Mevcut protokol, insan osteosarkom hücrelerinde lncRNA'ları lokalize etmek için bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini açıklamaktadır.
Yöntem makalesi
* These authors contributed equally
Mevcut protokol, insan osteosarkom hücrelerinde lncRNA'ları lokalize etmek için bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini açıklamaktadır.
Kanser hücrelerinin proliferasyonunu, epitelyal-mezenkimal geçişini (EMT), göçünü, infiltrasyonunu ve otofajisini düzenlemek gibi uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA'lar) kanserdeki önemli rolleri incelenmiştir. Hücrelerdeki lncRNA'ların lokalizasyon tespiti, işlevleri hakkında fikir verebilir. lncRNA'ya özgü antisens zincir dizisini tasarlayarak ve ardından floresan boyalarla etiketleyerek, lncRNA'ların hücresel lokalizasyonunu tespit etmek için RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) uygulanabilir. Mikroskopinin geliştirilmesiyle birlikte, RNA FISH teknikleri artık zayıf ifade edilen lncRNA'ların görselleştirilmesine bile izin veriyor. Bu yöntem sadece tek başına lncRNA'ların lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda çift renkli veya çok renkli immünofloresan kullanarak diğer RNA'ların, DNA'nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir. Burada, insan osteosarkom hücrelerinde (143B) lncRNA küçük nükleolar RNA konak geni 6 (SNHG6) kullanılarak, RNA FISH deneyi yapmak isteyen araştırmacılara, özellikle lncRNA FISH deneyi yapmak isteyen araştırmacılara referans olması açısından RNA FISH'in detaylı deneysel çalışma prosedürü ve önlemlerine örnek olarak yer verdik.
İnsan genomu hakkındaki anlayışımız, tüm genom teknolojisindeki son gelişmelerle büyük ölçüde genişledi. İnsan genomunun yaklaşık% 93'ü RNA'lara kopyalanabilir, ancak RNA'ların sadece% 2'si proteinlere çevrilebilir; protein translasyon işlevi olmayan RNA'ların geri kalan %98'ine kodlamayan RNA (ncRNA)1 denir. Kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar) bir sınıfı olarak, 200'den fazla nükleotid2 içeren uzun ncRNA'lar (lncRNA'lar), hücrelerin farklılaşma, döngü kontrolü, apoptoz, göç ve invazyon gibi birçok fizyolojik ve patolojik sürecine dahil olmaları nedeniyle artan bir ilgi görmüştür 3,4,5. LncRNA'lar, kromatin yapısını ve nükleer gen ekspresyonunu düzenlemek, mRNA ekleme sürecini kontrol etmek ve transkripsiyon sonrası modifikasyon6 gibi çeşitli mekanizmalar yoluyla rollerini oynarlar. LncRNA'lar, hem transkripsiyonel hem de transkripsiyon sonrası seviyelerde malignitelerin oluşumunu, gelişimini ve metastazını düzenler. Transkripsiyonel regülasyon, kromozomal yapılara bağlanarak RNA transkripsiyonunu etkileyerek çekirdekte gerçekleştirilirken, transkripsiyon sonrası regülasyon, endojen rekabetçi bir RNA (ceRNA) mekanizması 5,7,8 aracılığıyla hedef genlerin kontrol edilmesiyle sitoplazmada gerçekleştirilir. CeRNA, yeni bir RNA etkileşimi mekanizması ortaya çıkardı, yani lncRNA'lar, miRNA'ları adsorbe etmek ve ilgili hedef genlerin miRNA aracılı bozunmasını inhibe etmek için bir sünger görevi görebilir9. Bu nedenle, lncRNA'ların hücre altı lokalizasyonu ile ilgili bilgiler, belirli bir lncRNA'nın sitoplazmada mı yoksa çekirdekte mi bulunduğu, biyolojik işlevlerini tanımlamaya yardımcı olmak için önemlidir.
Şu anda, lncRNA lokalizasyonu esas olarak iki yöntemle tespit edilmektedir, biri nükleus/sitoplazma fraksiyon izolasyon deneyi ve diğeri RNA BALIĞI ile. İlkinde, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlardaki RNA'lar sırasıyla ekstrakte edilir ve daha sonra sitoplazma ve çekirdekteki lncRNA'ların oranını tespit etmek için spesifik lncRNA primerleri ile PCR amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu yöntemin avantajı zaman verimliliği iken, dezavantajı gerçek lncRNA lokalizasyonunun sitoplazma ve çekirdekteki lncRNA'ların nispi oranı tarafından doğrudan yansıtılmamasıdır. RNA FISH, lncRNA'ya özgü antisens zincir dizilerinin tasarımı ve ardından floresan boyalarla etiketleme yoluyla hücrelerdeki lncRNA lokalizasyonunu tespit edebilir10. RNA FISH yöntemleri, florofor etiketli çoklu oligo prob setleri11, LNA probları12 ve dallanmış DNA (bDNA) probları13 dahil olmak üzere prob teknikleri ve tespit yöntemlerindeki gelişmelerle geliştirilmiştir. RNA FISH sadece lncRNA'nın lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda çift renkli veya çok renkli immünofloresan14 kullanarak diğer RNA'ların, DNA'nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir.
