scientific
Biyoreaktör için inkübatör FSGPD10

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
  2. Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model. Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).
  3. Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels. Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).
  4. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10 (29), (2012).
  5. Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures. Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).
  6. Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 22 (1), 243(2022).
  7. Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. The Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
  8. Sia, D., Llovet, J. M. Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).
  9. Tang, J., et al. A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro. Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).
  10. van Zijl, F., Mikulits, W. Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver. World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).
  11. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  12. Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22(2018).
  13. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  14. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
  15. Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids. Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).
  16. Joseph-Chowdhury, J. N., et al. Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606(2022).
  17. Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).
  20. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: The next challenge. Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).
  21. Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. Phenotypic analysis of organoids by proteomics. Proteomics. 17 (20), (2017).
  22. Avelino, T. M., et al. Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids. SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).
  23. Chiang, J. Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. McManus, L. M., MitchellIn, R. N. , Academic Press, Elsevier, San Diego. 1770-1782 (2014).
  24. Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver. Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).
  25. Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity. Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).
  26. Smith, K., et al. Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays. Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3D Spheroid CulturesClinostat IncubatorHepG2 C3A CellsTHLE 3 CellsProteomics AnalysisSpheroid FormationLC MS ProteomicsImage CaptureCell Viability

İlgili makaleler