Method Article

İnsan Periferik Kanı Mononükleer Kaynaklı Makrofajlar İçinde Trichoderma stromaticum Conidia'nın Canlılık Testi

DOI:

10.3791/65231

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mantar konidiasının makrofajlar tarafından fagositozunu içeren teknik, mantarlara karşı immün yanıtların modülasyonunu değerlendiren çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makalenin amacı, Trichoderma stromaticum conidia ile uyarılan insan periferik kan mononükleer kaynaklı makrofajların fagositoz ve klirens yeteneklerini değerlendirmek için bir yöntem sunmaktır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofajlar çok önemli bir savunma hattını temsil eder ve farklı dokularda patojenlerin büyümesini ve kolonizasyonunu önlemekten sorumludur. Konidyal fagositoz, makrofaj-patojen etkileşimlerinde yer alan sitoplazmik ve moleküler olayların araştırılmasına ve ayrıca içselleştirilmiş konidiaların ölüm zamanının belirlenmesine izin veren anahtar bir süreçtir. Mantar konidiasının makrofajlar tarafından fagositozunu içeren teknik, mantarlara karşı immün yanıtların modülasyonunu değerlendiren çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Fagositozdan kaçınma ve fagozomlardan kaçış mantar virülansının mekanizmalarıdır. Burada, biyokontrol ve biyogübre ajanı olarak kullanılan ve insan enfeksiyonlarını indükleyebilen bir mantar olan T. stromaticum conidia'nın fagositozu, klirensi ve canlılığının analizi için kullanılabilecek yöntemleri bildiriyoruz. Protokol şunlardan oluşur: 1) Trichoderma kültürü, 2) konidia elde etmek için yıkama, 3) polisakaroz çözelti yöntemi kullanılarak periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) izolasyonu ve PBMC'lerin makrofajlara farklılaşması, 4) yuvarlak cam lameller ve renklendirme kullanılarak bir in vitro fagositoz yöntemi ve 5) conidia fagositozundan sonra conidia canlılığını değerlendirmek için bir klirens testi. Özetle, bu teknikler makrofajların mantar temizleme etkinliğini ölçmek için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trichoderma cinsi (Sipariş: Hypocreales, Aile: Hypocreaceae), diğer mantar türlerinin parazitleri olan ve ticari olarak yararlı bir dizi enzim üretebilen her yerde bulunan, saprofitik mantarlardan oluşur1. Bu mantar türleri, heterolog proteinlerin2 üretiminde, selüloz3, etanol, bira, şarap ve kağıt4 üretiminde, tekstil endüstrisinde5, gıda endüstrisinde6 ve tarımda biyolojik kontrol ajanlarıolarak 7,8 kullanılmaktadır. Bu mantar türlerine olan endüstriyel ilgiye ek olarak, insanlarda artan enfeksiyon sayısı, bazı Trichoderma türlerine fırsatçı patojenlerin statüsünü vermiştir9.

Trichoderma spp. kültürde hızla büyür, başlangıçta yeşilimsi sarıdan koyu yeşile dönüşen beyaz ve pamuksu kolonilerbulunur 10. Çok çeşitli pH ve sıcaklık koşullarında yaşamaya adapte olmuşlardır ve fırsatçı türler fizyolojik pH ve sıcaklıklarda hayatta kalabilir ve böylece farklı insan dokularını kolonize edebilir 11,12,13. Daha da önemlisi, enfeksiyon oranındaki artış Trichoderma spp. virülans faktörleri ile ilişkili olabilir ve bunlar iyi çalışılmamıştır. Ek olarak, fırsatçı Trichoderma türlerine karşı bağışıklık tepkisini anlamaya odaklanan çalışmalar hala nadirdir.

Bir enfeksiyon sırasında, nötrofillerle birlikte, makrofajlar fagositozdan sorumlu savunma hattını temsil eder ve böylece farklı dokularda patojenlerin büyümesini ve kolonizasyonunu önler. Toll benzeri reseptörler ve C-tipi lektin reseptörleri, makrofajlar fagositoz mantarları gibi örüntü tanıma reseptörlerini kullanarak ve bunları fagolizozomlara işler, böylece solunum patlamasını, proinflamatuar sitokinlerin salınımını ve fagositozlu mikroorganizmaların yok edilmesini teşvik eder14. Bununla birlikte, fagositoz mekanizması, mantar hücrelerinin boyutu ve şekli gibi farklı mikrobiyal stratejilerden etkilenebilir ve önlenebilir; fagositozu engelleyen kapsüllerin varlığı; fagositozu indükleyen reseptörlerin sayısını azaltmak; sitoplazmadaki aktin liflerinin yapısının yeniden şekillenmesi; psödopodia oluşumunu engellemek; ve fagositoz işleminden sonra fagozom veya fagolizozom kaçar14.

