EEG Kayıtları Sırasında Sıçanlarda Lateral Kuyruk Veninden Beyin Omurilik Sıvısı ve Kan Örneği Alınması

Beyin omurilik sıvısı (BOS) ve kan örneklemesi, hem klinik öncesi hem de klinik araştırmalarda epilepsinin biyobelirteçlerini tanımlamak ve doğrulamak için önemlidir ^1,2. Günümüzde epilepsi tanısı ve epilepsi biyobelirteçleri ile ilgili araştırmaların çoğu EEG ve nörogörüntüleme üzerine odaklanmaktadır ^3,4,5. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar çeşitli sınırlamalar sunar. Rutin kafa derisi ölçümlerinin yanı sıra, çoğu durumda EEG, derinlik elektrotları gibi invaziv teknikler gerektirir⁶. Beyin görüntüleme yöntemleri zayıf zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahiptir ve nispeten pahalı ve zaman alıcıdır ^7,8. Bu nedenle, non-invaziv, düşük maliyetli ve biyoakışkan bazlı biyobelirteçlerin tanımlanması çok çekici bir alternatif sağlayacaktır. Ek olarak, bu biyoakışkan biyobelirteçleri, öngörücülüklerini keskinleştirmek için mevcut tanısal yaklaşımlarla birleştirilebilir.

Epilepsi teşhisi konan hastalar rutin olarak EEG ^9,10 ve kan örneklemesi 11,12,13,14'e ve birçoğu da hayatı tehdit eden nedenleri (yani akut enfeksiyonlar, otoimmün ensefalit) dışlamak için BOS yoksunluğuna ^{gönderilir15}. Bu kan ve BOS örnekleri, epilepsi için biyobelirteçleri tanımlamayı amaçlayan klinik araştırmalarda kullanılabilir. Örneğin, Hogg ve çalışma arkadaşları, insan epilepsisinde nöbet oluşumundan önce üç plazma tRNA fragmanındaki bir artışın olduğunu bulmuşlardır¹⁴. Benzer şekilde, insan BOS ve serumundaki interlökin-1beta (IL-1β) seviyeleri, BOS'taki IL-1β seviyelerinin seruma oranı olarak ifade edilir, travmatik beyin hasarı sonrası travma sonrası epilepsi gelişimini öngörebilir¹⁶. Bu çalışmalar, epilepsi biyobelirteçleri araştırmaları için biyoakışkan örneklemesinin önemini vurgulamaktadır, ancak klinik çalışmalara özgü birçok sınırlama ile karşı karşıyadırlar, örneğin, kandaki anti-epileptik ilaçların (AED'ler) kurucu faktörü, sık etiyoloji bilgisi eksikliği, yetersiz kontroller, mütevazı sayıda hasta ve diğerleri^17,18.

Klinik öncesi araştırmalar, epilepsi için potansiyel biyobelirteçler olarak biyosıvılardaki molekülleri araştırmak için başka fırsatlar sunar. Aslında, EEG kayıtları yapılırken hayvanlardan plazma ve/veya BOS çekilmesi mümkündür. Ayrıca, örnekleme, deneyin birkaç günü boyunca tekrar tekrar gerçekleştirilebilir ve çalışmanın sağlamlığını artırmak için bir dizi yaş, cinsiyet ve epileptik hakaret uyumlu kontroller kullanılabilir. Burada, EEG ile izlenen sıçanlarda kuyruk veninden plazmanın paralel olarak çekilmesi ile cisterna magna'dan BOS elde etmek için esnek bir teknik ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Sunulan tekniğin alternatif yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. Kelebek iğne yaklaşımı kullanılarak, EEG elektrotlarının veya benzer kafa implantlarının işlevinden ödün vermeden BOS birkaç kez toplamak mümkündür. Bu, nispeten yüksek bir enfeksiyon riski ile ilişkili olan intratekal kateter geri çekme prosedürlerinin iyileştirilmesini temsil eder. Ek olarak, kan alma için kullanılan bildirilen serbest düşüş düşürme yaklaşımı, kanın tüpten geçmemesi ve vakum basıncı uygulanmaması nedeniyle hemoliz riskinin oldukça azalması nedeniyle diğer kuyruk veni kan alma yaklaşımlarından daha üstündür. Sıkı mikropsuz koşullar altında gerçekleştirilirse, hayvanlar için özellikle düşük bir enfeksiyon riski vardır. Ek olarak, hayvanların kuyruklarının en sonunda kan çekilmeleri başlatılarak, örnekleme birkaç kez tekrarlanabilir. Bu tür tekniklerin ustalaşması kolaydır ve merkezi sinir sistemi bozukluklarının birçok klinik öncesi çalışmasında uygulanabilir.

