Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Murin Pankreasın İntravital Görüntülenmesi için Stabilize Pencere

2.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65498

⸱

6 Ekim 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Integrated Imaging Program for Cancer Research, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 5Breast Center, Peking University People's Hospital, 6Department of Microbiology & Immunology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 7Montefiore Einstein Cancer Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 8Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 9Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 10Department of Cell Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Sağlıklı ve hastalıklı pankreasın seri ve uzunlamasına çalışmalarına izin veren, murin pankreasın hücre altı çözünürlüklü görüntülenmesi için stabilize kalıcı bir optik pencerenin cerrahi implantasyonu için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Pankreasın fizyolojisi ve patofizyolojisi karmaşıktır. Pankreatit ve pankreas adenokarsinomu (PDAC) gibi pankreas hastalıkları yüksek morbidite ve mortaliteye sahiptir. İntravital görüntüleme (IVI), hem sağlıklı hem de hastalıklı durumlarda dokuların yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayan ve hücre dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesini sağlayan güçlü bir tekniktir. Murin pankreasın IVI'si, organın derin içgüdüsel ve uyumlu doğası nedeniyle önemli zorluklar sunar, bu da onu hasara ve hareket artefaktlarına oldukça yatkın hale getirir.

Burada tarif edilen, murin Pankreasın (SWIP) I'ninntravital görüntülemesi için Stabilize Window'un implantasyon sürecidir. SWIP, normal sağlıklı durumlarda, sağlıklı pankreastan serulein tarafından indüklenen akut pankreatite dönüşüm sırasında ve pankreas tümörleri gibi malign durumlarda murin pankreasın IVI'sine izin verir. Genetik olarak etiketlenmiş hücreler veya floresan boyaların uygulanması ile bağlantılı olarak SWIP, tek hücreli ve hücre altı dinamiklerin (tek hücreli ve toplu göç dahil) ölçülmesini ve aynı ilgilenilen bölgenin birkaç gün boyunca seri görüntülenmesini sağlar.

PDAC'de kansere bağlı mortalitenin birincil nedeni ezici metastatik yük olduğundan, tümör hücresi göçünü yakalama yeteneği özellikle önemlidir. PDAC'de metastazın fizyolojik dinamiklerini anlamak, karşılanmamış kritik bir ihtiyaçtır ve hasta prognozunu iyileştirmek için çok önemlidir. Genel olarak, SWIP gelişmiş görüntüleme stabilitesi sağlar ve sağlıklı pankreas ve malign pankreas hastalıklarında IVI uygulamasını genişletir.

Giriş

İyi huylu ve kötü huylu pankreas hastalıkları potansiyel olarak yaşamı tehdit eder ve patofizyolojilerinin anlaşılmasında önemli boşluklar vardır. Pankreatit - pankreas iltihabı - ABD'de gastrointestinal hastalığa bağlı hastaneye yatışların ve yeniden kabullerin üçüncü ana nedenidir ve önemli morbidite, mortalite ve sosyoekonomik yük ile ilişkilidir1. Kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedeni2 olarak sıralanan pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC), çoğu pankreas malignitesini3 oluşturur ve sadece %11'lik kötü bir 5 yıllık sağkalım oranına işaret eder2. PDAC'de kansere bağlı mortalitenin önde gelen nedeni ezici metastatik yüktür. Ne yazık ki, çoğu hasta metastatik hastalık ile başvurur. Bu nedenle, PDAC'de metastaz dinamiklerini anlamak, kanser araştırmaları alanında karşılanmamış kritik bir ihtiyaçtır.

Enflamasyonu ve pankreasın metastatik kaskadını destekleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bilgideki bu boşluğa önemli bir katkı, pankreas hücresel dinamiklerini in vivo olarak gözlemleyememektir. Bu hücresel dinamiklerin doğrudan gözlemlenmesi, pankreas hastalığı olanların tanı ve tedavisini güçlendirmek ve iyileştirmek için kritik hedefleri ortaya çıkarmayı vaat ediyor.

İntravital görüntüleme (IVI), araştırmacıların canlı hayvanlardaki biyolojik süreçleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmesine ve incelemesine olanak tanıyan bir mikroskopi tekniğidir. IVI, hücre içi ve mikroçevresel dinamiklerin in vivo ve söz konusu biyolojik sürecin doğal ortamında yüksek çözünürlüklü, doğrudan görselleştirilmesine izin verir. Bu nedenle IVI, sağlıklı ve patolojik süreçlerin in vivo olarak gözlemlenmesine izin verir.