Cryptococcus neoformans da dahil olmak üzere birçok patojen, konakçıda hayatta kalmak, yayılmak ve enfeksiyonu indüklemek için makrofajları bir niş olarak kullanır15. Fagositoz ve klirens testi, patojenlere karşı bağışıklık tepkisini değerlendirmek ve doğuştan gelen bağışıklık sisteminden kaçmak için kullanılan mikrobiyal stratejileri belirlemek için kullanılır 15,16,17. Bu tür bir teknik, fagositozun diferansiyel kinetiğini, gecikmiş fagozom asitlenmesini ve mantar öldürmesinin azalmasına neden olan oksidatif patlamayı incelemek için de kullanılabilir18.

Fagositoz, mantar sağkalımı ve fagozom olgunlaşma sürecinden kaçınmayı değerlendirmek için farklı yöntemler kullanılabilir. Bunlar arasında fagositozu, hücresel konumu ve fagositoz19 sırasında üretilen molekülleri gözlemlemek için kullanılan floresan mikroskobu; fagositoz hakkında nicel veriler sağlayan ve sürece dahil olan farklı belirteçleri değerlendirmek için kullanılan akış sitometrisi20,21; mikrobiyal yakalama ve fagozom olgunlaşmasını değerlendirmek için kullanılan intravital mikroskopi22; bir patojen23 için fagositoz sürecinin özgüllüğünü değerlendirmek için kullanılan antikor aracılı fagositoz; ve diğerleri 24,25,26,27.

Burada sunulan protokol, fagositozu ve mantar konidiasının öldürülmesini değerlendirmek için bir optik mikroskop ve plaka büyüme testi kullanan yaygın, düşük maliyetli ve doğrudan bir yöntem kullanır. Bu protokol, okuyuculara, T. stromaticum'a maruz kalan insan periferik kan mononükleer türevli makrofajları kullanarak fagositoz ve klirens testini gerçekleştirmek için adım adım talimatlar sağlayacaktır. PBMC'ler kullanıldı çünkü Trichoderma conidia, fitopatojenlere karşı bir biyokontrol ve dünya çapında bitki bitkileri için bir biyogübre olarak uygulandı ve Trichodermosis adı verilen çeşitli insan enfeksiyonlarına neden oldu. Bunun yanı sıra, Trichoderma conidia ile insan bağışıklık sistemi arasındaki etkileşime odaklanan, makrofajlardanötrofilleri 28 ve otofajları29 incelediğimiz sadece iki çalışma var. Bu makale ilk olarak PBMC'den türetilen makrofajlar tarafından T. stromaticum konidiasının fagositozunun nasıl incelenebileceğini ve daha sonra yutulan konidianın canlılığının basit mikroskopi tabanlı teknikler kullanılarak nasıl değerlendirilebileceğini göstermektedir. Bu protokol, makrofajla ilişkili immün yanıt veya immün sistem modülasyonu ile ilgili mekanizmalar hakkındaki araştırmaları daha da kolaylaştırabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik hususlar ve insan denekler
Bu çalışmada açıklanan insanlarla yapılan tüm deneyler, Helsinki Bildirgesi ve Brezilya Federal yasalarına göre gerçekleştirilmiş ve Santa Cruz Eyalet Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (proje tanımlama kodu: 550.382 / 2014).

İnsan periferik kanı, Brezilya'nın Bahia kentindeki Ilhéus şehrinden, incelenen mantarla ilgili mesleki faaliyetlere maruz kalmayan sağlıklı gönüllülerden toplandı. Bildirilen sağlık tıbbi durumları olan veya ilaç kullanan kişiler hariç tutuldu. Tüm denekler gönüllü olarak katılmayı kabul etti ve bu çalışmaya dahil edilmeden önce bilgilendirilmiş bir onam formu imzaladı.

1. Reaktiflerin ve çözeltilerin hazırlanması

NOT: Devam etmeden önce aşağıdaki reaktifleri ve çözeltileri hazırlayın. Reaktif ve malzeme tedarikçisi bilgileri için Malzeme Tablosuna (TOM) bakın.

  1. Dengeli bir steril fosfat tamponlu salin çözeltisi 1x (PBS) hazırlayın.
    NOT: Bu protokolde endotoksin içermeyen PBS kullanılmamıştır.
  2. Patates dekstroz agar (PDA) ortamı hazırlayın ve T. stromaticum kültürü için her Petri kabına 20 mL dökün. Her donör için PDA'lı altı plaka hazırlayın ve her koşul için bir plaka kullanın: 3 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat ve 120 saat. Ek olarak, her kontrol için üç plaka kullanın: Trichoderma kontrolü için üç ve R10 orta kontrolü için üç. Optimum conidia geri kazanımı için 60 mm x 15 mm veya 100 mm x 15 mm'lik petri kapları kullanın.
  3. % 100 gliserol sterilize edin.
  4. Hücre kültürü için bir R10 besiyeri hazırlayın:% 10 fetal sığır serumu,% 1 antibiyotik (penisilin/streptomisin) ile desteklenmiş RPMI ortamı.
  5. Hücre lizizi için damıtılmış suyu sterilize edin.
  6. Renklendirme işlemi için pH 7.0'da su hazırlayın.
    NOT: Gerekirse, bir pH metre ve 0,1 M/L NaOH ve 0,1 M/L HCl çözeltileri kullanarak pH'ı ayarlayın.
  7. Yuvarlak cam lamel (13 mm) ve cımbızı sterilize edin.

2. Trichoderma stromaticum kültürü ve işlenmesi

  1. T. stromaticum'un ana stoğunun (M1) hazırlanması:
    NOT: Tüm deneylerin aynı taze neslin (F1) kültüründen yapıldığından emin olmak için bir ana stok (M1) gereklidir.
    1. Bir T. stromaticum inoculum'u PDA ile Petri kaplarında 28 ° C'de karanlıkta 7-10 gün boyunca conidia gözlenene ve kültür yeşile dönene kadar büyütün.
    2. T. stromaticum kültürünü yıkayın. Bir pipet kullanarak kültür yüzeyine 3-5 mL PBS ekleyin. PBS'yi plakadan toplayın ve pipeti kullanarak conidia'yı kademeli olarak çıkarmak için tekrar kültürün üzerine dağıtın. Süspansiyon koyu yeşile dönene kadar bu işlemi gerektiği kadar tekrarlayın.
      NOT: Alternatif olarak, plakaya 3-5 mL PBS eklenerek kültürün nazikçe yıkanması ve ardından conidia'yı geri kazanmak için süspansiyon yeşile dönene kadar dairesel bir hareket yapılması önerilir. Tekrarlanan pipetleme ile daha fazla conidia toplanabilir.
    3. Geri kazanılan süspansiyonu plakadan bir pipetle 15 mL'lik steril bir tüpe aktarın. Daha fazla conidia elde etmek için 2.1.2-2.1.3 adımlarını gerektiği kadar tekrarlayın.
    4. Süspansiyonu 12 ° C'de 5 dakika boyunca 1.160 x g'da santrifüjleyin ve peleti 5 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Hif içermeyen bir süspansiyon elde etmek için bu adımı (2.1.4) üç kez tekrarlayın.
      NOT: Peletleri düzgün bir şekilde yeniden süspanse etmek için, santrifüjlemeden sonra, kısa vorteksleme önerilir.
    5. Son peleti 2-3 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve 1:100 veya 1:1.000'lik bir seyreltme kullanarak bir Neubauer haznesindeki conidia'yı sayın.
      NOT: Optimum koşullarda, kültürden 2 x 108 conidia/mL'lik bir nihai konsantrasyon geri kazanılabilir. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak conidia canlılığının değerlendirilmesi isteğe bağlıdır.
    6. Her tüpe 0,5 mL conidia süspansiyonu (adım 2.1.5'ten itibaren) ekleyerek süspansiyonu 1,5 mL steril tüplere ayırın. Ardından, M1 stokları elde etmek için 0,5 mL steril 0 gliserol ekleyin. Kısaca vorteks, tüpleri tanımlayın ve −20 °C veya −80 °C'de saklayın.
  2. T. stromaticum kültürü ve deney için conidia elde edilmesi
    1. M1 süspansiyonunun 10 μL plakası (adım 2.1'de hazırlanmıştır) PDA'da 28 °C'de karanlıkta 7-10 gün boyunca conidia gözlenene ve kültür taze F1 neslini elde etmek için yeşile dönene kadar.
      NOT: Deney için taze bir T. stromaticum kültürü sağlamak için, mantar büyümesi için gereken süreyi ve makrofaj farklılaşması için gereken süreyi değerlendirin.
    2. 2.1.2-2.1.4 adımlarını tekrarlayarak conidia'yı toplayın.
    3. Son peleti 2-3 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak conidia canlılığını değerlendirin veya conidia'yı adım 2.1.5'te belirtildiği gibi sayın.