Tüm deneysel prosedürler, deneysel ve diğer bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 24 Kasım 1986 tarihli Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi'nde (86/609/EEC) belirtilen yönergelere uygun olarak Ferrara Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve İtalya Sağlık Bakanlığı (yetkilendirme: DM 603/2022-PR) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol, sıçan BOS'undaki küçük kodlamayan ribonükleik asidin (sncRNA'lar) ve epileptik hayvanlarda EEG kontrolü altında elde edilen plazmanın daha fazla kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizleri için özel olarak ayarlanmıştır. İsteğe bağlı olarak, ameliyatın daha iyi anlaşılması ve iyileştirilmesi için lütfen ilgili JoVE videosuna bakın 19,20,21.

1. Elektrotların veya telemetrelerin cerrahi implantasyonu için hayvanların hazırlanması

NOT: Stereotaksik cerrahi tekniği kullanılan EEG sistemine göre değişmektedir. Aşağıdaki yöntem bölümü, iki tür ameliyat için ortak olan adımların bir açıklamasını sağlar.

1. Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için yerel yasalara uygun olarak muhafaza edilen Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını (erkekler, 7-8 haftalık, 250-290 g ağırlığında) kullanın. Hayvanları, yiyecek ve içme suyuna ücretsiz erişimle standart koşullar altında barındırın.
2. Ameliyattan ve deneysel protokol prosedürlerinden birkaç gün önce sıçanların işlenmesine devam edin.
3. Elektrotlar veya telemetre implantasyonu için stereotaksik bir aparat kullanın. Aseptik ameliyatlar için çağdaş standartları takip edin. Steril ve iyi çalışan elektrotlar ve vericiler kullanın.
4. Hayvanın kafasını elektrikli tıraş bıçağıyla tıraş edin. İntraperitoneal (i.p.) uygulanan ketamin (45 mg / kg) ve ksilazin (7.5 mg / kg) karışımı ile hayvanda anesteziyi indükleyin, daha sonra izofluran anestezisini (havada% 1.4; 1.2 mL / dak) ekleyin bir yüz maskesi ile verilir ve hayvanın kafasını stereotaksik aparata sabitleyin.
5. Her iki hayvanın arka ayaklarında ayak pedi sıkıştıktan sonra pedal çekme refleksini test ederek yeterli anestezi derinliğini sağlayın ve ameliyatın sonuna kadar izofluran anestezisini koruyun. İşlemin tüm süresi boyunca anestezi derinliğini düzenli olarak kontrol edin.
6. Anestezinin neden olduğu göz kırpma refleksi kaybı nedeniyle kornea hasarını önlemek için her iki hayvanın gözüne yeterli miktarda göz merhemi sürün.
7. Hayvanın kafa derisini sıvı dezenfektanla iyice temizleyin ve sterilize edilmiş bir neşter kullanarak uzunlamasına 2 cm uzunluğunda bir kesim yapın. Kafa derisini açın ve açık tutmak için cilt fleplerine cerrahi klipsler uygulayın.
8. Nazikçe, bregmayı ve kayıt elektrodunun yerleştirileceği kafatası alanını ortaya çıkarmak için periosteuumu ayırın.

2. Bağlı elektrotların cerrahi implantasyonu

NOT: Bu protokolün ponksiyon BOS geri çekme prosedürünü oluşturmadan önce (ayrıntılar için 9. adıma bakın), serbestçe hareket eden anestezi uygulanmamış birkaç sıçanda kılavuz kanül yoluyla tekrarlanan BOS çekimleri gerçekleştirildi. Çift başlı implantların uzun süreli EEG kaydı üzerindeki etkisini değerlendirmek için çoklu BOS örneklemesi ile birlikte bağlı elektrotlarla implante edilen kanüllü hayvanlar kullanıldı. Bu spesifik deneylerde, sıçanlara, daha önce yayınlanmış protokollere göre 7 mm stereotaktik olarak yerleştirilen cisterna magna'ya yerleştirilmiş sahte bir kılavuz kanül implante edildi²². Çift implant cerrahisi yaklaşımları, geçmişte bazı çalışanlar tarafından mikrodiyaliz kılavuz kanülleri ve bağlı elektrot implantasyonu için benimsenenlere benzerdi^23,24.

1. Stereotaksik çerçevenin bir kolunu kullanın, elektrot tutucuyu üzerine monte edin ve elektrodu tutucuya dik olarak yerleştirin. Elektrot ucunu tam olarak bregmanın üzerine getirin. Bregmanın ön-arka ve mediolateral koordinatlarını yazın ve bunları istenen koordinatlara çevirin.
2. Elektrodu, ucu neredeyse kafatasına değene kadar indirin. Delme noktasını işaretleyin ve kafatasını işaretli noktada delin. Beyne ve beyin zarlarına zarar vermemeye dikkat edin.
3. Vidaları sabitlemek için dört veya daha fazla delik açın ve bunları kafatasına vidalayın. Ankraj vidaları için delikler açarken elektrotun boyutuna dikkat edin. Elektrot boyutu, konumlandırılmış ankraj vidalarına müdahale etmemelidir.
4. Elektrodu taşıyan stereotaktik kolu dorsoventral eksen üzerinde yavaşça indirin, beyin dokusuna girin ve istenilen pozisyonda durun. Elektrot topraklama kablosunu kafatasına vidalanmış vidalardan birinin etrafına sabitleyin.
5. Metakrilik çimentoyu elektrot üzerine yerleştirin ve elektrot kaide yüksekliğinin yaklaşık yarısını kaplayan vidaları yerleştirin. Elektrotun bağlama telinin ucuna uyan üst yarısını çıplak bırakın.
6. Elektrodu tutucudan serbest bırakın ve stereotaktik kolu kaldırın. Hayvanı stereotaksik aparattan serbest bırakın ve postoperatif bakım verin.
7. Hayvanı ayrı bir kurtarma kafesine yerleştirin ve uyanık ve ayakta kalana kadar her 10 dakikada bir gözlemleyin. Hayvanı standart barınak kafesine ve anestezi uygulanmamış başka bir hayvan şirketine ancak tamamen iyileştikten sonra iade edin.

3. Telemetrelerin cerrahi implantasyonu

NOT: Yalnızca steril telemetreler kullanın. Telemetreler tekrar kullanılırsa, ameliyattan önce üretici talimatlarına göre temizleyin ve sterilize edin. Bu protokolde, EEG kaydı için bir veri bilimi Uluslararası (DSI) telemetreleri kullanılmıştır.

1. Bir mıknatıs kullanarak telemetri vericisini açın ve sinyali bir frekanslı radyo ile test edin. Ameliyattan önce güçlü ve net bir sinyal olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, kötü çalışan telemetreleri atın.
2. Telemetre uçlarını yetişkin sıçanlar için en uygun uzunluklarda kısaltarak hazırlayın. İki (negatif ve pozitif) uç üzerindeki silikon kaplamayı soyun ve yaklaşık 5 mm sarmal çelik ucu açığa çıkarın. Uçların ucunda yaklaşık 2 mm uzunluğunda ve 1 mm genişliğinde ilmekli bir tutamak oluşturun.
3. Hayvanın böğrünü sol omzun altından ve arkasından tıraş edin. Ameliyat bölgesini stabilize peroksitlere ve kuaterner amonyum aktivitesine dayalı dezenfektanla dezenfekte edin. Dezenfektanın 15 dakika etki etmesine izin verin.
4. Hayvanın omzunun hemen arkasında yaklaşık 2 cm'lik yanal kesi yapın ve vericinin yerleştirilmesi için yaklaşık 5^cm3'lük bir deri altı cebi yapın. Vericiyi, uçları rostral yöne yönlendirilecek şekilde gövdenin uzun eksenine paralel olarak yerleştirin.
5. Vericiyi 3-0 pamuklu bir sütür ile deri altı cebin iç duvarına sabitleyin. Künt uçlu makas kullanarak, hayvanın böğrü ve boynu boyunca deri altı tüneli (kabaca 2,5 cm uzunluğunda) oluşturun, böylece verici cebini adım 1.6'da hayvanın kafa derisinde yapılan orta hat kesisi ile bağlayın.
6. Her iki telemetre ucunu da forseps ile alın ve tünelden yukarı çekin, böylece kafa derisi kesi çıkışından çıkıntı yaparlar. Yara klipsleri ile derivasyondaki kesiden uçları uzak tutun.
7. Pozitif (kırmızı) kurşun için istenen koordinatları bireyselleştirmek için stereotaksik çerçeveyi kullanın ve pozitif kurşun ucu için kafatasına delik açın (adım 2.1'e benzer). Vidayı kürsüye yukarı doğru sabitlemek için bir delik daha açın ve kafatasına vidalayın.
8. Pozitif kurşunun ucunu takke ve duranın altına sokun ve beyin yüzeyine koyun. Negatif (beyaz) ucun ilmekli ucunu vidaya bağlayın. Kafatası üzerinde hareketsiz hale getirmek için pozitif kurşun çıkışının ve negatif ucun etrafına az miktarda metakrilik çimento koyun.
9. Uçları kafatası derisinin iç duvarına 3-0 pamuklu bir sütür ile sabitleyin. Sabit uçların ve sabitleme sütürünün BOS çekilme bölgesine müdahale etmeyeceğinden emin olun (yani, oksipital çıkıntı ile atlasın omurgası arasında eşkenar dörtgen görünümünde bastırılabilir bir yüzey).
10. Kafa derisi kesisini ve yan kesiyi 3-0 pamuklu bir dikiş kullanarak kapatın. Yaralara dezenfektan uygulayın. Ancak bunlar kuruduktan sonra, dikişli yaraların üzerine antibiyotikli bir krem sürün.