MRI, PET ve BT gibi çağdaş tüm vücut görüntüleme yöntemleri, tüm organların mükemmel görüntülerini sunar ve klinik semptomların başlamasından önce bile patolojileri ortaya çıkarabilir4. Bununla birlikte, tek hücreli çözünürlüğe ulaşamazlar veya hastalık-pankreatit veya malignitenin en erken aşamalarını ortaya çıkaramazlar.

Önceki araştırmalar, cilt5,6, meme7, akciğer 8, karaciğer9, beyin 10 ve pankreas tümörlerinin 11 iyi huylu ve kötü huylu hastalıklarını gözlemlemek için tek hücreli çözünürlük IVI kullanmış ve hastalığın ilerleme mekanizmalarına ilişkin içgörülere yol açmıştır 12. Bununla birlikte, murin pankreası, öncelikle derin viseral konumu ve yüksek uyumu nedeniyle, IVI kullanarak tek hücreli çözünürlüğe ulaşmada önemli engeller oluşturmaktadır. Ayrıca, mezenter içinde dalak, ince bağırsak ve mideye bağlanan ve erişimi zorlaştıran dallı, dağınık dağılmış bir organdır. Doku ayrıca bitişik peristalsis ve solunumun neden olduğu harekete karşı oldukça hassastır. Pankreasın hareketini en aza indirmek, tek hücreli çözünürlük mikroskobu için çok önemlidir, çünkü birkaç mikronluk hareket artefaktları bile görüntüleri bulanıklaştırabilir ve bozabilir, bu da tek tek hücrelerin dinamiklerini izlemeyi imkansız hale getirir13.

IVI gerçekleştirmek için, bir abdominal görüntüleme penceresi (AIW) cerrahi olarak implante edilmelidir 9,11. AIW'yi cerrahi olarak implante etmek için, karın duvarına metal bir pencere çerçevesi dikilir. Daha sonra, ilgilenilen organ siyanoakrilat yapıştırıcı kullanılarak çerçeveye tutturulur. Bu, bazı sert iç organlar (örneğin, karaciğer, dalak, sert tümörler) için yeterli olsa da, sağlıklı murin pankreasını görüntüleme girişimleri, dokunun uyumlu dokusu ve karmaşık mimarisi nedeniyle optimal olmayan lateral ve eksenel stabilite nedeniyle tehlikeye girer14. Bu sınırlamayı ele almak için, Park ve ark.14, sağlıklı pankreas için özel olarak tasarlanmış bir görüntüleme penceresi geliştirdi. Bu Pankreas Görüntüleme Penceresi (PIW), pencere çerçevesi içinde, lamellerin hemen altına yatay bir metal raf ekleyerek, dokuyu stabilize ederek ve kapak camı ile temasını koruyarak bağırsak hareketinin ve solunumun etkisini en aza indirir. PIW daha fazla yanal stabilite sunarken, bu pencerenin hala eksenel kayma gösterdiğini ve ayrıca metal raf ile lamel15 arasındaki dar boşluk nedeniyle büyük katı tümörlerin görüntülenmesini önlediğini bulduk.

Bu sınırlamaları ele almak için, hem sağlıklı hem de hastalıklı pankreasın stabil uzun süreli görüntülemesini sağlayabilen implante edilebilir bir görüntüleme penceresi olan murin Pankreasın (SWIP) I ntravitalgörüntülemesi için Stabilize Window'u geliştirdik (Şekil 1)15. Burada, SWIP'yi implante etmek için kullanılan cerrahi prosedür için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Birincil amaç metastazda yer alan dinamik mekanizmaları incelemek olsa da, bu yöntem pankreas biyolojisi ve patolojisinin çeşitli yönlerini keşfetmek için de kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler, Albert Einstein Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından önceden onay da dahil olmak üzere, omurgalı hayvanların kullanımına ilişkin yönergelere ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Pencerelerin pasivasyonu

NOT: Paslanmaz çeliğin pasivasyonu, metali kirleticilerden temizler ve metalin yumuşak dokularla biyouyumluluğunu, titanyum16'nın ötesinde bile büyük ölçüde artıran ince bir oksit tabakası oluşturur.