3. Periferik kan mononükleer hücre (PBMC) izolasyonu

NOT: PBMC'ler, yoğunluğu 1.077 g/mL30 olan bir polisakroz çözeltisi kullanılarak yoğunluk bariyeri yöntemiyle elde edilir.

  1. Toplanacak her donör numunesi için 15 mL polisakaroz solüsyonunu 50 mL'lik bir tüpe alın.
  2. Üç ila dört EDTA tüpü kullanarak her donörden 20 mL kan toplayın. Deney başına en az dört bağışçı toplayın. Bağışçıların kanını bir araya getirmeyin; Bunun yerine, her numuneyi biyolojik bir kopya olarak ayrı ayrı kullanın. Her donör için, kanı 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 35 mL'lik bir son hacim elde etmek için PBS ekleyin.
  3. Bifazik bir süspansiyon oluşturmak için kan süspansiyonunu (adım 3.2) polisakroz solüsyonunu (adım 3.1) içeren tüpün duvarı boyunca yavaşça aktarın.
    NOT: Kanın polisakaroz çözeltisine karışmasını önlemek için kanı yavaşça ekleyin. PBMC izolasyonu için her donörden en az 7 mL kan kullanılması önerilir.
  4. Bifazik süspansiyonu içeren tüpü hemen 1.600 x g'da 24 °C'de 30 dakika santrifüjleyin. PBMC'lerin santrifüjlenmesini programlayın: santrifüjlemenin aniden durmasını önlemek için hızlanma 1 ve yavaşlama 0'ı kullanın.
  5. Santrifüjlemeden sonra PBMC'leri içeren beyaz bir halkanın oluşumunu gözlemleyin. Kırmızı kan hücreleri ve granülositler alt tabakada bulunur, bir sonraki tabaka polisakaroz çözeltisini içerir ve PBMC'ler polisakaroz çözeltisi ile plazma (üst tabaka) arasındaki beyaz halkada bulunur. Kırmızı kan hücrelerini, plazmayı veya polisakaroz çözeltisini yakalamamak için bir pipet veya steril bir Pasteur pipeti kullanarak hafifçe aspire ederek beyaz halkayı toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  6. 10 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için PBMC'leri içeren 15 mL'lik tüpe PBS ekleyin. Süspansiyonu homojenize edin ve tüpü 24 °C'de 30 dakika boyunca 1.600 x g'da santrifüjleyin.
  7. Hücreleri 10 mL PBS ile 24 ° C'de 5 dakika boyunca 1.600 x g'da üç kez yıkayın. Daha sonra, son peleti 2 mL R10 ortamında yeniden süspanse edin.
  8. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücre canlılığını değerlendirin ve bir Neubauer odasındaki hücreleri sayın.

4. Fagositoz kinetiği

NOT: İnsan periferik kan mononükleer kaynaklı makrofajlar, kontrol olarak 1:10 veya sadece R10 besiyerinde çok sayıda enfeksiyonda (MOI) T . stromaticum conidia ile tedavi edilir. Enfeksiyon çokluğu (MOI), enfeksiyon hedeflerine eklenen enfeksiyöz ajanların oranını temsil eder ve mutlak sayılar olarak sunulur: MOI = ajanlar:hedefler31. Burada 10 makrofaj (hedef) için 1 T. stromaticum conidia (ajan) kullanıyoruz. Daha sonra hücreler 37 °C ve %5CO2'de farklı sürelerde (3 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat ve 120 saat) inkübe edilir. Daha sonra, fagositoz sürecinde yer alan yapışkan makrofajları mikroskop altında görselleştirmek için yuvarlak bir cam lamel kullanılır. Deneysel bir tasarım figürü sağlanmıştır (Şekil 1).

NOT: 24 oyuklu plakaların kullanılması önerilir.

