Genetik Modifikasyon için Primat Serebral Organoidlerinin Hedefe Yönelik Mikroenjeksiyonu ve Elektroporasyonu

Serebral korteksin (pato) fizyolojik gelişimini ve evrimini araştırmak, uygun model sistemlerinin eksikliği nedeniyle engellenen zorlu bir görevdir. Önceden, bu tür çalışmalar iki boyutlu hücre kültürü modelleri (birincil nöral progenitör veya nöronal hücre kültürleri gibi) ve evrimsel olarak uzak hayvan modelleri (kemirgenler gibi) ile ^{sınırlıydı1,2}. Bu modeller belirli soruları ele almak için yararlı olsa da, sağlıklı ve hastalıklı durumlarda gelişmekte olan insan neokorteksinin karmaşıklığını, hücre tipi bileşimini, hücresel mimarisini ve gen ekspresyon kalıplarını modellemede sınırlıdır. Bu sınırlamalar, örneğin, bazı mikrosefali vakaları için açıklandığı gibi, insan hastalıklarının fare modellerinin insan durumuna zayıf bir şekilde çevrilebilirliğine yol açmaktadır (örneğin, Zhang ve ^ark.3). Son zamanlarda, insan neokorteks gelişiminin evrimsel, işlevsel ve morfolojik olarak daha yakın bir modeli olan transgenik insan dışı primatlar, hücre kültürü ve kemirgen bazlı modellerin birçok sınırlamasının üstesinden geldikleri için 4,5,6,7,8'e odaklanmıştır. Bununla birlikte, insan olmayan primatların araştırmalarda kullanılması sadece oldukça pahalı ve zaman alıcı değil, aynı zamanda etik kaygıları da beraberinde getirmektedir. Daha yakın zamanlarda, beyin organoid teknolojisinin gelişimi 9,10, önceki modellerin sınırlamalarının çoğunu çözen umut verici bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır 11,12,13,14,15,16.

Beyin organoidleri, tanımlanmış bir gelişimsel zaman penceresi 11,12,13,14,17 için bir veya daha fazla beyin bölgesinin sitomimarisinin ve hücre tipi bileşiminin temel özelliklerini taklit eden üç boyutlu (3D), çok hücreli yapılardır. Bu 3D yapılar ya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) ya da ilgilenilen türler için mevcutsa, embriyonik kök hücrelerden (ESC'ler) üretilir. Genel olarak, kullanılan metodolojiye dayanarak iki tip beyin organoidi ayırt edilebilir: rehbersiz ve bölgeselleştirilmiş (rehberli) beyin organoidleri¹⁸. İkinci tip organoidlerin üretilmesinde, pluripotent kök hücrelerin belirli bir beyin bölgesinin organoidlerine (örneğin, ön beyin organoidleri) farklılaşmasına rehberlik eden küçük moleküller veya faktörler ^sağlanır18. Buna karşılık, kılavuzsuz organoidlerde, farklılaşma küçük moleküllerin eklenmesiyle yönlendirilmez, bunun yerine yalnızca iPSC'lerin / ESC'lerin kendiliğinden farklılaşmasına dayanır. Ortaya çıkan beyin organoidleri, farklı beyin bölgelerini (örneğin, serebral organoidler) temsil eden hücre tiplerinden ^oluşur18. Beyin organoidleri, beyin gelişiminin birçok temel özelliğini, iPSC'lerin veya ESC'lerin mevcut olduğu herhangi bir ilgi türünden nispeten uygun maliyetli ve zaman tasarruflu üretim ile birleştirir^11,12,13,14. Bu, beyin organoidlerini, evrimsel ve gelişimsel sorulardan hastalık modellemesine ve uyuşturucu testine kadar birçok nörobiyolojik çalışma için mükemmel bir model haline getirir^15,16. Bununla birlikte, beyin organoidlerini kullanarak bu tür soruları ele almak, genetik modifikasyon için farklı yöntemlerin mevcudiyetine bağlıdır.

Neokorteks (pato) fizyolojik gelişimini ve evrimini incelemenin kilit yönlerinden biri, genlerin ve gen varyantlarının fonksiyonel analizidir. Bu genellikle (ektopik) ekspresyon ve / veya bu genlerin knock-down (KD) veya knock-out (KO) ile elde edilir. Bu tür genetik modifikasyonlar, kararlı ve geçici genetik modifikasyonlar olarak sınıflandırılabileceği gibi, modifikasyonlar geçici ve mekansal olarak kısıtlanmış veya kısıtlanmamış olarak da sınıflandırılabilir. Kararlı genetik modifikasyon, konakçı genomuna genetik bir değişikliğin girmesiyle tanımlanır ve bu da sonraki tüm hücre nesillerine aktarılır. Genetik modifikasyonun zaman noktasına bağlı olarak, bir organoidin tüm hücrelerini etkileyebilir veya belirli hücre popülasyonlarıyla sınırlı olabilir. En sık olarak, iPSC / ESC seviyesindeki beyin organoidlerinde lentivirüsler, transpozon benzeri sistemler ve CRISPR / Cas9 teknolojisi uygulanarak kararlı genetik modifikasyon elde edilir (örneğin, Fischer ve ark.17, Kyrousi ve ^ark.19 ve Teriyapirom ve ^ark.20 tarafından gözden geçirilmiştir). Bu, beyin organoidinin tüm hücrelerinin genetik modifikasyonu taşıması ve geçici veya mekansal olarak kısıtlanmaması avantajına sahiptir. Bununla birlikte, bu kararlı iPSC / ESC hatlarının oluşturulması ve karakterizasyonu çok zaman alıcıdır, ilk modifiye beyin organoidlerinin analiz edilebilmesi için genellikle birkaç ay sürer (örneğin, Fischer ve ark.17, Kyrousi ve ^ark.19 veya Teriyapirom ve ^ark.20 tarafından gözden geçirilmiştir).

Buna karşılık, geçici genetik modifikasyon, konakçı genomuna entegre olmayan genetik yükün (örneğin, bir gen ekspresyon plazmidi) verilmesiyle tanımlanır. Bu modifikasyon, prensip olarak, sonraki hücre nesillerine aktarılabilirken, teslim edilen genetik kargo, her hücre bölünmesiyle aşamalı olarak seyreltilecektir. Bu nedenle, bu tür genetik modifikasyon genellikle geçici ve mekansal olarak kısıtlanır. Geçici genetik modifikasyon, beyin organoidlerinde adeno ile ilişkili virüsler veya elektroporasyon (örneğin, Fischer ve ark.17, Kyrousi ve ^ark.19 ve Teriyapirom ve ^ark.20 tarafından gözden geçirilmiştir) tarafından gerçekleştirilebilir. Kararlı genetik modifikasyonun aksine, bu yaklaşım çok hızlı ve uygun maliyetlidir. Gerçekten de, elektroporasyon dakikalar içinde gerçekleştirilebilir ve hedef hücre popülasyonlarına bağlı olarak, elektropora organoidler günler içinde analiz için hazırdır (örneğin, Fischer ve ark.17 ve Kyrousi ve ^ark.19 tarafından gözden geçirilmiştir). Bununla birlikte, beyin organoidinin boyut farklılıkları gibi brüt morfolojik değişiklikleri, bu yöntem kullanılarak tespit edilemez, çünkü bu tür genetik modifikasyon geçici ve mekansal olarak kısıtlanır. Bu kısıtlama, örneğin, organoid içindeki bireysel hücre popülasyonlarını veya belirli gelişimsel zaman noktalarında beyin organoidleri üzerindeki etkilerini incelemek durumunda da bir avantaj olabilir (örneğin, Fischer ve ark.17 ve Kyrousi ve ^ark.19 tarafından gözden geçirilmiştir).

Beyin gelişimi ve evrimi sırasında gen fonksiyonunu incelemek için klasik bir yaklaşım in utero elektroporasyondur. In utero elektroporasyon, gen ekspresyon yapılarının kemirgen 21,22,23 ve gelincik ^24,25 beyinlerine verilmesi için iyi bilinen ve kullanışlı bir tekniktir. İlk olarak, ilgilenilen ekspresyon yapılarını içeren bir çözelti, hedeflenecek bölgeye bağlı olarak, uterus duvarından embriyonik beynin belirli bir ventrikülüne mikroenjekte edilir. İkinci adımda, hedeflenen ventrikülü doğrudan kaplayan hücreleri transfekte etmek için elektrik darbeleri uygulanır. Bu yaklaşım sadece ektopik ekspresyon veya genlerin aşırı ekspresyonu ile sınırlı değildir, çünkü KD veya KO çalışmalarında kısa saç tokası (shRNA) veya CRISPR / Cas9 (ekspresyon plazmidleri veya ribonükleoproteinler [RNP'ler] şeklinde) mikroenjeksiyonu ile de uygulanabilir. sırasıyla^26,27. Bununla birlikte, fare, sıçan ve gelincik embriyolarının in utero elektroporasyonu, bu hayvan modelleri için yukarıda tarif edildiği gibi aynı sınırlamalara sahiptir.

İdeal olarak, kişi in utero elektroporasyonunu doğrudan primatlarda gerçekleştirmek ister. Bu, prensip olarak, teknik olarak mümkün olsa da, in utero elektroporasyon, etik kaygılar, yüksek hayvan bakım maliyetleri ve küçük çöp boyutları nedeniyle primatlarda yapılmaz. Büyük maymunlar (insanlar dahil) gibi bazı primatlar için bu hiç mümkün değildir. Bununla birlikte, bu primatlar, insan (pato) fizyolojik neokorteks gelişimi ve evriminin incelenmesi için en büyük potansiyele sahiptir. Bu ikilemin bir çözümü, elektroporasyon tekniğini primat beyin organoidlerine^{uygulamaktır 28}.

Bu yazıda, primat beyin organoidlerinin bir alt tipi olan primat serebral organoidlerinin elektroporasyonu için bir protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşım, organoidlerin ventrikül benzeri yapıları içindeki hücre popülasyonlarının hızlı ve uygun maliyetli genetik modifikasyonuna izin verir. Spesifik olarak, insan (Homo sapiens), şempanze (Pan troglodytes), rhesus makak (Macaca mulatta) ve ortak marmoset (Callithrix jacchus) iPSC'lerinden primat serebral organoidlerinin üretimi için birleşik bir protokol tanımlıyoruz. Ayrıca, mikroenjeksiyon ve elektroporasyon tekniğini ayrıntılı olarak tanımlıyoruz ve primat serebral organoid elektroporasyonunu gerçekleştirmek için "git" ve "gitme" kriterlerini sağlıyoruz. Bu yaklaşım, (pato)fizyolojik neokorteks gelişimini ve evrimini özellikle insan durumuna yakın bir modelde incelemek için etkili bir araçtır.

1. Primat iPSC'lerinin kültürü

NOT: Sağlamlığı nedeniyle, burada sunulan yöntem herhangi bir primat iPSC hattına uygulanabilir. Bu makalede, insan (iLonza2.2)29, şempanze (Sandra A)³⁰, rhesus makak (iRh33.1)²⁹ ve ortak marmoset (cj_160419_5)³¹ iPSC hatlarından serebral organoid üretimi anlatılmaktadır. Kültür koşulları Tablo 1'de özetlenmiştir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. İlgili iPSC'leri kültürlemek için, orijinal olarak tanımlanan kültür koşullarını izleyin. Genel olarak, serebral organoidlerin başarılı bir şekilde üretilmesi ve elektroporasyonu için, 90'dan fazla pasaj için kültürlenmemiş iPSC hatlarını kullanın. Ek olarak, serebral organoid jenerasyonun başlangıcında, iPSC'lerin farklılaşma belirtisi olmadan pluripotens özellikleri sergilediğinden emin olun.

2. Primat iPSC'lerden serebral organoidlerin üretimi

NOT: Serebral organoid üretim protokolü, orijinal serebral organoid protokol 10,34'ün değiştirilmiş bir versiyonu olan^{28,30,32,33'e} dayanmaktadır ve bazı türlere özgü modifikasyonlar yapılmıştır (aşağıda detaylandırılmıştır).

1. Embriyoid cisimleri (EB'ler) üretmek için iPSC'lerin tohumlanması
   1. İPSC'ler% 80-90 akıcılığa ulaştığında, bunları Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) ile yıkayın ve 500 μL rekombinant tripsin ikamesi veya 1 mL proteolitik ve kollajenolitik karışım ekleyin.
      NOT: Tipik olarak, iPSC'ler yaklaşık 900.000 hücre elde etmek için 60 mm'lik bir hücre kültürü kabında kültürlenir, bu da 96 serebral organoid üretmek için yeterlidir. Hücre numaraları, ihtiyaç duyulan organoid sayısına bağlı olarak ayarlanabilir. Üretilen tüm serebral organoidlerin elektroporasyon için uygun olmayabileceğini unutmayın.
   2. Hücreleri ayırmak için çanağı 2 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Kullanılan iPSC hattına veya enzimine bağlı olarak 37 ° C'de 2 dakikaya kadar ek inkübasyon gerekebilir. Hücrelerin ayrılmaya başladığından emin olmak için çanağın mikroskop altında incelenmesi önerilir.
   3. Reaksiyonu durdurmak için 1,5 mL önceden ısıtılmış (37 °C) iPSC kültür ortamı ekleyin ve hücreleri hücre kültürü kabından ayırmak ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için pipeti 7x-10x (10x'ten fazla değil) yukarı ve aşağı doğru pipetleyin.
   4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj edin.
   5. Süpernatanı aspire edin ve peleti 50 μM Y27632 veya 50 μM hayatta kalma yanlısı bileşik ile desteklenmiş 2 mL iPSC kültür ortamında yeniden askıya alın.
   6. Neubauer odası kullanarak hücreleri saymak için hücre süspansiyonunun 10 μL'sini kullanın.
   7. 50 μM Y27632 veya 50 μM hayatta kalma yanlısı bileşik ile desteklenmiş iPSC kültür ortamını kullanarak hücre süspansiyonunu 150 μL (60.000 hücre / mL) başına 9.000 hücre konsantrasyonuna ayarlayın.
   8. Embriyoid cisimleri (EB'ler) üretmek için, ultra düşük bir bağlantı 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna hücre süspansiyonunun 150 μL'sini tohumlayın. Pipetleme yaparken, hücrelerin çökelmesini önlemek için hücre süspansiyonunu içeren tüpü hafifçe sallayın .
   9. EB'leri 37 ° C'de %5 CO₂ ve %95 hava içeren humifiye bir atmosferde kültürleyin (tohumlamadan 0 gün sonra [dps]). EB'leri tohumlamadan sonraki ilk 24 saat içinde rahatsız etmeyin.
      NOT: Marmoset iPSC'lerden üretilen EB'lerin 37 ° C'de hipoksik koşullar altında (% 5 CO 2,% 5_O2 ve% 90 N₂) humifiye bir atmosferde kültürlenmesi gerekir.
   10. ~ 48 saat (2 dps) sonra, ortamı Y27632 / pro-survival bileşiği olmadan iPSC kültür ortamına değiştirin. Kuyucuk başına 100 μL ortamı çıkarın ve Y27632 olmadan 150 μL önceden ısıtılmış (37 ° C) taze ortam ekleyin. Satır satır gidin.
   11. Her geçen gün daha fazla ortam değişikliği yapın; Her bir kuyucuktan 150 μL ortamı çıkarın ve kuyucuk başına Y27632 / hayatta kalma yanlısı bileşik olmadan 150 μL önceden ısıtılmış (37 ° C) taze ortam ekleyin.
       NOT: 4-5 dps'den sonra, EB'lerin çevresi yarı saydam hale gelmelidir.
2. Nöroektoderm indüksiyonu
   NOT: Genel olarak, kaliteli EB'ler bu aşamada pürüzsüz konturlara ve yarı saydam sınırlara sahip olmalıdır. Nöral indüksiyonun zaman noktaları, primat türleri ve iPSC çizgileri arasında biraz farklılık gösterir. Burada kullanılan hücre hatları söz konusu olduğunda (bakınız bölüm 1 ve Malzeme Tablosu), marmoset EB'ler için nöral indüksiyonun genellikle EB'lerin durumuna bağlı olarak 4 dps'de, rhesus makaklar için 5 dps'de ve insan ve şempanze EB'leri için 4-5 dps'de (Şekil 1A) başlatılması gerekir (yukarıya bakınız).
   1. 96 delikli plakanın ilk sırasının her bir kuyucuğundan 150 μL ortamı çıkarın ve aynı sıradaki kuyucuk başına 150 μL önceden ısıtılmış (37 °C) nöral indüksiyon ortamı (bkz. Tablo 2) ekleyin.
   2. 96 delikli plakanın tamamı için ortamı yukarıda açıklandığı gibi satır satır değiştirmeye devam edin. Her bir kuyucuktan 150 μL NIM çıkararak ve 150 μL önceden ısıtılmış (37 °C) taze NIM ekleyerek her gün daha fazla nöral indüksiyon ortamı (NIM) değişikliği gerçekleştirin.
      NOT: Bu noktadan itibaren, marmoset EB'ler diğer primat EB'lerle aynı koşullar altında kültürlenmelidir (37 ° C'de %5 CO₂ ve %95 hava humifiye atmosferi).
3. Bazal membran matrisine gömme
   NOT: EB'ler yüzeyde belirgin, yarı saydam, radyal olarak organize edilmiş bir nöroepitel geliştirdikten sonra, ventrikül benzeri yapıların gelişimi için yapısal destek sağlanmalıdır. Bu, EB'leri bir bazal membran matrisine gömerek elde edilir. Gelişme oranlarındaki farklılıklar nedeniyle, marmoset ve rhesus makak EB'leri zaten 7 dps'de gömülmeye hazırken, insan ve şempanze EB'leri genellikle 8-9 dps'de gömülüdür. Basitlik için, bazal membran matrisi bu protokolde sadece Matrigel'e atıfta bulunur. Bununla birlikte, Geltrex bir yedek olarak kullanılabilir.
   1. Gömmeye hazırlık olarak, UV sterilize makas, forseps, 0.2 mL tüpler için küçük bir raf ve laminer akış davlumbazının altında% 70 (hacim / hacim) etanol ile muamele edilmiş üç ila altı kare parafilm 15 dakika boyunca. Bazal membran matrisinin birkaç saat boyunca buz üzerinde çözülmesine izin verin (~ 1.5 mL bazal membran matrisi genellikle 96 EB için yeterlidir).
      NOT: Bodrum membran matrisini daima buz üzerinde tutun.
   2. Parafilm üzerinde 4 x 4 çukur ızgara oluşturun. Parafilm ızgarasını 0,2 mL'lik tüp rafına kağıt zarflı taraf yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve eldivenli parmağınızı rafın her bir deliğine hafifçe bastırın.
   3. Kağıdı çıkarın ve boyutunu 60 mm'lik bir hücre kültürü kabına sığacak şekilde ayarlamak için makas kullanarak gamze ızgarasını parafilm karesinden kesin. Çukurlu parafilmi, bazal membran matrisi damlacık üretimi için bir temel sağlamak üzere 0,2 mL tüp rafına geri yerleştirin.
   4. Kesilmiş 200 μL pipet ucu olan bir pipet kullanarak, EB'leri birbiri ardına kültür kabının kuyusundan parafilm çukurlarına dikkatlice aktarın.
   5. 16 EB'yi ızgaraya taşıdıktan sonra, yeni bir 200 μL pipet ucu alın ve kalan ortamı çukurlardan çıkarın.
   6. Bir EB içeren her çukurun üzerine bir damla (~15 μL) bazal membran matrisi pipet edin.
   7. 10 μL'lik bir pipet ucu alın ve damlacık sınırlarını bozmadan EB'leri her damlacığın merkezine hızla hareket ettirin.
   8. Çukurlu parafilmi bazal membran matrisi damlalarıyla 60 mm'lik bir hücre kültürü kabına yerleştirin ve matrisin polimerleşmesine izin vermek için 37 ° C'de 15-30 dakika inkübe edin.
   9. Matrise gömülü EB'leri parafilmden ayırmak için, çanağa A vitamini içermeyen 5 mL farklılaşma ortamı (DM ) ekleyin (bakınız Tablo 2) ve parafilm karesini forseps kullanarak baş aşağı çevirin, böylece EB'lerin bulunduğu taraf çanağın dibine bakacak şekilde ters çevirin.
   10. EB'leri içeren bazal membran matrisi damlalarının parafilmden ayrılmasını sağlamak için çanağı dikkatlice çalkalayın. Bazıları hala bağlıysa, forseps kullanarak parafilm karesinin bir kenarını alın ve çanak çanağın merkezine doğru birkaç kez hızla yuvarlayın.
   11. 37 ° C'de% 5 CO₂ ve% 95 hava humifiye bir atmosferde 55 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerindeki serebral organoidleri kültürleyin. Onları her gün orta değişikliklerle A vitamini olmadan DM'de tutun. Nöronların üretimini indüklemek için, marmoset ve rhesus makak serebral organoidleri için 13 dps veya insan ve şempanze serebral organoidleri için 14-15 dps sonra A vitamini (retinoik asit, RA) ile DM'ye geçin (Şekil 1A). Bu noktadan sonra, ortamı her 3-4 günde bir değiştirin.
       NOT: Nöronal sağkalımı desteklemek için, A vitamini içeren DM, 40 dps'den itibaren 20 μg / mL insan nörotrofin 3 (NT3), 20 μg / mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ve 1 μL / mL bazal membran matrisi ile desteklenebilir.