  1. Optik pencere çerçevelerini %1 (a/h) enzimatik olarak aktif deterjan solüsyonu ile yıkayarak pasivasyon işlemini başlatın.
  2. Çerçeveleri bir cam kavanozun içinde 30 dakika boyunca 70 °C'de %5 (a/h) sodyum hidroksit çözeltisine daldırın.
  3. Çerçeveleri çıkarın ve deiyonize suyla durulayın.
  4. Çerçeveleri yeni bir cam kavanozun içinde 10 dakika boyunca 55 °C'de %7 (a/h) sitrik asit çözeltisine daldırın.
  5. Çerçeveleri çıkarın ve tekrar deiyonize su ile durulayın.
  6. Adım 1.2'yi tekrarlayın ve son olarak pencere çerçevelerini son bir kez deiyonize suyla durulayın.

2. Tümör implantasyonu veya pencere cerrahisi için hazırlık

NOT: Pankreas tümörleri üzerine yapılan çalışmalar için, tümör hücreleri implante edilmeli ve açık tümörlere dönüşmesine izin verilmelidir. Tümör hücrelerini in vivo olarak görselleştirmek için, Dendra2 gibi floresan proteinleri eksprese etmek için genetiği değiştirilmiş hücrelerin kullanılması önerilir. Parlak floresan protein etiketlerinin kullanılması, doku otofloresansı ile ilgili olası sorunları azaltacaktır. Kullanılabilecek diğer potansiyel floresan proteinler, boyalar ve genetik olarak kodlanmış floresan fare modelleri başka bir yerde tartışılmıştır17,18. Ameliyat alanının kirlenmesini önlemek için, cerrahi prosedürü bir başlık veya laminer akış kabininde gerçekleştirin ve hazırlık, ameliyat ve iyileşme için farklı alanların kullanıldığından emin olun.

  1. Ameliyattan önce, tüm cerrahi aletleri bir otoklavda sterilize edin ve gerekirse sonraki prosedürler için sıcak boncuk sterilizatörü kullanın. Ameliyatın yalnızca ipuçlarıyla yapılan bir teknik kullandığından emin olun.
  2. Isıtılmış cerrahi pedi ve boncuk sterilizatörünü açın ve uygun çalışma sıcaklığına ulaşmasını bekleyin. Olası yanıkları önlemek için ısıtma yastığı sıcaklığı bir yüzey termometresi ile izlenmelidir. Sıcaklık yeterince kontrol edilemiyorsa, ısıtma yastığının üzerine steril bir bez yerleştirin.
    NOT: Tümör ve pencere implantasyonu gibi kısa prosedürler (≤20 dakika) sırasında vücut ısısı, ısıtılmış bir cerrahi ped kullanıldığında minimum düzeyde etkilenir. Bununla birlikte, uzun süreli görüntüleme sırasında olduğu gibi daha uzun anestezi süreleri, vücut ısısını korumak için farenin ısıtılmış bir odaya yerleştirilmesini gerektirir.
  3. Fareyi bir anestezi odasında% 5 izofluran ile uyuşturun.
  4. Kritik Adım: Fare bilinçsiz olduğunda anesteziyi %2'ye düşürün. Anestezi seviyesini ve farenin hayati değerlerini dikkatlice izleyin (örneğin, bir nabız oksimetresi kullanarak)19.
  5. Korneanın kurumasını önlemek için farenin her bir gözüne küçük bir damla göz kayganlaştırıcı damlatın.
  6. Ameliyattan önce, tüyleri almak için sol üst karın bölgesine bolca tüy dökücü krem uygulayın. 20 saniye sonra, saçı ve tüy dökücü kremi sıkıca silmek için nemli kağıt mendil kullanın. Ameliyat bölgesinden tüm tüyler alınana kadar işlemi gerektiği kadar tekrarlayın.
  7. Preoperatif analjezi sağlamak için 90 μL PBS içinde seyreltilmiş 10 μL buprenorfin (0.1 mg/kg) subkutan olarak enjekte edilir.