4. Ameliyat sonrası bakım

1. Ameliyattan sonra hayvanları yaklaşık 1 saat boyunca dik durana ve kafesin etrafında hareket edene kadar izleyin. Hipotermiyi önlemek için onları bir ısıtma yastığı üzerinde tutun. Enfeksiyonu önlemek için hayvanlara sistemik bir antibiyotik ve 2-3 gün boyunca ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için sistemik bir analjezik uygulayın.
2. Sıçanların cerrahi işlemlerden sonra en az 7 gün iyileşmesine izin verin. Hayvanları 3 gün boyunca günde en az bir kez ağrı veya sıkıntı belirtileri açısından izleyin.

5. Sıçanlarda status epileptikus indüksiyonu

NOT: Sıçanlarda mezial temporal lob epilepsisini (mTLE) çoğaltmak için gereken ayrıntılı bir status epileptikus (SE) indüksiyonu protokolü için Guarino ve ^ark.25'e bakın.

1. Ameliyat sonrası bir haftalık iyileşmeden sonra, hayvanları rastgele gruplara ayırın: (i) araç alan kontrol hayvanları ve (ii) pilokarpin alacak epileptik hayvanlar. Epileptik grup için orantılı olarak daha fazla sayıda hayvan kullanın, çünkü pilokarpin uygulanan tüm sıçanlar hayatta kalamaz veya SE geliştiremez.
2. SE indüksiyonundan bir gün önce, hayvanlara gastrik gavaj ile 1 mL / kg'lık bir hacim olarak% 0.9 salin (3M) içinde çözülmüş tek bir doz 127 mg / kg lityum klorür verin. SE başlangıcına kadar geçen süredeki değişkenliği azaltmak için SE indüksiyonundan yaklaşık 14 saat önce pilokarpin etkinliğini²⁶ artıran hayvanın lityumunu uygulayın.
3. Lityum uygulamasından yaklaşık 14 saat sonra, sıçanlara tek bir metil skopolamin enjeksiyonu (deri altından 1 mg / kg) verin.
4. Metil skopolamin uygulamasından tam olarak 30 dakika sonra, SE'yi indüklemek için sıçanlara tek bir pilokarpin enjeksiyonu (50 mg / kg, i.p.) verin.
   1. Pilokarpin enjeksiyonu hayvanlarda tipik davranışa neden olur: 25-30 dakika içinde tekrarlayan jeneralize konvülsiyonlara (SE) dönüşen erken kısmi nöbetler (pilokarpin uygulamasından sonra 5 dakika içinde vibrissae hareketleri ve baş sallamaları). 30 dakika içinde SE gelişmeyen sıçanlar için, ek bir pilokarpin dozu (25 mg / kg, i.p.) uygulayın ve hala SE geliştirmezlerse, onları çalışmadan hariç tutun (SE yanıt vermeyenler).
5. Pilokarpin enjeksiyonundan hemen sonra başlayarak her 5 dakikada bir sıçanlarda nöbet davranışını gözlemleyin ve puanlayın. ²⁷ puanlama için Racine ölçeğini kullanın.
6. Bir ilaç kokteylinin i.p. uygulanmasından 2 saat sonra SE'yi kesin: diazepam (10 mg / kg), fenobarbital (25 mg / kg) ve skopolamin (1 mg / kg).
7. Farelere bu kokteyli 4 saat sonra tekrar verin. Son olarak, 4 saat sonra, nöbet aktivitesini tamamen durdurmak için sıçanlara son ilaç karışımını (diazepam 10 mg / kg artı skopolamin 1 mg / kg) verin.
8. Hayvanlara serum fizyolojik (1 mL %0.9 NaCl çözeltisi, pH 7.0'a ayarlanmış) enjekte edin ve SE'yi takip eden vücut ağırlığı kaybından kurtulmayı desteklemek için SE'den sonra 2-3 gün boyunca %10 sükroz solüsyonu ile besleyin.
9. SE sonrası hayatta kalan hayvanları, spesifik deney protokolünün gereksinimlerine göre rastgele farklı deney gruplarına atayın. Epileptik sıçanlarda daha ileri deneyler için aşağıdaki dahil etme / dışlama kriterlerini kullanın: pilokarpin uygulamasından sonraki 1 saat içinde konvülsif SE gelişimi, SE'den sonraki ilk hafta kilo alımı ve EEG kayıtları için elektrotun ilgilenilen beyin bölgesinde doğru konumlandırılması²⁵.