  1. İnsan kaynaklı makrofajların T. stromaticum conidia ile tedavisi
    1. Steril cımbız kullanarak her oyuğa steril yuvarlak bir cam lamel (13 mm) ekleyin.
    2. 3.7-3.8 adımlarında elde edilen hücre süspansiyonunun hacmini, oyuk başına 8 x 105 hücreye R10 ortamı ile 1 mL'lik bir nihai hacme ayarlayın. Hücre morfolojisini değerlendirmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın.
      NOT: Hücreler ortamda asılı olmalı ve yuvarlak bir morfolojiye sahip olmalıdır.
    3. Hücreleri 7 gün boyunca% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C'de inkübe edin ve monositlerin makrofajlara farklılaşması için ortamı her 2 günde bir taze R10 ortamı ile değiştirin32. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücre morfolojisini gözlemleyin. Makrofajlar, düzleştirilmiş ve genişletilmiş şekillerle iğ morfolojisi sunacaktır; artmış bir sitoplazmatik oran ve psödopodia varlığı da gözlenebilir. Yapışık mononükleer türevli makrofajları arayın.
      NOT: Farklılaşmamış monositlerin çok küçük bir kısmı ortamda asılı kalabilir.
    4. Bir pipet kullanarak her bir kuyucuğun ortamını çıkarın ve kalıntıları ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın.
    5. R10 ortamında 8 x 104 conidia/mL nihai konsantrasyonda yeni bir T. stromaticum conidia süspansiyonu hazırlamak için adım 2.2'de hazırlanan süspansiyonu kullanın.
    6. 1:10'luk bir MOI elde etmek için her bir işlem kuyucuğuna (3 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat ve 120 saat) adım 4.1.5'te hazırlanan 1 mL conidia süspansiyonu ekleyin. Kontrollere, kuyuya sadece 1 mL R10 ortamı ekleyin.
    7. Makrofajlara 3 saat boyunca T. stromaticum conidia 37 ° C'de% 5 CO2 atmosferi altında meydan okuyun. 3 saat sonra, ortamı çıkarın ve fagositozlu olmayan conidia'yı çıkarmak için hücreleri yıkayın.
    8. Her kuyucuğa 1 mL R10 ortamı ekleyin ve plakayı farklı sürelerde (3 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat ve 120 saat) 37 ° C'de% 5 CO2 atmosferi altında inkübe edin.
  2. Renklendirme ve analiz
    1. İlgili inkübasyon (adım 4.1.8) tamamlandıktan sonra ortamı her bir kuyucuktan çıkarın ve o kuyucuğa 1 mL PBS ekleyin.
    2. Steril cımbız ve boyama kiti ile renklendirmek için bir iğne kullanarak yuvarlak cam lamelleri kuyulardan çıkarın.
      NOT: Alternatif olarak, May Grünwald-Giemsa boyası33 kullanılarak boyama yapılabilir.
    3. Yuvarlak cam lamellerin her birine, boyama kitinin bileşenleri olan leke sabitleyici (5 s), Boya 1 (5 s), Boya 2 (2 s) ve tamponlanmış su pH 7.0 (5 s) ekleyin. Kuruyana kadar bekleyin ve lamelleri montaj maddesi kullanarak bir cam kızak üzerine sabitleyin.
    4. Sonucu ölçün: Her zaman koşulu için toplam 100 makrofaj (Mø) sayın. Optik bir mikroskop kullanarak, 100x objektif ve daldırma yağı kullanarak fagositozlu conidia ile makrofajların sayısını sayın (denklem [1]).
      figure-protocol-1 (1)
    5. Makrofaj başına konidia fagositoz sayısını elde edin: 100 makrofajda bulunan conidia'yı makrofaj sayısına en az bir fagositozlu konidyum ile ilişkilendirin (denklem [2])34.
      figure-protocol-2 (2)
      NOT: Conidia'yı değerlendirmek ve saymak için ImageJ yazılımıkullanılabilir 35.
    6. Sonuçları sunmak için 40x ve 100x objektif kullanarak her numune ve zaman koşulundan fagositozu fotoğraflayın.

figure-protocol-3
Şekil 1: İnsan periferik kan mononükleer türevli makrofajları kullanarak fagositoz ve konidiyal canlılık testinin şematik gösterimi. (1-10) Fagositoz testi: T. stromaticum PDA'da büyütülmeli ve konidia, plakanın PBS ile yıkanmasıyla geri kazanılır. PBMC'ler, tarif edilen protokol kullanılarak yoğunluk bariyeri yöntemi ile izole edilmeli, makrofajlara farklılaşmak için 7 gün boyunca steril yuvarlak cam lameller ile 24 oyuklu plakalarda kültürlenmeli ve daha sonra farklı zaman aralıklarında 1:10'luk bir MOI ile muamele edilmelidir. Yuvarlak cam lameller çıkarılarak boyama kiti ile boyanır ve sonuçlar ışık mikroskobu kullanılarak analiz edilir. (1-8,11-13) Conidia canlılık testi: İzolasyondan sonra, PBMC'ler, makrofajlara farklılaşmak için 7 gün boyunca yuvarlak cam lameller olmadan 24 oyuklu plakalarda kültürlenir ve daha sonra farklı zaman aralıkları için 1:10'luk bir MOI ile muamele edilir. Hücreler damıtılmış su ile inkübasyon yoluyla parçalanmalıdır; süspansiyon daha sonra santrifüjlenir ve daha sonra yeniden süspanse edilen pelet, Trichoderma'nın büyüme kinetiğini analiz etmek için PDA'da kaplanır. Bu şekil, bir görüntü veritabanı kullanılarak tasarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Fagositoz sonrası konidiyal canlılık deneyi

NOT: Deneysel bir tasarım figürü sağlanmıştır (Şekil 1).

NOT: 24 oyuklu plakalar kullanın.

  1. İnsan kaynaklı makrofajlara T. stromaticum conidia ile meydan okuyun.
    1. Monositleri ayırt etmek için 4.1.2-4.1.8 adımlarını tekrarlayın ve makrofajları T. stromaticum conidia ile tedavi edin.
      NOT: Kuyularda yuvarlak cam lameller kullanmayınız. Fagositoz kinetiğini test etmek için kullanılan aynı zaman aralıklarını kullanın, böylece fagositoz konidiyal canlılık ile ilişkilendirilebilir.
    2. R10 ortamının T. stromaticum büyümesi üzerindeki etkisini, adım 4.1.5'te (R10 ortamı + conidia) kontrol olarak hazırlanan süspansiyonlu kuyucukları kullanarak değerlendirin.
  2. Konidiyal canlılık testi
    1. Her inkübasyon periyodundan sonra (3 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat ve 120 saat) ortamı çıkarın ve fagositozlanmamış conidia'yı çıkarmak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
      NOT: R10 medium + conidia içeren kumanda yıkanmamalıdır.
    2. Her kuyucuğa 0,5 mL steril damıtılmış su ekleyin ve plakayı 37 °C ve %5CO2'de 30 dakika inkübe edin. Bu süreden sonra, hücrelerin parçalandığından emin olmak için hücre morfolojisini ters mikroskop altında gözlemleyin.
    3. Süspansiyonu toplayın ve 1,5 mL'lik tüplere aktarın. Süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 6.000 x g'da bir mini santrifüj kullanarak santrifüjleyin.
    4. Süpernatanı dikkatlice atın, peleti 10 μL steril damıtılmış suda yeniden süspanse edin ve 10 μL süspansiyonu karanlıkta 28 °C'de PDA içeren plakaya aşılayın.
    5. T. stromaticum büyümesi için pozitif bir kontrol hazırlayın: 8 x 106 conidia/mL nihai konsantrasyona sahip yeni bir süspansiyon hazırlamak için T. stromaticum conidia süspansiyonunu (adım 2.2) kullanın. Bu süspansiyonun plakası 10 μL, karanlıkta 28 ° C'de PDA'da.
      NOT: Bu süspansiyonun 10 μL'si, kandaki mononükleer türevli makrofajları enfekte etmek için kullanılan aynı sayıda conidia (8 x 104) içerecektir. Bu pozitif kontrol ile adım 5.1.2'de bahsedilen kontrol arasındaki fark, yukarıda adım 5.1.2'de bahsedilen kontrolün, fagositoz sırasında R10 ortamının Trichoderma büyümesi üzerindeki olası etkisini değerlendirmek için kullanılmasıdır. PBS'de toplanan T. stromaticum conidia'nın süspansiyonunu kullanan adım 5.2.5'teki bu pozitif kontrol, mantarın doğal olarak nasıl büyüdüğünü yansıtmak için R10 ortamının etkisi olmadan Trichoderma büyümesi için bir kontrolü temsil eder. Bu kontrolü kullanarak, R10 ortamının Trichoderma büyümesini etkileyip etkilemediğini değerlendirmek mümkündür.
    6. Her gün PDA'da T. stromaticum'un büyüme kinetiğini gözlemleyin ve kültürü fotoğraflayın.
    7. Analiz: Sonuçları değerlendirmek için iki nokta kullanılabilir: 1) kültürün tüm kültür plakasını kaplaması için gereken süre (gün olarak) ve 2) kültürde T. stromaticum conidia'nın karakteristik yeşil pigmentasyonunun ortaya çıkmasına kadar geçen süre (gün olarak).

6. İstatistiksel analiz

  1. 8 grup/tedavi arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları belirlemek için bir Kruskal-Wallis testi kullanın. p < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin. Tüm veriler standart sapma (SD) ± ortalamalar olarak sunulmaktadır. Şekillerde, # p < 0.05'te istatistiksel anlamlılığı gösterir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mantar konidiasının makrofajlar tarafından fagositozunu içeren teknik, mantarlara karşı immün yanıtların modülasyonunu değerlendiren çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Fagositozdan kaçınma ve fagozomların kaçışı mantar virülansının mekanizmaları olduğundan, fagositozdan sonra conidia'nın canlılığını değerlendirmek için T. stromaticum conidia'nın fagositozunu kullandık. Araştırmacılar, klinik açıdan ilgi çekici bir türü araştırırken bu teknikleri ilk tahlillerden biri olarak uygulamalıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans ve diğerleri dahil olmak üzere çeşitli mantar patojenleri için, konidiyal veya maya fagositozu, makrofaj-patojen etkileşimlerinde sitoplazmik ve moleküler olayların araştırılmasına ve ayrıca içselleştirilmiş conidia'nın ölüm zamanının belirlenmesine izin veren anahtar bir süreçtir 14,39,40. Fagositoz, Trichoderma-host etkileşimindeki anahta...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmez.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma aşağıdaki Brezilya finansman kurumları tarafından desteklenmiştir: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) RED0011/2012 ve RED008/2014 hibeleriyle. U.R.S., J.O.C. ve M.E.S.M. sırasıyla Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ve FAPESB tarafından verilen bursu kabul eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL santrifüj tüpleriCorningCLS43147015 mL santrifüj tüpleri, polipropilen, kapaklı konik tabanlı, ayrı ayrı steril
24 Kuyulu Düz Tabanlı Hücre Kültürü PlakasıKasviK12-024Alfanümerik tanımlamalı polistirenden yapılmıştır; Hücre Kültürü Plakası DNaz, RNaz ve pirojen içermez ve sitotoksik maddeler içermez; Gama radyasyonu ile sterilize edilmiştir;
Hücre kültürü CO2 inkübatörüSanyo303082Bir CO2 inkübatörü, insan vücuduna benzer koşullar yaratmaya ve kontrol etmeye hizmet eder, böylece farklı hücre tiplerinin in vitro büyümesine ve çoğalmasına izin verir.
Santrifüj Mikrotüp (eppendorf tipi) 1,5 mLCapp5101500Polipropilenden yapılmıştır ve tek elle açıp kapatmak için tüpe bağlı bir kapak vardır. DNase, RNase ve Pirojen içermediği için protein yapışmasına karşı ve numune görünürlüğü için cilalı bir iç kısma sahiptir
Dairesel lamel 15 mmOlenK5-0015Hücre kültüründe mikroskopi teknikleri için dairesel lameller kullanılmaktadır. Süper şeffaf yarı saydam camdan yapılmıştır; 0,13 mm kalınlığında
Sınıf II Tip B2 (Toplam Egzoz) Biyogüvenlik KabinleriEsco Lifesciences grubu2010274Airstream Sınıf II Tip B2 Biyogüvenlik Kabinleri (AB2) ürün, operatör ve çevre koruması sağlar ve eser miktarda toksik kimyasallar ve biyolojik güvenlik seviyeleri I, II veya III'e atanmış ajanlarla çalışmaya uygundur. Sınıf II Tip B2 kabinde, tüm giriş ve çıkış havası, HEPA / ULPA filtrasyonundan sonra çalışma yüzeyi boyunca devridaim olmaksızın dış ortama atılır.
Dekstroz Patates Agar ortamıMerck145Patates Dekstroz Agar, maya ve mantarların yetiştirilmesinde ve sayımında kullanılır,
EDTA vakumlu kan alma tüpüFirstLabFL5-1109LEDTA, hücre morfolojisini korumak için en iyi antikoagülan olduğu için hematoloji rutinleri için önerilen antikoagülandır.
EntellanMerck1.07961 Fiksatif ajan; Entellan, mikroskopi için kalıcı montaj için susuz bir montaj ortamıdır.
Fetal Sığır SerumuGibcoA2720801Fetal sığır serumu (FBS) a  Hücre ve doku kültürü ortamının evrensel büyüme takviyesi. FBS, hücre bağlanması, büyümesi ve çoğalması için gerekli faktörlerin çoğunun doğal bir kokteylidir ve çoğu insan ve hayvan (böcek dahil) hücresi türü için etkilidir.
Flaticon  görüntü veritabanı
GlycerolMerck24900988Kriyoprotektan ajan gliserol, hücreleri ve sporları dondurmak için kullanılır
Histopaque-1077polisakroz çözeltisi
Resim: J  Görüntü analiz yazılımı
Mikroskopi slaytlarıMikroskopi için Precision7105Slayt, 26 x 76 mm, Mat Bindirmeli Kalınlık: 1,0 ila 1,2 mm. Özel optik camdan yapılmıştır ve kusurlardan arındırılmış yüksek kaliteli şeffaflığa sahip ipek kağıt bölücü ile paketlenmiştir
Mini santrifüjPrizmaC1801Prism Mini Santrifüj, son derece küçük bir ayak izi ile son derece kompakt olacak şekilde tasarlanmıştır. 6000 rpm'ye kadar dönen 2 adet değiştirilebilir hızlı açılan rotor içerir. Elektronik fren hızlı yavaşlama sağlar ve kendiliğinden açılan kapak, numuneye kolay erişim sağlayarak kullanım süresini azaltır.
Neubauer odasıKasviK5-0011Neubauer Sayma Odası, hücreleri veya diğer asılı parçacıkları saymak için kullanılır.
Panoptik hızlı Laborclin620529Laborclin's  panoptik hızlı c, hematolojide hızlı boyama için bir kittir
Penisilin / Streptomisin Çözeltisi - 10.000ULGC- Biyoteknoloji BR3011001antibiyotik, laminer akışın dışındaki manipülasyon ile olası kontaminasyonu önlemek için kullanılır.
Petri kabı 90 x 15 mm PürüzsüzCralplast18248Tek kullanımlık Petri kabı; Son derece şeffaf polistirenden (PS) yapılmıştır; düz dipli; Düz; Boyut: 90 x 15 mm.
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)thermo fisher Scientific10010001PBS, basit bir formülasyona sahip su bazlı bir tuzlu su çözeltisidir. İzotoniktir ve çoğu hücre için toksik değildir. Sodyum klorür ve fosfat tamponu içerir ve canlı hücrelerin su dengesini korurken ozmotik şoku önlemek için formüle edilmiştir.
Pipet Pasteur 3 mL SterilAccumaxAP-3-B-SSTERIL ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPET, 3 mL kapasiteli, şeffaf düşük yoğunluklu polietilenden (LDPE) yapılmış ve ayrı ayrı steril
Soğutmalı SantrifüjThermo ScientificTS-HM16RThermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Soğutmalı Santrifüj, kullanıcı dostu kontrol paneline sahip soğutmalı bir santrifüjdür, hızı, RCF değerini önceden ayarlamayı kolaylaştırır, çalışma süresi,  sıcaklık ve çalışma profili. Megafuge 16R, maksimum hızlara ulaşabilir  15.200 RPM ve maksimum 25.830 x g RCF.
RPMI-1640 OrtaMerckMFCD00217820HEPES Modifikasyonu, L-glutamin ve 25 mM HEPES ile, sodyum bikarbonatsız, toz, hücre kültürüne uygun
Tek kanallı mikropipetlerEppendorfZ683809Tek kanallı mikropipetler, çok küçük miktarlardaki sıvıları doğru bir şekilde aktarmak ve ölçmek için kullanılır.
MikropipetleyiciCorning4894için Uç 10 ve mikro kapasiteli; L ve 1.000 &mikro; L Otoklavlanabilir
Trioküler ters mikroskopLABOMEDVU-7125500Tüplerin ve şişelerin içindeki hücreleri açmak zorunda kalmadan gözlemlemenizi sağlar, böylece kontaminasyon sorunlarından kaçınır.
.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406(2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681(2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008(2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145(2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223(2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082(2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252(2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722(2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Trichoderma StromaticumConidial ViabilityMacrophage PhagocytosisPeripheral Blood MononuclearFungal ClearanceIn Vitro PhagocytosisConidia IsolationHuman MacrophagesPhagocytosis AssayFungal Pathogenesis

Related Articles