3. Primat serebral organoidlerinin elektroporasyonu

NOT: Teknik açıdan bakıldığında, serebral organoidlerin elektroporasyonu, ventrikül benzeri yapılar mikroenjeksiyonla hedeflenecek kadar telaffuz edilir edilmez gerçekleştirilebilir. Optimal elektroporasyon zaman penceresi, biyolojik soruya ve ilgilenilen hücre popülasyonlarına bağlıdır. Örneğin, apikal progenitörler (AP'ler) ana hedef ise, yaklaşık 30 dps'de serebral organoidler zaten uygundur. Bazal progenitörler (BP'ler) veya nöronlar ana hedefler ise, 50 dps'den daha eski serebral organoidler kullanılmalıdır (örneğin, Fischer ve ^ark.28'e bakınız).

1. Elektroporasyon kurulumunun hazırlanması
   NOT: Elektroporasyon verimliliği, elektroporasyon plazmidlerinin boyutundan ve konsantrasyonundan güçlü bir şekilde etkilenir (ayrıntılar için tartışma bölümüne bakın).
   1. Kontrol ve ilgili gen (GOI) için yeterli miktarda elektroporasyon karışımı hazırlayın, örneğin, her kontrol için 10 μL elektroporasyon karışımı ve GOI, koşul başına yaklaşık 30 serebral organoidi elektroporat etmek için.
      NOT: Elektroporasyon karışımlarının bileşimi için, Tablo 3'e bakınız.
   2. Önceden ısıtılmış (steril olmayan) Dulbecco'nun modifiye Eagle orta / besin karışımı F-12 (DMEM / F12) ve DM, A vitamini ile 37 ° C'ye kadar. Küçük bir spatula ve ince ve normal makas hazırlayın ve aletlere% 70 (hacim / hacim) etanol püskürtün.
      NOT: DM antibiyotik içerdiğinden aşağıdaki adımlar steril veya steril olmayan koşullar altında gerçekleştirilebilir (bkz. Tablo 2). Deneyimlerimize göre, sterilitenin yokluğu hiçbir zaman herhangi bir kontaminasyona neden olmamıştır.
   3. 35 mm'lik hücre kültürü kapları hazırlayın ve Petri çanak elektrot haznesini elektroporatöre bağlayın.
      NOT: Petri çanak elektrot odaları ticari olarak temin edilebilir. Bununla birlikte, uygun maliyetli bir şekilde kolayca üretilebilirler (Ek Dosya 1'e bakınız).
   4. Mikroyükleyici uçlarını kullanarak, mikroenjeksiyon iğnelerini her elektroporasyon karışımından 8 μL ile doldurun. Sabit bir akış elde etmek için ilk kullanımdan önce ince makas kullanarak iğnelerin uçlarını kesin. Bununla birlikte, ucun sadece küçük bir kısmını çıkarın, çünkü künt ve geniş bir uç organoidlere ciddi şekilde zarar verebilir.
      NOT: Mikroenjeksiyon iğneleri ya önceden çekilmiş mikroenjeksiyon iğneleri olarak ticari olarak temin edilebilir ya da bir iğne çektirici mevcutsa laboratuarda çekilebilir. Uzun konik ve 10 μm uç çapına sahip mikroenjeksiyon iğneleri oluşturmak için iğne çektirme makinesinin talimatlarını izleyin.
2. Mikroenjeksiyon ve elektroporasyon
   1. Bir mikroskop altında, pürüzsüz sınırları ve açıkça görülebilen ventrikül benzeri yapıları olan beş serebral organoid seçin. Bunları kesilmiş 1.000 μL pipet ucu kullanarak önceden ısıtılmış (37 °C) DMEM/F12 içeren 35 mm'lik bir hücre kültürü kabına taşıyın.
      NOT: Belirgin ve erişilebilir ventrikül benzeri yapılara sahip serebral organoidleri seçin (bkz. Şekil 1B).
   2. Ventrikül benzeri bir yapı enjekte etmek için, iğneyi dikkatlice duvarından geçirin ve gözle görülür şekilde dolana kadar elektroporasyon karışımı ile demleyin. Patlamalarını önlemek için ventrikül benzeri yapılara aşırı basınç uygulamayın. Bu şekilde her serebral organoidin altı ila sekiz ventrikül benzeri yapısı ile devam edin.
      NOT: Mikroenjeksiyon işlemi sırasında iğne tıkanırsa, ucun hafifçe kesilmesi gerekir.
   3. Bir mikroenjeksiyonlu serebral organoidi Petri çanak elektrot odasına az miktarda DMEM / F12 ile aktarın. Organoidi, mikroenjeksiyonlu ventrikül benzeri yapıların yüzeyleri, elektroporatörün pozitif kutbuna bağlı elektroda bakacak şekilde düzenleyin.
      NOT: Yapıların bu şekilde yönlendirilmesi, hücrelerin ventrikül benzeri yapının bitişik bir yapıdan etkilenmeyen tarafında transfekte edilmesini sağlar.
   4. Aşağıdaki ayarları kullanarak serebral organoidleri birer birer elektroporat edin: 80 V'luk 5 darbe, 50 ms'lik bir nabız süresi ve 1 s'lik bir aralık. Elektropore organoidleri önceden ısıtılmış (37 °C) DMEM/F12 ile doldurulmuş yeni bir 35 mm hücre kültürü kabına taşıyın.
      NOT: Elektroporasyon ayarları kullanılabilir kare dalga elektroporatörüne bağlı olabilir. Bu ayarlar, referans verilen elektroporasyon sistemi için optimize edilmiştir. Voltajın arttırılması, hücrelerin yer değiştirmesine neden olabilir.
   5. İkinci elektroporasyon karışımını (örneğin, GOI) kullanarak sonraki beş serebral organoid ile aynı şekilde devam edin.
      NOT: İstenilen elektropore serebral organoid sayısına ulaşılana kadar 3.2.1-3.2.5 adımlarını tekrarlayın.
   6. Mikroenjeksiyon ve elektroporasyon steril olmayan koşullar altında gerçekleştirildiyse, elektropora organoidleri laminer bir akış başlığı altında steril bir 35 mm hücre kültürü kabına aktarın ve mümkün olduğunca az DMEM / F12'yi yeni hücre kültürü kabına taşıyın.
3. Serebral organoidlerin daha fazla kültürü ve fiksasyonu
   1. DM'deki elektropora organoidleri, 37 ° C'de% 5 CO₂ ve% 95 hava humifiye bir atmosferde 55 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda A vitamini ile kültürleyin.
   2. Elektroporasyondan sonraki ertesi gün, geleneksel bir ters floresan mikroskobu altında başarılı elektroporasyon için serebral organoidleri kontrol edin.
      NOT: Elektroporasyondan sonra ileri kültürün uzunluğuna bağlı olarak, serebral organoid içindeki farklı hücre popülasyonları etkilenir (ayrıca temsili sonuçlar bölümüne bakınız).
   3. Elektroporate serebral organoidleri ilgilenilen biyolojik soruya uygun bir süre boyunca kültürledikten sonra aşağı akış uygulamalarına devam edin.
      NOT: Elektropore serebral organoidler farklı aşağı akış uygulamaları için işlenebilir (örneğin, immünofloresan boyama için fiksasyon veya RNA izolasyonu ve qRT-PCR için snap-frozen için). Burada, elektropore serebral organoidlerin fiksasyonunu tarif ediyoruz.
   4. Elektroporate organoidleri, kesilmiş 1.000 μl pipet ucu kullanarak 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve fazla ortamı çıkarın.
   5. DPBS'ye (pH 7.5) yeterli miktarda% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
      DİKKAT: PFA insan kanserojen olarak sınıflandırılır ve onarılamaz sağlık hasarına neden olabilir. Nitril eldivenler ve gözlükler de dahil olmak üzere ek önlem alınması şiddetle tavsiye edilir.
   6. PFA'yı aspire edin, 5 mL DPBS ekleyin, biraz sallayın ve DPBS'yi aspire edin. Bunu 2 kez tekrarlayın. Organoidleri DPBS'de bir sonraki kullanıma kadar 4 ° C'de saklayın.
      NOT: PFA'ya sabitlenmiş serebral organoidler birkaç ay boyunca 4 ° C'de saklanabildiğinden protokol burada duraklatılabilir. PFA-sabit elektroporlu organoidler, kriyoseksiyon ve immünofloresan boyama^10,28 veya tam montajlı boyama ve temizleme ^35,36 ile analiz edilebilir. Örneğin, görüntüler için temsili sonuçlar bölümüne bakın (antikor ayrıntıları için Tablo 4'e bakın).

Burada açıklanan protokol, insanlar arasında, şempanze, rhesus makak ve ortak marmoset iPSC hatlarından serebral organoidlerin verimli bir şekilde üretilmesini sağlar ve türler arasında minimum zamanlama değişiklikleri yapılır (Şekil 1A). Bu organoidler, ventrikül benzeri yapıların erişilebilirliğine ve ilgilenilen hücre popülasyonlarının bolluğuna bağlı olarak 20 dps ila 50 dps aralığında elektropoize edilebilir. Bununla birlikte, elektroporasyondan önce, serebral organoidlerin elektroporasyon için yeterli kalitede olup olmadığını belirlemek önemlidir.

Elektroporasyon için ideal bir serebral organoid, periferde belirgin parlak ventrikül benzeri yapılar sergilemeli, dejenerasyon belirtisi göstermemeli (örneğin, ayrılan hücreler, genişlemiş apoptotik çekirdek) ve genel olarak kompakt bir sağlıklı morfoloji (örneğin, aşırı büyüme yok) göstermelidir (Şekil 1B, "Git"). Daha fazla sayıda hücreyi hedeflemek için büyük, iyi organize edilmiş, ventrikül benzeri yapılara sahip serebral organoidlerin seçilmesi tercih edilir. Bir organoidin periferik bölgesi karanlıksa ve herhangi bir çıkıntılı yapı göstermiyorsa, kesin mikroenjeksiyonlar görsel ipuçlarının eksikliği nedeniyle tehlikeye girebileceğinden, elektroporasyon için kullanılmaması önerilir (Şekil 1B, "No-go"). Optimal bir serebral organoid morfoloji elde etmek için, nöroektoderm indüksiyonu ve matriks gömme gibi kritik adımların iyi zamanlandığından emin olmak önemlidir. Serebral organoid morfoloji ile ilgili problemler tipik olarak başarısız nöroektoderm ve / veya nöroepitelyal tomurcuk oluşumundan kaynaklanır. Bu normalde nöral indüksiyonun ve / veya bazal membran matrisi gömmesinin yetersiz zamanlamasından kaynaklanır ve bu adımların zamanlamasını ayarlayarak çözülebilir (serebral organoid oluşumu için daha fazla sorun giderme ipucu Lancaster ve Knoblich34'te bulunabilir).

Elektroporasyondan sonra, başarısının ve etkinliğinin ilk değerlendirmesi, transfekte hücrelerin GFP ekspresyonu geleneksel bir ters floresan mikroskobu altında tespit edilebilir hale geldiğinde, 12 saat sonra yapılabilir. İdeal olarak, bu aşamada, çoklu ventrikül benzeri yapılar, yanlarından birine lokalize parlak yeşil floresan yayar (Şekil 2A). Bu, prosedürün yüksek hassasiyetini ve verimliliğini gösterir. Dört farklı primat türünün (yani insan, şempanze, rhesus makak ve ortak marmoset) başarılı bir şekilde elektropoize edilmiş serebral organoidleri, hedeflenen ventrikül benzeri yapılar içinde benzer GFP-pozitif paternler göstermektedir (Şekil 2A). Ayrıca, elektropore primat serebral organoidlerinin fiksasyonu ve kriyoseksiyonundan sonra, dört türün de başarılı bir şekilde elektroporate edilmiş ventrikül benzeri yapıları, radyal olarak organize edilmiş ve yoğun bir şekilde paketlenmiş ventrikül bölgesi (VZ) içinde GFP-pozitif hücrelerin sütunlarını sergiler (Şekil 2B). Elektroporasyondan 2 gün sonra şempanze ve marmoset serebral organoidlerinin bu bölgelerinde GFP-pozitif olan DAPI-pozitif hücrelerin (ölçülen 12 organoidden 17 ventrikül) miktarı, ortalama olarak, hücrelerin yaklaşık üçte birinin (% 33, SD ±% 12) başarılı bir şekilde elektropore edildiğini göstermiştir.

