Yöntem makalesi

Hasta Mutasyon İmzalarını Temsil Eden Plazmid DNA'nın Elektroporasyona Dayalı İletimi Kullanılarak Beyin Tümörlerinin İn Vivo Modellenmesi

DOI:

10.3791/65286

⸱

23 Haziran 2023

 , 
1Board of Governor’s Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Center for Neural Sciences in Medicine, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klinik öncesi testler için yaygın hasta mutasyonları tarafından yönlendirilen immün yetmez, otokton bir tümör modelinin kullanılması, immünoterapötik testler için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, yaygın hasta mutasyonlarını temsil eden plazmit DNA'nın elektroporasyona dayalı dağıtımını kullanarak beyin tümörü fare modelleri oluşturmak için bir yöntemi açıklar, böylece doğru, tekrarlanabilir ve tutarlı bir fare modeli sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör modelleri, yeni ve daha etkili tedavilerin araştırılması açısından beyin tümörlerinin klinik öncesi testleri için kritik öneme sahiptir. İmmünoterapiye büyük ilgi duyulduğundan, beyindeki tümör ve bağışıklık hücresi popülasyonlarını ve tedaviye yanıtlarını incelemek için tutarlı, klinik olarak uygun, immün yetmezliği olan bir fare modeline sahip olmak daha da kritiktir. Klinik öncesi modellerin çoğu, yerleşik tümör hücre hatlarının ortotopik transplantasyonunu kullanırken, burada sunulan modelleme sistemi, bölünen nöral öncü hücrelere (NPC'ler ) eklenen DNA yapılarından kademeli ancak etkili bir gelişimde hastaya özgü tümör mutasyonlarının "kişiselleştirilmiş" bir temsiline izin verir. DNA yapıları, sürücü mutasyonlarının tek kopyalı, somatik mutajenezine izin veren çift rekombinaz aracılı kaset değişimi (MADR) yöntemiyle mozaik analizine sahiptir. Doğum ile 3 günlük arasındaki yeni doğan fare yavruları kullanılarak, NPC'ler lateral ventrikülleri kaplayan bu bölünen hücrelerden yararlanılarak hedeflenir. DNA plazmitlerinin (örneğin, MADR türevi, transpozonlar, CRISPR'ye yönelik sgRNA) ventriküllere mikroenjeksiyonunu, başın rostral bölgesini çevreleyen kürekler kullanılarak elektroporasyon takip eder. Elektriksel stimülasyon üzerine DNA, genoma entegre olma potansiyeli ile bölünen hücrelere alınır. Bu yöntemin kullanımı, en yaygın malign beyin tümörü olan glioblastoma dahil olmak üzere hem pediatrik hem de yetişkin beyin tümörlerinin geliştirilmesinde başarıyla gösterilmiştir. Bu makale, genç fare yavrularının uyuşturulması, plazmit karışımının mikroenjeksiyonu ve ardından elektroporasyon dahil olmak üzere bu tekniği kullanarak bir beyin tümörü modeli geliştirmenin farklı adımlarını tartışmakta ve göstermektedir. Bu otokton, bağışıklığı yeterli fare modeli ile araştırmacılar, etkili kanser tedavisini iyileştirme ve inceleme çabalarında klinik öncesi modelleme yaklaşımlarını genişletme yeteneğine sahip olacaklar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murin beyin tümörü modelleri, beyin tümörü oluşum ve tedavi mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Mevcut modeller tipik olarak, uygun immünoterapi çalışmalarını engelleyen immün yetmezliği olan fareler kullanılarak, sınırlı sayıda sürücü mutasyonuna veya hastadan türetilen ksenogreft modellerine dayalı olarak, yaygın olarak kullanılan tümör hücre hatlarının hızla üretilen deri altı veya ortotopik transplantasyonlarını içerir 1,2,3,4. Ek olarak, bu klinik öncesi sonuçlar yanlış pozitiflere yol açabilir, çünkü bu tür modeller tedaviye yanıt olarak dramatik, çoğu zaman iyileştirici etkiler gösterebilir, ancak bu klinik 2,5,6,7'ye dönüşmez. Hasta mutasyon imzalarını daha fazla yansıtan, genetiği değiştirilmiş klinik öncesi fare modellerini hızlı bir şekilde üretme yeteneğine sahip olmak, klinik öncesi sonuçların geçerliliğini artırmak için zorunludur.

Hem fonksiyon kaybı (LOF) hem de fonksiyon kazancı (GOF) mutasyonlarını indüklemek için DNA plazmitlerinin elektroporasyon (EP) tabanlı iletimi, bu tür modellerin üretilmesine izin verir. Çift rekombinaz aracılı kaset değişimi veya MADR8 ile mozaik analizi adı verilen GOF sürücü mutasyonlarının daha kesin bir temsili için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, ilgilenilen bir genin (veya genlerin) somatik hücrelerde kontrollü, lokusa özgü bir şekilde ekspresyonuna izin verir8. Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gibi diğer moleküler araçlarla kombinasyon halinde, fare beyin tümörü modelleri geliştirmek için farklı hasta mutasyonları birleştirilebilir. Bu yöntem, gliomlar ve ependimomlar8 dahil olmak üzere farklı pediatrik beyin tümörlerinin yanı sıra glioblastoma (GBM) gibi yetişkin beyin tümörü modelleri için kullanılmıştır.

EP tümör modelleme yöntemi bir nakil kadar yaygın olmasa da, aşağıdakiler şimdiye kadar bu modelleme sisteminin kolaylığını ve yüksek tekrarlanabilirliğini göstermektedir. mTmG fareleri, MADR-plazmid DNA 8,9'un eklenmesi için kullanılır. Bu sistem, donör DNA plazmidinin (yani, ilgilenilen GOF geni) daha sonra eklenmesi için Rosa26 lokusunda bulunan loxP ve Flp rekombinaz hedef (FRT) bölgelerinin rekombinasyonuna izin verir8,9. Aşağıdaki protokol, gayretli bir uygulamadan sonra bu yöntemin basitliğini ve fare beyin tümörü modellerini otokton, tutarlı bir şekilde geliştirme yeteneğini göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokoldeki tüm prosedürler Cedars Sinai Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Homozigot mTmG fareleri, aşağıdaki protokolde kullanılmak üzere karışık cinsiyetli, heterozigot mTmG farelerinin yavrularını elde etmek için C57BL / 6J farelerle yetiştirildi. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Fare yavruları doğum sonrası 0. ve 3. günler arasında elektroporasyona tabi tutuldu (P0-P3).

1. Cerrahi kurulum

  1. Ameliyat masasına kimyasal dezenfektan (örneğin Vimoba) püskürtün ve silin, ardından %70 etanol ekleyin ve tekrar silin.
  2. Aşağıdaki aletleri/malzemeleri ameliyat masasına yerleştirin: çekilmiş cam kılcal pipetler (pipetlerin nasıl çekileceği ile ilgili referans10'a bakın), küçük makaslar, küçük biyolojik tehlike kesici alet atık kabı, mikrolitrelik pipetleyici ve pipet uçları, 2x kesilmiş kare parafin film parçaları, elektrot jeli, elektrotlar, mikroenjektör tutucu ve DNA plazmit karışımı (bkz.
  3. Aşağıdaki ataşmanları, belirtildiğinde ameliyat masasındaki veya zemindeki ekipmanın üzerine yerleştirin: mikroenjektör kontrol paneli, makineye takılı tutucu ve fiş, mikroenjektör tutucuyu yana tutmak için stand (lehimleme yardımcısı), mikroenjektör ayak pedalı (yerde), makineye bağlı elektrotlar ve elektrot ayak pedalı (zeminde) (bkz.
    NOT: Elektrot ayak pedalı, kullanım sırasını hatırlatmak için mikroenjektör ayak pedalının sağına yerleştirilmiştir.
  4. Mikroenjektör ve elektrot kontrol panellerini açın.
    1. Mikroenjektör üzerindeki ayarların deney için doğru olup olmadığını kontrol edin: plazmit karışımının nasıl alındığına bağlı olarak basınç 220-450 hPa arasında olmalıdır.
    2. Elektrot panelindeki ayarların deney için doğru olup olmadığını kontrol edin.
      NOT: Mevcut deney (ve beyin tümörü modellerimizin çoğu) için, 120 V'luk (50 ms; 950 ms ile ayrılmış) beş darbe kullanılmıştır.