3. Pankreas tümörü implantasyonu

  1. İstenilen konsantrasyonda tümör hücrelerinin alikotlarını hazırlayın (tümör hücresi ikiye katlanma süresine bağlı olarak). Hücre süspansiyonunu bir insülin şırıngasına yerleştirin ve buz üzerinde tutun. Bu protokolü takip etmek için, Erstad ve ark.21'den uyarlanan ortotopik enjeksiyon protokolünü izleyerek, maksimum 50 μL PBS içinde süspanse edilmiş 106 sinjeneik KPC tümör hücresi20 kullanın
    NOT: Bu konsantrasyonda enjekte edilen bu hücre dizisi rutin olarak 10-14 gün boyunca palpe edilebilir veya uygun şekilde büyük tümörler üretti. Bu hücre hattının ve diğer pankreas hücre hatlarının alt klonlarının, uygun büyüklükte tümörler üretmek için uygun konsantrasyonlar ve zaman çizelgeleri açısından değerlendirilmesi gerekir).
  2. Antiseptik sabun kullanarak ellerinizi yıkayın.
  3. Her yeni ameliyattan önce yeni steril eldivenler giyin.
  4. Fareyi steril cerrahi başlığa aktarın ve kısmi sağ lateral dekübit pozisyonuna yerleştirin.
  5. Uzuvları kağıt bantla sabitleyin.
    NOT: Aletlerin doğru kullanımı prosedür boyunca önemlidir. Forseps, Castroviejo makası ve vakum alma aletinin nasıl tutulacağına dair örnekler Şekil 2A-C'de gösterilmektedir.
  6. Karnı antiseptik ile sterilize edin (Şekil 2D).
  7. Ayak parmağı kıstırma testi yaparak hayvanın tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
  8. Forseps ve Castroviejo makası kullanarak ciltte 10-15 mm sol subkostal insizyon yapın (Şekil 2E).
  9. Gerekli görüldüğünde pamuklu çubuklar veya koter kalemi kullanarak hemostazı kontrol edin.
  10. Peritona girmek için alttaki kası forseps ve Castroviejo makası ile dikkatlice bölün (Şekil 2F).
  11. Steril pamuklu çubuklar kullanarak pankreas ve dalağı atravmatik olarak dışsallaştırın.
  12. Pankreası kıvrım kalmayacak şekilde dışarı doğru yayın (Şekil 2G).
  13. Pankreasın gövdesinde veya kuyruğunda (kan damarlarından uzakta) istenen tümör enjeksiyon bölgesini tanımlayın.
  14. Kritik adım: Pankreasın dikkatli bir şekilde konumlandırılmasından sonra, dokuya gerginlik sağlamak için forseps kullanın ve insülin şırınga ucunu, eğimi yukarı bakacak şekilde, pankreasın istenen bölgesine 4-5 mm derinliğe kadar yerleştirin (Şekil 2H).
  15. Tümör hücresi çözeltisini yavaşça enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyonu onaylayan küçük bir kabarcık arayın (Şekil 2I).
  16. Tümör hücresi enjeksiyon kabarcığını bozmadan pankreası dikkatlice karına geri koyun (Şekil 2J).
  17. Emilebilir 5-0 polidioksanon sütürler kullanılarak önce kas tabakası daha sonra kesintili sütürlerle cilt kapatılır (Şekil 2K-N).
  18. Kesi siyanoakrilat yapıştırıcı ile örtün (Şekil 2O), ardından fareyi bir ısıtma lambasının altındaki temiz bir kafese geri koyun.amp kurtarma için. Enfeksiyonu önlemek için içme suyuna antibiyotik verin. Fareleri izleyin ve ameliyattan tamamen iyileşmelerine izin verin.
    NOT: Antibiyotikler IACUC protokolünün gerektirdiği şekilde uygulanır. Tüm hayvanlar ayrı ayrı barındırılır.
  19. Tümörün karın duvarından ele gelene kadar 10-14 gün gelişmesine izin verin.

4. Pankreas pencere ameliyatı

  1. Hayvanlar görüntüleme için hazır olduğunda, pencere implantasyon ameliyatına başlayın. Başlamak için ellerinizi antiseptik sabunla yıkayın.
  2. Her yeni ameliyattan önce yeni steril eldivenler giyin.
  3. Isıtılmış cerrahi standda, sol karnı ortaya çıkarmak için fareyi sağ lateral dekübit pozisyonuna yerleştirin.
  4. Farenin ön ve arka bacaklarını kağıt bant kullanarak kraniyal ve kaudal olarak ısıtılmış cerrahi aşamaya sabitleyin. Dalağın (derinin altında) cerrahi alanda görünür olduğundan emin olun (Şekil 3A).
  5. Steriliteyi korumak için, kaputtaki tüm cerrahi aletleri ambalajından çıkarın.
  6. Farenin cildini bol miktarda antiseptik uygulamasıyla temizleyerek ameliyat bölgesini dezenfekte edin.
  7. Ayak parmağı kıstırma testi yaparak hayvanın tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
  8. Kritik adım: Karnın sol üst kadranının derisini forseps ile kaldırın ve Castroviejo makası kullanarak ciltte ve kas sisteminde ~10 mm'lik dairesel bir kesi yapın (Şekil 3B,C).
  9. Gerektiğinde pamuklu çubuklar veya koter kalemi kullanarak kanamayı kontrol edin ve hemostazı koruyun.
  10. Dalağa bağlı olan pankreasın lokalizasyonunu belirleyin ve destekleyici kanaviçe işinin nereye yerleştirilmesi gerektiğine karar vermek için pankreasın kesi içinde uzandığı yönü belirleyin.
  11. 5-0 ipek dikiş kullanarak, ilk dikişi kas tabakasında istenen yere yerleştirin. Bu ucu 3-5 düğüm ile bağlayın. (Şekil 3D,E)
  12. Doğrudan kesi boyunca dikmeye devam edin. ~5 cm'lik bir kuyruk kesin ve bırakın (Şekil 3F).
  13. 4.11 ve 4.12 adımlarını ilk dikişe dik olarak tekrarlayın (Şekil 3G,H).
  14. Kritik adım: Pankreası yavaşça kaldırın ve kanaviçe işinin üzerine yerleştirin (Şekil 3I,J). Manipülasyon sırasında pankreasa zarar vermemeye dikkat edin.
  15. Kritik adım: 5-0 ipek sütür kullanarak, delikten ~1 mm uzakta, cilt ve kas tabakasını birbirine geçirerek çevresel olarak bir çanta dikişi yapın (Şekil 3K).
  16. Pencere çerçevesini, dairesel kesiğin kenarları pencerenin oluğuna oturacak şekilde konumlandırın (Şekil 3L).
  17. 5-0 ipeği sıkıca bağlayarak implante edilmiş pencereyi sabitleyin.
  18. 1 mL şırıngaya 100 μL sıvı siyanoakrilat yapıştırıcı yükleyin.
  19. ~10 sn boyunca hassas bir basınçlı hava akışı uygulayarak dokuyu kurutun.
  20. Pencere çerçevesini dış kenarından forseps ile sıkıştırın ve pankreasın pencere çerçevesinin alt yüzeyinden ayrılmasını sağlamak için hafifçe kaldırın.
  21. Kritik adım: Pencerenin girintisi boyunca ince bir tabaka sıvı siyanoakrilat yapıştırıcı dağıtın (Şekil 3M). Pankreas dokusuna yapıştırıcı bulaşmadığından emin olun.
  22. Vakumlu manyetikleri kullanarak 5 mm'lik lamel kaldırın.
  23. Lameli optik pencere çerçevesinin ortasındaki girintinin içine dikkatlice yerleştirin. Hafif basınçla tutun ve siyanoakrilat yapıştırıcının sertleşmesine izin verin (~25 s).
  24. Lameli forseps kullanarak vakumlu manyetiklerden ayırın.
  25. Pankreası lame sıkıca sabitlemek için kanaviçe dikişlerini sıkın (Şekil 3N,O). Not: Pankreasta hasara ve iskemiye neden olabileceğinden kanaviçe işini aşırı sıkmayın.
  26. Dikişin uçlarını kesin.
  27. Bandı fareden çıkarın.
  28. İzofluran buharlaştırıcıyı kapatın.
  29. Fareyi temiz bir kafese veya doğrudan intravital mikroskoba yerleştirin.
  30. Pencere ameliyatını takiben hayvanları ayrı ayrı barındırın ve tamamen iyileşene kadar izleyin.
  31. Görüntüleme daha sonra daha önce tanımladığımız gibi iki lazerli bir multifoton mikroskobu üzerinde gerçekleştirilir 22,23,24 Uzun görüntüleme seansları için fare, vücut ısısını korumak için ısıtılmış bir odaya yerleştirilir ve IACUC standartlarına göre destekleyici sıvılarla sağlanır.

5. Pankreatit indüksiyonu için serulein tedavisi

  1. Pankreatitin başlangıcını araştırmak için, SWIP'nin implantasyonundan sonra sağlıklı fareleri serulein ile tedavi edin. Farelerin 14-18 saat aç bırakıldığından ve cerulein uygulamasından önce ad libitum su verildiğinden emin olun.
  2. Sekiz enjeksiyona kadar 1 saat aralıklarla intraperitoneal olarak 100 μL steril 1x DPBS'ye 50 μg / kg serulein enjekte edin. Kontrol farelerine intraperitoneal olarak enjekte edilen eşdeğer bir hacimde 1x DPBS'yi tek başına uygulayın.
  3. Görüntülemeyi takiben, fareleri ilk enjeksiyondan 24 saat sonra IACUC standartlarına göre servikal çıkık ile kurban edin.
  4. Daha önce açıklandığı gibi iki lazerli çoklu foton mikroskobunda görüntüleme yapın22,23,24. Uzun görüntüleme seansları için, vücut ısısını korumak ve IACUC standartlarına göre destekleyici sıvılar sağlamak için fareyi ısıtılmış bir odaya yerleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Du ve ark.15'ten uyarlanan Şekil 1, murin pankreasın hızlandırılmış IVI filminden görüntü karelerini göstermektedir. İlk yerleşme periyodu içinde bir miktar doku hareketi gözlenebilir (görüntülemenin ilk saati, Şekil 1A). Ancak bu yerleşme periyodundan sonra (>75 dk) devam eden görüntüleme ile lateral ve aksiyel stabilitede artış gözlenmiştir (Şekil 1B). SWIP'nin kararlılığının önceki AIW ve PIW görüntülem...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan SWIP protokolü, kanaviçe sepeti tekniğini kullanarak gelişmiş bir pankreas dokusu stabilizasyonu yöntemi sağlar. Erken abdominal görüntüleme pencereleri (AIW'ler), karın iç organlarının intravital görüntülemesini (IVI) mümkün kıldı, ancak pankreas gibi yumuşak dokuların hareketini yeterince sınırlamadı. Buna cevaben, Park ve ark. yatay bir metal raf içeren ve cam lamel ile teması sürdürürken pankreas dokusunun daha iyi stabilizasyonuna izin veren bir pankreas görüntüleme penceresi (PIW) geliştirdi. Bu ya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Evelyn Lipper Yardım Vakfı, Gruss-Lipper Biyofotonik Merkezi, Kanser Araştırmaları için Entegre Görüntüleme Programı, NIH T-32 Bursu (CA200561) ve Savunma Bakanlığı Pankreas Kanseri Araştırma Programı (PCARP) hibe PA210223P1.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%1 (a/h) enzim aktif deterjançözeltisi Alconox IncNAManuel ve ultrasonik temizlik için proteaz enzimleri içeren konsantre, anyonik deterjan
%5 (a/h) sodyum hidroksit çözeltisiSigma-AldrichS8045Pasivasyon reaktifi
5 mm kapak camıElektron Mikroskobu Bilimleri72296-05Yuvarlak Cam Lameller 
% 7 (a/h) sitrik asit çözeltisiSigma-Aldrich 251275Pasivasyon reaktifi
28G 1 mL BD İnsülin ŞırıngasıBD329410Hücre enjeksiyonu için şırınga
Baytril 100 (enrofloksasin)Bayer (Santa Cruz Biyoteknoloji)sc-362890RxAntibiyotik
Tezgah Montajlı Isı LambasıMcMaster-Carr3349K51Isı lambası
Buprenorfin 0.3 mg/mLCovetrus Kuzey Amerika059122Buprenorfin Analjezi
Castroviejo Kavisli MakasDünyası Hassas AletlerWP2220Doku kesmek için Makas
C57BL / 6J FareJackson Laboratuvarı000664 C57BL/6J Fare
Klorheksidin çözeltisiDurvet7-45801-10258-3Klorheksidin Dezenfektan Çözeltisi
Basınçlı hava kabıFalconDPSJB-12Dokuyu kurutmak için basınçlı hava
Cyano akrilat - Jel Süper YapıştırıcıZımbalar234790-6Cilt Tutkalı
Cyano akrilat - Sıvı Süper YapıştırıcıZımbalarLOC1647358Lamel Tutkal
DPBS 1xCerulein/hücre enjeksiyonları için21-031-CV
İkizler Koter KitiHarvard Aparatı726067Koter Kalemi
Germinatör 500CellPoint ScientificGER  5287-120VBoncuk Sterilizatörü
Graefe Mikro Diseksiyon Forsepsleri; Dişli; hafif eğri; 0,8 mm Uç Genişliği; 4" UzunlukRoboz CerrahiRS-5135 Graefe Mikro Diseksiyon Forseps
Görüntüleme mikroskobuNANABkz. Entenberg et al. 2011 [27]