Suboptimal elektroporasyonlar ya ventrikül benzeri yapı içinde az sayıda GFP-pozitif hücre (Şekil 3A) ya da ventrikül benzeri herhangi bir yapıdan uzakta birkaç GFP-pozitif hücre tarafından işaretlenir (Şekil 3B). Düşük sayıda GFP-pozitif hücre, zayıf plazmid alımından kaynaklanır. Bu, yetersiz miktarda mikroenjeksiyonlu elektroporasyon karışımının neden olduğu düşük plazmid konsantrasyonundan veya Petri çanak elektrot odasındaki serebral organoidlerin yetersiz konumlandırılmasından kaynaklanabilecek iyi yönlendirilmemiş elektrik darbelerinden kaynaklanabilir. Herhangi bir ventrikül benzeri yapıdan uzaktaki düşük sayıda GFP-pozitif hücre, kesin olmayan bir mikroenjeksiyon nedeniyle serebral organoid (örneğin nöronlar) içindeki postmitotik hücrelerin elektroporasyonundan kaynaklanır. Bu optimal olmayan elektroporasyonların başka analizlerden dışlanması gerekir.

Serebral organoidlerde bulunan hücre tiplerinin güvenilir bir şekilde tanımlanması, diğer şeylerin yanı sıra, VZ ve SVZ / nöron ile zenginleştirilmiş bölge arasında bir sınır tanımı gerektiren ventrikül benzeri bir yapı içindeki hücre konumuna dayanır. Bu sınır, VZ'nin radyal organizasyonu ve yüksek hücre çekirdeği yoğunluğu özellikleri ile tanımlanabilir ( Ek Şekil S1'deki DAPI boyamasına bakınız). VZ / SVZ sınırının doğrulanması, hemen hemen tüm VZ hücreleri (AP'ler) ve bazı SVZ hücreleri (BP'ler) tarafından eksprese edilen PAX6 veya SOX2 gibi nöral progenitör belirteçleri için immünofloresan boyama ile gerçekleştirilebilir. Nöronla zenginleştirilmiş bir bölgenin varlığı, sınıf III β-tübülin (TUJ1) veya NeuN (Ek Şekil S1) gibi nöronal belirteçler için immünofloresan boyama ile doğrulanabilir.

Elektroporasyon sonrası serebral organoid kültürün süresi biyolojik soruya ve ilgilenilen hücre popülasyonlarına bağlıdır. Yakın tarihli bir çalışmada, elektroporasyondan sonra farklı kültür uzunluklarının, şempanze serebral organoidlerinde, AP'lerden üst katman nöronlara kadar değişen farklı hücre popülasyonlarını etkilediği gösterilmiştir24. Burada, elektroporasyonlu marmoset organoidler için benzer sonuçlar gösteriyoruz. Spesifik olarak, elektroporasyondan 2 gün sonra, GFP-pozitif hücreler neredeyse sadece VZ'de lokalize olur ve ayrıca bu hücrelerin AP'ler veya yenidoğan BP'leri olduğunu gösteren nöral progenitör hücreler için bir belirteç olan PAX6 için pozitiftir (Şekil 4A). Elektroporasyondan sonraki kültür süresi 10 güne uzatılırsa, GFP-pozitif hücreler bazal bölgelerde (yani SVZ ve nöronla zenginleştirilmiş bölge) lokalize olur (Şekil 4B, C). Bu hücreler (GFP sinyaline ek olarak), BP'lerin göstergesi olan PAX6 (Şekil 4B) veya nöronların göstergesi olan NeuN (Şekil 4C) için de pozitif olabilir. İnsan ve rhesus makak, elektroporate serebral organoidler için de benzer sonuçlar elde edilebilir. Özetle, nöronların yanı sıra farklı progenitör tipleri de bu teknikle başarılı bir şekilde hedeflenebilir.

Daha önce gösterilen verilerin neredeyse tamamı, elektropora serebral organoidlerden üretilen histolojik kesitlerin immünoboyamasından elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu organoidleri analiz etmenin bir başka zarif yolu, tüm montajlı immünoboyamayı gerçekleştirmek ve ardından optik temizleme35,36 yapmaktır. Bu, elektropora serebral organoidlerin 3D rekonstrüksiyonunun, GFP-pozitif hücrelerin 3D dağılımı hakkında bir izlenim elde etmesine izin verecektir. Şekil 5 ve Video 1, optik olarak temizlenmiş, elektropora edilmiş bir serebral organoiddeki GFP sinyalinin temsili bir örneğini göstermektedir.

Özetle, burada açıklanan elektroporasyon protokolü, farklı primat iPSC hatlarından türetilen serebral organoidlerin farklı progenitör tiplerine ve nöronlarına geçici genetik modifikasyonları tanıtmak için kesin ve etkili bir yol sağlar.