2. Ameliyat öncesi hazırlık

  1. Plazmid karışımını mikroenjektörde hazırlayın.
    1. Çekilmiş bir cam kılcal pipeti alın ve mikroenjektör tutucusuna yerleştirin. Yerinde tutmak için ucun vidalandığından emin olun.
    2. Mikroenjektör tutucuyu bir elinizle, küçük makası diğer elinizle tutun; Pipetin ucunu küçük bir keskin biyolojik tehlike kabının üzerine koyun. Makas kapalıyken, uzatılmış cam kılcal pipete hafifçe bastırın. Bükümün görüldüğü yerde, açıklıktan yaklaşık 2 mm uzakta kesin. Kesim başarılı görünüyorsa, dikkatlice yana yerleştirin.
    3. Piyasada bulunan plazmid karışım tüpünü ameliyat masasına düz bir şekilde yerleştirin ve açın. Plazmid karışımını hazırlarken sabit tutmak için pipet ucu kutusunu veya başka bir öğeyi tüpün tabanının arkasına yerleştirin. Mikroenjektör hattına bağlı cam pipeti masanın üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve ucun tüpün dibine yakın karışımda iyice olduğundan emin olarak plazmit karışımının tüpüne yavaşça yerleştirin.
      NOT: Doğal yerçekimi emişi nedeniyle, plazmit karışımı emişi, aktif olarak çekilmeden önce cam pipette başlayacaktır.
    4. Plazmit karışımındaki cam pipetin ucuyla, çekilen miktarı artırmak için mikroenjektör panelini kullanın. 0'dan başlayarak, sağ düğmeyi çevirin ve -60'a doğru negatif yönde çevirin - bu, plazmit karışımını cam pipete getirecektir. Sadece ~ 1 inç plazmit karışımı getirin. Düğmeyi tekrar 0'a çevirin ve ardından pipet ucunu karışımdan çıkarın.
      NOT: Negatif yöndeyken pipet ucunu karışımdan çıkarmayın, çünkü bu, karışımı mikro enjektöre ve muhtemelen boruya fırlatacaktır.
    5. Karışımı bir parafin film şeridine enjekte ederek bir enjeksiyondaki karışım miktarını test edin. Karışımı parafin filmine enjekte etmek için ayak pedalını kullanın ve bir kez basın. Tam olarak 1 μL olup olmadığını görmek için karışımı parafin filmine almak için 1 μL'ye ayarlanmış pipetleyiciyi kullanın.
      NOT: 1 μL'den biraz daha azsa, mikroenjektörün basıncı artırılabilir. Basınç 450 hPa'ya yaklaşıyorsa ve hala 1 μL'den azsa, cam pipet açıklığı çok küçüktür ve daha fazla kesilmesi gerekecektir. Kırpmadan önce plazmit karışımının tekrar tüpe yerleştirilmesi önerilir. Buna rağmen, makas üzerinde hala bir kalıntı karışım olacaktır, bu nedenle kalan karışımı çıkarmak için makası daha sonra DNase ile iyice temizlemek zorunludur. Enjeksiyon 1 μL'den fazlaysa, yeni bir çekilmiş cam pipetin kullanılması ve kesilmesi gerekecektir. Test miktarı tam olarak 1 μL olduğunda, cam pipet ucu doğru boyuttadır.
    6. Prosedür için ek plazmit karışımı veya çekilen cam pipete yaklaşık 2-3 inç çekmek için 2.1.4 adımını tekrarlayın. Karışımın, ucunun görülemeyeceği, mikroenjektörün içine çok fazla girmediğinden emin olun.
      NOT: Plazmid karışımını çizerken hava kabarcıklarından kaçınmak çok önemlidir. Kabarcıklar varsa, plazmit karışımını çekilen cam pipetten çıkararak ve yeniden başlayarak bu adımı yeniden yapmak gerekir. Mevcut hava kabarcıkları, yavrunun ventrikülüne enjekte edilirken aşağıdaki adımlara zarar verecektir.
    7. Plazmid karışımı çekilmiş cam pipette hazırken, hazırlanan pipeti yanlışlıkla dokunmamak/çarpmamak için lehimleme yardımı standının yan tarafına ve yoldan uzağa yerleştirin.
  2. Hayvanları deney için hazırlayın.
    1. Anestezi uygulayan yavrular için bir buz kovası hazırlayın. Eritmek için buz kovasına su ekleyin ve anestezi tutucuyu (örn. pipet kutusu üstü) soğutmaya yardımcı olun.
    2. Soğuması için kutunun üstünü erimiş buzun üzerine yerleştirin.
    3. Yavruları kafesten dikkatlice çıkarın ve buzun üzerinde kalan soğutulmuş kutunun üstüne yerleştirin. Soğutma işlemine yardımcı olmak için alt kısma gevşek bir şekilde başka bir üst kısım yerleştirin.
    4. 2-3 dakika sonra yavruları kontrol edin. Yüzüstü pozisyonda kalarak yavruları birbirinden ayırın.
      NOT: Yavrular kıvranacak, ancak soğuk anestezi devreye girdiğinde bu yavaşlayacaktır. Yavruların kolay görüntülenmesi için kutunun üst kısmı kapalı bırakılabilir.
    5. Uygun anestezi olup olmadığını kontrol etmek için yavrunun kuyruğunu sıkıştırın ve bir reaksiyon arayın. Bir reaksiyon varsa, 2.2.4 adımını tekrarlayın. Gıcırtı yoksa veya çok az hareket yapılırsa, yavru prosedür için hazırdır.
      NOT: Fareler, işlemden sonra iyileşme yeteneklerini etkileyeceğinden uzun süre buz üzerinde tutulmamalıdır. Bir seferde sadece anestezi altındayken hem enjekte edilebilen hem de elektropore edilebilen yavru sayısı buza konulmalıdır; Tecrübe ile daha büyük sayılar yapılabilir.