Görüntüleme yazılımıNANABkz. Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)Henry Schein Hayvan Sağlığı50033Isofluran Anestezi
Kim WipesFisher Scientific06-666-A Kim Mendil
Laboratuvar bandıFisher Scientific159015RLaboratuvar Bandı
Fare Diseksiyon KitiDünya Hassas AletlerMOUSEKITCerrahi Aletler
Fare Pençesi Nabız Oksimetresi SensörüKent Scientific CorpoMSTAT Sensörü-MSENabız Oksimetresi
Fare SurgisuiteKent ScientificSURGI-M04Isıtmalı platform
Nair Epilasyon LosyonAmazonB001RVMR7KTüy Dökücü Losyon
OksijenTechAirOX TMOksijen
PERMA-HAND Siyah Örgülü İpek Sütürler, ETHICON Boyut 5-0VWR95056-872İpek Sütür
Fosfat Tamponlu Salin 1xLife Technologies10010-023PBS
PhysioSuite SystemKent ScientificPhysioSuiteIsıtmalı Platform Denetleyici
PuralubeHenry Schein Hayvan Sağlığı008897Göz Kayganlaştırıcı
Püriten Steril Olmayan Pamuk Uçlu Swablar Fisher Scientific867WCNOGLUEPamuklu Çubuklar
SHARP Hassas Bariyer Uçları, P-100, 100 ve mikro için; LDenville Bilimsel A.Ş.P1125100 ve mikro; L Pipet Uçları
Tetrametilrodamin izotiyosiyanat – DextranSigma-AldrichT1287-500MGVasküler Etiket
Pencere sabitleme plakasıNANA Mikroskopsahnesinde pencere yerleşimi için özel yapım plaka. Plaka, paslanmaz çelik şim stoğunda 0.008'den imal edilmiştir. Plakanın boyutları için bakınız Entenberg ve ark., 2018 [8].
Pencere ÇerçevesiNANA Pencere, 5 mm'lik bir lamel kabul eden merkezi bir açıklığa sahip çelik bir çerçeveden oluşur. Çerçevenin çevresi etrafındaki 1,75 mm'lik bir oluk, periton kası ve cilt katmanlarının yapışması için alan sağlar. Bkz. Entenberg ve diğerleri, 2018 [8].
Corning DPBS

Kaynaklar

  1. Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).
  3. Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338(2017).
  4. Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
  5. Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
  6. Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
  7. Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  9. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145(2012).
  10. Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
  11. Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773(2016).
  12. Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
  13. Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  14. Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
  15. Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273(2022).
  16. DeBold, T. A. M., James, W. How To Passivate Stainless Steel Parts. , https://www.mmsonline.com/articles/how-to-passivate-stainless-steel-parts (2003).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  18. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  19. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563(2011).
  20. Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
  21. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793(2018).
  22. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042(2016).
  23. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
  24. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  25. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603(2016).
  26. Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115(2018).
  27. Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
  28. Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
  29. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
  30. Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
  31. Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Pankreas StabilizasyonuPankreas AdenokarsinomuPankreatit ModeliTümör Hücresi MigrasyonuTek Hücre GörüntülemePencere İmplantasyonuSubselüler DinamiklerSeri Görüntüleme
Murin Pankreasın İntravital Görüntülenmesi için Stabilize Pencere
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.