Şekil 1: Primat serebral organoid üretimine şematik genel bakış ve elektroporasyon için morfolojik "git" ve "gitme" kriterleri. (A) İnsan ve şempanze (mavi), rhesus makak (menekşe) ve marmoset (macenta) için protokol adımlarının farklı zamanlamalarını vurgulayan primat serebral organoid üretimi ve elektroporasyon zaman çizelgesi. Zaman çizelgesinin kronolojisinin ölçeklendirilmemesi gerektiğini unutmayın. (B) Uygun (sol görüntü, Go) ve uygun olmayan (sağ görüntü, No-go) 32 dps insan serebral organoidinin parlak alan görüntüleri. Ok uçları, mikroenjeksiyon için uygun ventrikül benzeri yapıların örneklerini gösterir. Görüntüler, 2.5x hedefe sahip bir Zeiss Axio Observer.Z1 ters floresan mikroskobu kullanılarak elde edildi. Ölçek çubukları = 500 μm. Kısaltmalar: BDNF = beyin kaynaklı nörotrofik faktör; dps = tohumlamadan sonraki günler; NT3 = nörotrofin 3; RA = retinoik asit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Başarılı elektroporasyonlu primat serebral organoid örnekleri . (A) GFP eksprese eden plazmid ile elektroporasyondan 15-48 saat sonra 22 dps insan, 32 dps şempanze, 32 dps rhesus makak ve 31 dps marmoset serebral organoidlerin (yukarıdan aşağıya) parlak alan (sol sütun), floresan (orta sütun) ve birleştirme (sağ sütun) görüntüleri. Siyah ok uçları, bireysel elektroporated ventrikül benzeri yapıların örneklerini gösterir. Görüntüler, 2.5x hedefe sahip bir Zeiss Axio Observer.Z1 ters floresan mikroskobu kullanılarak elde edildi. Ölçek çubukları = 500 μm. (B) GFP (yeşil) için immünofloresan, GFP eksprese eden plazmid ile elektroporasyondan 2-4 gün sonra 32 dps insan, 34 dps şempanze, 32 dps rhesus makak ve 32 dps marmoset serebral organoidlerin (yukarıdan aşağıya) DAPI boyaması (camgöbeği) ile birleştirilmiştir. Açık gri ok uçları, ventrikül benzeri yapılar içindeki elektropore bölgelerin sınırlarını gösterir. Görüntüler, 10x hedefe sahip bir Zeiss LSM 800 konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Ölçek çubukları = 150 μm. Kısaltmalar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; dps = tohumlamadan sonraki günler; GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Başarısız elektroporated primat serebral organoid örnekleri. (A,B) GGP eksprese eden plazmid ile elektroporasyondan 4 gün sonra (A) 34 dps rhesus makak serebral organoidinin DAPI boyaması (camgöbeği) ile kombine GFP (yeşil) ve (B) GFP eksprese eden plazmid ile elektroporasyondan 2 gün sonra 32 dps rhesus makak serebral organoidinin DAPI boyaması (camgöbeği) ile kombine GFP (yeşil) için immünofloresan. Açık gri ok uçları elektroporate hücreleri gösterir. Açık gri kesikli anahat, elektropora hücrelere bitişik ventrikül benzeri bir yapının VZ ve SVZ / nöron ile zenginleştirilmiş bölgesi arasındaki sınırı gösterir. Görüntüler, 10x hedefe sahip bir Zeiss LSM 800 konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Ölçek çubukları = 150 μm. Kısaltmalar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; dps = tohumlamadan sonraki günler; GFP = yeşil floresan proteini; SVZ = subventriküler bölge; VZ = ventriküler bölge. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Elektroporasyon sonrası primat serebral organoidlerinde bulunan çeşitli hücre popülasyonlarının görselleştirilmesi. (A-C) GFP (yeşil) ve PAX6 (A,B; macenta) veya NeuN (C; macenta) için çift immünofloresan, DAPI boyama (camgöbeği) ile kombine edilen tüm vakalarda, GFP eksprese eden plazmid ile elektroporasyondan 2 gün sonra (A) 32 dps marmoset serebral organoid ve GFP eksprese eden plazmid ile elektroporasyondan 10 gün sonra 40 dps marmoset serebral organoid. Açık gri ok uçları (A,B) GFP+ ve PAX6+ veya (C) NeuN+ çift pozitif hücreleri gösterir. Açık gri kesikli çizgiler, VZ ile SVZ / nöron bakımından zenginleştirilmiş bölge arasındaki sınırı gösterir. Görüntüler, 20x hedefe sahip bir Zeiss LSM 800 konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; dps = tohumlamadan sonraki günler; GFP = yeşil floresan proteini; NeuN = nöronal çekirdek proteini; PAX6 = eşleştirilmiş kutu 6 proteini; SVZ = subventriküler bölge; VZ = ventriküler bölge. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Optik temizlemeden sonra elektropora primat serebral organoidlerin 3D konfokal görüntülemesi ile elektropore görüntülerin üç boyutlu rekonstrüksiyonu. GFP eksprese eden plazmid ile elektroporasyondan 2 gün sonra yeniden yapılandırılmış 32 dps insan serebral organoidinin önden (sol görüntü), 45° döndürülmüş (orta görüntü) ve 90° döndürülmüş (sağ görüntü) görünümleri. Görüntülemeden önce, organoid 2Eci yöntem35'e dayanarak optik olarak temizlendi. Tüm elektropora organoidin 3D rekonstrüksiyonu, 10x hedefe sahip bir Zeiss LSM 800 konfokal mikroskop kullanılarak birbirinden 3.73 μm uzakta olan 269 optik bölümden (her biri 1-μM kalınlıkta) üretildi. Görüntüler Fiji kullanılarak 3D rekonstrüksiyon için işlendi. Görüntülerin Video 1'de gösterilen aynı 3D yeniden yapılandırılmış organoidden alındığını unutmayın. Ölçek çubuğu = 500 μm. Kısaltma: GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Optik temizlemeden sonra 3D olarak yeniden yapılandırılmış elektroporlu bir insan serebral organoidi. GFP eksprese eden plazmid ile elektroporasyondan 2 gün sonra 3D olarak yeniden yapılandırılmış 32 dps insan serebral organoidinin videosu. Görüntülemeden önce, organoid 2Eci yöntem35'e dayanarak optik olarak temizlendi. Tüm elektropora organoidin 3D rekonstrüksiyonu, 10x hedefe sahip bir Zeiss LSM 800 konfokal mikroskop kullanılarak birbirinden 3.73 μm uzakta olan 269 optik bölümden (her biri 1-μM kalınlıkta) üretildi. Görüntüler Fiji kullanılarak 3D rekonstrüksiyon için işlendi. Videonun, Şekil 5'te gösterilen aynı 3D yeniden yapılandırılmış organoidden alındığını unutmayın. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.