3. DNA plazmit karışımının beyin ventrikülüne mikroenjeksiyonu

  1. Ventral pozisyonda masanın üzerine bir yavru yerleştirin.
  2. Kafatası dikişlerini deriden görselleştirmek için başın arkasını hafifçe geriye doğru çekin. Kafatasında lambda bulun. Ventrikül/enjeksiyon bölgesi lambda ve gözün ortasında olacaktır.
    NOT: Lambda, sagital ve lambdoid sütürlerin kesiştiği yerdir. Fare kafatasındaki lambdanın tanımlanması için referans11'e bakın.
  3. Cam pipet ucuyla cildi dik bir açıyla delin (pipet tavana doğru dümdüzdür). Kafatasına bastırırken hafif bir içbükey girinti ve ilk direnç gözlemleyin. Delindikten ve cam pipet ucu içbükey girintiden geçtikten sonra uygun enjeksiyon seviyesine ulaşılır.
  4. Cam pipet ucunu yerinde tutun ve 1 μL plazmit karışımı enjekte etmek için mikroenjektör ayak pedalına bir kez basın.
    NOT: Enjeksiyonun başarılı olduğunu net bir şekilde görmenin iki yolu vardır. İlk olarak, başka bir laboratuvar üyesinin plazmit karışımının enjekte edilirken cam pipete inmesini izlemesini sağlayın. Ayrıca, plazmit karışımında hızlı yeşil veya başka bir boya kullanılıyorsa, boya enjekte edildikten sonra derinin altındaki ventrikülde gözle görülür şekilde yayılır ve bir cerrahi lambaya tutulduğunda kolayca görülebilir.