Bu çalışmada, RNA FISH ile osteosarkom hücrelerinde (143B) lncRNA küçük nükleolar RNA konak geni 6'nın (SNHG6) ayrıntılı hücre içi lokalizasyon saptama protokolünü örnek olarak dahil ettik. SNHG6, olgun eklenmiş formunda bir 600-730 nükleotid lncRNA'dır ve kolorektal kanser, mide kanseri, yumurtalık berrak hücreli karsinomu, osteosarkom ve hepatoselüler karsinomdahil olmak üzere çeşitli insan kanserlerinde yeni bir onkogen olarak tanımlanmıştır 15,16,17,18. Çalışmalar, SNHG6'nın proliferasyon, EMT ve otofaji gibi kanser hücrelerinin biyolojik davranışlarına katılımını doğruladı ve SNHG6'nın sitoplazmik lokalizasyonunu, miRNA'ları bağlayarak (süngerleyerek) hedef genleri etkileyebileceğini gösterdi15,16,17. RNA FISH tarafından SNHG6 hücre içi lokalizasyonunun bu ayrıntılı tespit protokolü burada sunulmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerin, reaktiflerin ve aletlerin ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın. Şekil 1 , RNA FISH için genel protokolü göstermektedir; Tablo 1 , tüm çözeltilerin bileşimini içerir ve Tablo 2 , bu protokolde kullanılan primer dizilerini içerir.
1. Prob hazırlığı
2. Hücre hazırlığı
3. Floresan in situ hibridizasyon (FISH)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
İnsan osteosarkom hücrelerinde SNHG6 FISH'in temsili görüntüleri gösterilmiştir (Şekil 2). Negatif kontrol, negatif Ctrl probu ile tedavi edilir; pozitif kontrol U6 probu 20 ile tedavi edilir. SNHG6 probu ve U6 probu, kırmızı floresan yayan Cy3 ile etiketlenmiştir. DAPI, mavi floresan yayan DNA'yı boyayan bir boyadır. Bu sonuç, SNHG6'nın esas olarak sitoplazmada lokalize olduğunu göstermektedir ve bu bilgi, SNHG6'nın daha fazla incelenmesi için önemli bir yön sağlayab...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu RNA FISH protokolü, yalnızca hücrelerdeki lncRNA'ların lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda hücrelerdeki diğer RNA'ların, DNA'nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir, bu da parafine gömülü dokulardaki lncRNA'ların yerini tespit etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu gibi durumlarda spesifik protokol farklıdır çünkü parafine gömülü dokuların mumdan arındırılması gerekir21. Bu deneysel prosedür 48 veya 96 oyuklu plakalarda uygulanabilir, ancak 384 oyuklu...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.
Bu çalışma, (1) Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2020YFE0201600); (2) Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973877 ve 82174408); (3) Şangay Hastane TCM Hazırlığının Endüstriyel Dönüşümü İşbirlikçi İnovasyon Merkezi; (4) Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Bütçesi Kapsamındaki Araştırma Projeleri (2021LK047).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Otomatik hücre sayacı | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Sayma hücreleri |
| Hücre kültürü plakası-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513, corning | Lamelleri tabağa yerleştirin |
| Hücre hattı (143B) | Çin Bilimler Akademisi Hücre Bankası | CRL-8303 | osteosarkom kanseri hücre hattı |
| Santrifüj tüpü (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Hücreleri Santrifüjleyin |
| Lameller Shanghai | YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | Hücreler lameller üzerine ekilir |
| Cy3 etiketi-SNHG6 DNA probu | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | SNHG6 konumunu tespit |
| DMEM ortamı | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Hücre kültürü ortamı |
| Kuru Banyo İnkübatörü | Haimen Kylin-Bell Laboratuvar Aletleri Co., Ltd. | DKT200-2 | Farklı yüksek sıcaklıklarda inkübasyon |
| Etanol% 100 ve nbsp; | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehidrasyon |
| Floresan mikroskobu | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43, Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Gözlem ve konumlandırma |
| İnkübatörü | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | Numuneler 37 ° C'de inkübe edildi. |
| Montaj Ortamı | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Lamelleri sürgüye takın |
| Çalkalayıcı | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Yıkama numunesi |
| Slayt Shanghai | YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | Lameller sürgü Triton |
| X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Geçirgen membran ve nükleer membran |
| Tripsin (% 0.25) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | tripsin hücrelerinin tedavisi |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | deterjan |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste