Yöntem makalesi

İnsan Osteosarkom Hücrelerinde Uzun Kodlamayan RNA Lokalizasyonu için RNA Floresan In Situ Hibridizasyon

DOI:

10.3791/65545

⸱

16 Haziran 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, insan osteosarkom hücrelerinde lncRNA'ları lokalize etmek için bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanser hücrelerinin proliferasyonunu, epitelyal-mezenkimal geçişini (EMT), göçünü, infiltrasyonunu ve otofajisini düzenlemek gibi uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA'lar) kanserdeki önemli rolleri incelenmiştir. Hücrelerdeki lncRNA'ların lokalizasyon tespiti, işlevleri hakkında fikir verebilir. lncRNA'ya özgü antisens zincir dizisini tasarlayarak ve ardından floresan boyalarla etiketleyerek, lncRNA'ların hücresel lokalizasyonunu tespit etmek için RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) uygulanabilir. Mikroskopinin geliştirilmesiyle birlikte, RNA FISH teknikleri artık zayıf ifade edilen lncRNA'ların görselleştirilmesine bile izin veriyor. Bu yöntem sadece tek başına lncRNA'ların lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda çift renkli veya çok renkli immünofloresan kullanarak diğer RNA'ların, DNA'nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir. Burada, insan osteosarkom hücrelerinde (143B) lncRNA küçük nükleolar RNA konak geni 6 (SNHG6) kullanılarak, RNA FISH deneyi yapmak isteyen araştırmacılara, özellikle lncRNA FISH deneyi yapmak isteyen araştırmacılara referans olması açısından RNA FISH'in detaylı deneysel çalışma prosedürü ve önlemlerine örnek olarak yer verdik.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan genomu hakkındaki anlayışımız, tüm genom teknolojisindeki son gelişmelerle büyük ölçüde genişledi. İnsan genomunun yaklaşık% 93'ü RNA'lara kopyalanabilir, ancak RNA'ların sadece% 2'si proteinlere çevrilebilir; protein translasyon işlevi olmayan RNA'ların geri kalan %98'ine kodlamayan RNA (ncRNA)1 denir. Kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar) bir sınıfı olarak, 200'den fazla nükleotid2 içeren uzun ncRNA'lar (lncRNA'lar), hücrelerin farklılaşma, döngü kontrolü, apoptoz, göç ve invazyon gibi birçok fizyolojik ve patolojik sürecine dahil olmaları nedeniyle artan bir ilgi görmüştür 3,4,5

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerin, reaktiflerin ve aletlerin ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın. Şekil 1 , RNA FISH için genel protokolü göstermektedir; Tablo 1 , tüm çözeltilerin bileşimini içerir ve Tablo 2 , bu protokolde kullanılan primer dizilerini içerir.

1. Prob hazırlığı

  1. İlgilenilen bir hedef lncRNA'nın FASTA dizisini tanımlayın ve edinin, örneğin GenBank'tan (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Web sitesindeki endikasyonları takiben, ISH problarını çevrimiçi olarak tasarlayın19 ve Cy3....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan osteosarkom hücrelerinde SNHG6 FISH'in temsili görüntüleri gösterilmiştir (Şekil 2). Negatif kontrol, negatif Ctrl probu ile tedavi edilir; pozitif kontrol U6 probu 20 ile tedavi edilir. SNHG6 probu ve U6 probu, kırmızı floresan yayan Cy3 ile etiketlenmiştir. DAPI, mavi floresan yayan DNA'yı boyayan bir boyadır. Bu sonuç, SNHG6'nın esas olarak sitoplazmada lokalize olduğunu göstermektedir ve bu bilgi, SNHG6'nın daha fazla incelenmesi için önemli bir yön sağlayab.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu RNA FISH protokolü, yalnızca hücrelerdeki lncRNA'ların lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda hücrelerdeki diğer RNA'ların, DNA'nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir, bu da parafine gömülü dokulardaki lncRNA'ların yerini tespit etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu gibi durumlarda spesifik protokol farklıdır çünkü parafine gömülü dokuların mumdan arındırılması gerekir21. Bu deneysel prosedür 48 veya 96 oyuklu plakalarda uygulanabilir, ancak 384 oyuklu.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, (1) Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2020YFE0201600); (2) Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973877 ve 82174408); (3) Şangay Hastane TCM Hazırlığının Endüstriyel Dönüşümü İşbirlikçi İnovasyon Merkezi; (4) Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Bütçesi Kapsamındaki Araştırma Projeleri (2021LK047).

    

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Otomatik hücre sayacıShanghai Simo Biological Technology Co., LtdIC1000Sayma hücreleri
Hücre kültürü plakası-12Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd3513, corningLamelleri tabağa yerleştirin
  Hücre hattı (143B)Çin Bilimler Akademisi Hücre BankasıCRL-8303osteosarkom kanseri hücre hattı
Santrifüj tüpü (15 mL, 50 mL)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, CorningHücreleri Santrifüjleyin
Lameller ShanghaiYueNian Biotechnology Co., Ltdabs7026Hücreler lameller üzerine ekilir
Cy3 etiketi-SNHG6 DNA probuShanghai GenePharma Co.,LtdA10005SNHG6 konumunu tespit
DMEM ortamıShanghai YueNian Biotechnology Co., LtdLM-E1141Hücre kültürü ortamı
Kuru Banyo İnkübatörüHaimen Kylin-Bell Laboratuvar Aletleri Co., Ltd.DKT200-2 Farklı yüksek sıcaklıklarda inkübasyon
Etanol% 100 ve nbsp;Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218dehidrasyon
Floresan mikroskobuShanghai Waihai Biotechnology Co., LTDOlympus BX43, Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympusGözlem ve konumlandırma
İnkübatörüShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDDHP-9051Numuneler 37 ° C'de inkübe edildi.
Montaj OrtamıSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E675004Lamelleri sürgüye takın
ÇalkalayıcıHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.TS-8SYıkama numunesi
Slayt ShanghaiYueNian Biotechnology Co., Ltd188105Lameller sürgü Triton
X-100Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600198Geçirgen membran ve nükleer membran
  Tripsin (% 0.25)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd25200056, Gibcotripsin hücrelerinin tedavisi
Tween-20Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600560deterjan
et üzerine yerleştirilir.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular B....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RNA FISHUzun Kodlamayan RNAlncRNA LokalizasyonuSNHG6 TespitiFloresan HibridizasyonSitoplazmik LokalizasyonDAPI BoyamaProb aretlemeH cre K lt r

İlgili makaleler