4. Elektroporasyon

  1. Masanın üzerine bir parça parafin filmi (bir kare) yerleştirin ve filmin üstündeki elektrot jelini sıkın. Her bir kürek üzerine bol miktarda fırçalayarak elektrot kanatçıklarını elektrot jeli ile kaplayın. Damlayan fazla jel bir kağıt havlu üzerinde kaydırılabilir.
    NOT: İlk EP'den sonra, her bir kürekten gelen jelin diğer tarafa temas etmesine izin vermeyin. Bu, yükü aktarır ve yavrunun kafasına uygulanırken cızırtılı bir ses duyulabilir. Bu, bir elektrottan yavrunun kafasındaki jel, diğerinden gelen jel ile temas ederse de olur.
    DİKKAT: Elektroporasyon sırasında parmakları küreklerden uzak tutmaya özen gösterilmelidir.
  2. Yavrunun vücudunu bir elinizle (tipik olarak baskın olmayan el) tutun ve parmakları başın arkasında tutun.
    NOT: Sağ elini kullanıyorsa, yavruyu sol elinizle, elektrotları sağ elinizle tutmak en kolay yoldur. Solaksanız, tam tersini yapın.
  3. Pozitif elektrot başın dışında ventrikülün hedeflendiği yerde olacak şekilde uygun pozisyonda olduklarından emin olmak için elektrotları yavrunun kafasına yaklaştırın (örneğin, sol ventrikülü hedefliyorsanız, pozitifi yavrunun sol tarafına ve negatifi yavrunun sağ tarafına yerleştirin). Elektrotları yerleştirirken, başın yerine kaldırılmasına yardımcı olmak için bir parmağınızı (tipik olarak başparmağınızı) vücudun dorsal tarafında/boynun arkasında, başın arkasına hafifçe kaydırın.
  4. Kuyruğu sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin ve sadece yavru uygun anestezi düzlemindeyse elektroporasyona devam edin. Elektrot küreklerini fare kafasının rostral kısmındaki hafifçe sıkın ve gözlerin üzerine yerleştirin. Elektroporasyonu başlatmak için elektrot ayak pedalına bir kez basın. Bu protokol, 120 V'luk beş darbe kullanır (50 ms, 950 ms ile ayrılmış); Her nabız duyulabilir.
    1. Her darbede, elektrot kanatlarını saat yönünün tersine hafifçe döndürün, böylece pozitif kanat başın tepesine doğru hareket eder.
      NOT: Uygun elektroporasyon ile, her nabızda fare yavrusunun vücudunun seğirdiğini hissedecek/görecektir.
  5. Son darbeden sonra kürekleri çıkarın ve yana yerleştirin. Yavruyu temiz bir kağıt havluya taşıyın ve başka bir laboratuvar üyesinin jeli yavrunun kafasından temizlemesini ve bir kağıt havlu "teknesi" üzerindeki bir ısı lambasının altına yerleştirmesini sağlayın.
    NOT: Isı lambasının yavrulara çok yakın olmadığından emin olun. Bu adımda başka bir laboratuvar üyesinin yardım ettiğinden emin olun ve yavrulara sürekli göz kulak olun. Yavruların ısısını artırmak için genellikle yavruları ısı lambasının altında elinde tutmaya yardımcı olur. Yavrunun karnına hafifçe masaj yapmak da iyileşmeye yardımcı olabilir.
  6. Vücutları sağlıklı pembemsi bir renge sahip olduğunda ve hafif bir kuyruk tutamına gıcırtılı bir tepki verdikten sonra yavruları ev kafesine geri koyun.
    NOT: Onları kafese geri koymadan önce, az miktarda ev kafesi yatak malzemesi alın ve kafes kokusu için yavruları hafifçe fırçalayın. Yavruları yatak malzemesinin altındaki kafese geri koyun ve bekleme odasına geri dönün.

5. Ameliyat sonrası adımlar

  1. Kullanılmayan plazmid karışımını mikroenjektör cam pipetinden tüpe geri koyun. Yeterli karışım kaldıysa, bu gelecekteki prosedürlerde kullanılabilir. -20 °C'de saklayın.
  2. Elektrot küreklerindeki jeli kağıt havluyla silin.
  3. Tüm ekipman parçalarını orijinal yerlerine geri koyun.
    NOT: Plazmit karışımı alındıktan sonra cam pipet ucunu kesmek için makas kullanılmışsa, DNase çözeltisi ile iyice temizlemek için makası dışarıda bırakın.
  4. Masaya kimyasal bir dezenfektan püskürtün, ardından silin, ardından %70 etanol püskürtün, ardından tekrar silin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan protokol, hem pediatrik hem de yetişkin beyin tümörü fare modellerini başarılı bir şekilde geliştirmek için kullanılmıştır ve ilki Kim ve ark.8'de ayrıntılı olarak yayınlanmıştır. Uygun teknik ve plazmit tasarımının dikkatli bir şekilde planlanması ile tümörlerin EP gelişimindeki başarı tipik olarak 0'dür. Histoloji, bir raportör protein kullanıldığında başarılı DNA plazmit eklemesini kontrol etmenin en hızlı ve en kolay yoludur. Bu protokol, histolojik analizle onaylandığı gibi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazmid DNA'nın elektroporasyona dayalı iletimi, genetiği değiştirilmiş fare modellerinde kullanılana benzer, ancak viral transdüksiyonun hızı, lokalizasyonu ve verimliliği ile moleküler biyolojinin in vivo kullanımına izin verir 8,13,14. Bununla birlikte, ikincisi ile birlikte, güvenlik endişeleri ve bağışıklık tepkileri gelir. Plazmid DNA'nın EP iletimini kullanan modelleme sistemimizde, cam kılcal pipetin beyin ventr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmünofloresan boyama ve görüntüler için Gi Bum Kim'e teşekkür ederiz. Ayrıca protokolle ilgili yararlı tavsiyeleri için Emily Hatanaka, Naomi Kobritz ve Paul Linesch'e teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.1-2.5 ve mikro; L 1 kanallı pipetEppendorf3123000012
2 & L pipet uçlarıFisher Scientific02-707-442
20 & mikro; L pipet uçlarıFisher Scientific02-707-432
2-20 & L 1 kanallı pipetEppendorf3123000098
DNAZap PCR DNA Bozunma ÇözümleriFisher ScientificAM9890
ECM 830 Kare Poratör ElektroporatörBTX45-0662
Elektrot JeliParker LabsPLI152CSZ
Hızlı Yeşil BoyaSigma-AldrichF7258-25G
Yardımcı Eller Lehimleme YardımıPro'sKit900-015
Mikro Diseksiyon Makası, 4.5" Düz KeskinRobozRS-5916
Fare Suşu: C57BL/6JJackson LaboratuvarıJAX: 000664
Fare Suşu: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/JJackson Laboratuvarı  JAX: 007676
Parafilm Grainger16Y894
Plazmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV Addgene129419
Platin Cımbız, 7 mm ÇapBTX45-0488
Keskin uçlu kap, 1 litreUlineS-15307
Standart Cam Kılcal Damarlar, 4 inç, 1 mm Dış Çap, 0,58 mm İç ÇapWorld Hassas Aletler1B100F-4Kılcal pipetlerin çekilmesi gerekir - ayrıntılar için referans 10'a bakın.
Dikey Mikropipet ÇektirmeSutter AletleriP-30Isı ayarları: 880'de Isı #1, 680'de Isı #2; 800'de çekin. Çekme hakkında daha fazla ayrıntı için referans 10'a bakın.
Vimoba Tablet ÇözümüQuip LaboratuvarlarıVIMTAB
XenoWorks Dijital MikroenjektörSutter CihazlarıBRE
XenoWorks Mikropipet TutucuSutter CihazlarıBR-MH

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
  2. Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
  3. He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089(2021).
  4. Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
  5. Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137(2018).
  6. Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
  7. Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
  8. Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
  9. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  10. Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199(2020).
  11. White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579(2021).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
  14. Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
  15. Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311(2018).
  16. Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328(2021).
  17. Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093(2012).
  18. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103(2010).
  19. Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Beyin T m r ModelleriElektroporasyon ile Teslimatmm nokompetan Fare ModeliGlioblastoma ModellemeT m r Mikro evresiMikroenjeksiyon Tekni iSomatik MutagenezPreklinik Kanser Testleri

İlgili makaleler