6. Epileptik sıçanlarda bağlı video-EEG ve nöbet aktivitesi analizleri

NOT: Bu bölüm, standart koşullar altında tek evli, serbestçe hareket eden sıçanlarda EEG sinyallerini kaydetmek için deneysel prosedürü açıklar. Kafes, hayvanın veya kayıt kablosunun sıkışabileceği nesneler içermemelidir. Ele alınacak bilimsel soruya bağlı olarak, çeşitli parametreler analiz edilebilir. Epilepsi araştırmalarında, EEG izleri elektrik ve motor nöbetleri tanımak için taranır. Bir nöbeti tanımlamak için kullanılan en yaygın parametreler, paroksismal elektriksel aktivitenin genliği, sıklığı ve süresidir.

1. Alışmaya izin vermek ve yeni ortamın neden olduğu stresi azaltmak için hayvanı kayıt odasında temiz bir kafese yerleştirin. EGG sinyalinin çevresel elektromanyetik alanla kirlenmesini önlemek için hayvanın kafesini bir Faraday kafesine yerleştirin.
2. Kayıt kablosunun bir ucunu kayıt cihazına bağlayın. Elektrik potansiyelini ölçmek ve toprak ile referans elektrotları arasında ayrım yapmak için bir voltmetre kullanın.
3. Kayıt kablosunun diğer ucunu farenin kafasına sabitlenmiş elektroda bağlayın. Bu amaçla, kablo fişini elektrot konektörüne takarken çimento kapağını hayvanın kafasında tutun ve farenin kafasına herhangi bir baskı uygulamaktan kaçının.
4. Kablonun bükülme riskini önlerken hayvanın serbest hareketine izin vermek için kayıt kablosunun ağırlığını dengeleyin. Bunu yapmak için, bir dengeleme kolu veya komütatörler kullanın. Kayıt kablosu dengelenmiş olsa bile, mayı, hayvanların yiyeceğe ulaşmak için yükselmesi gereken bir besleme tutucusu yerine kafesin içine koyun.
5. Kayda başlamadan önce, EEG'den veri almak ve işlemek için kullanılan tüm ayarları kontrol edin.
   NOT: Bu protokol, EEG kaydını gerçekleştirmek için gerekli aparata bir giriş sağlamaz, ancak EEG sinyallerinde artefaktları ve gürültüyü önlemek için yeterli filtreleme ve örnekleme oranları uygulanmalıdır.
   1. Rutin bir deney için örnekleme hızını 500 Hz'e ve amplifikasyon kazancını 5000x'e ayarlayın. 0.005 Hz bandında (Avrupa ülkelerine özel) çevredeki elektriksel aktiviteyi atmak için bir çentik filtresine ek olarak bir çentik filtresi kullanarak sinyali filtreleyin.
6. Hem video hem de EEG kayıtlarını başlatın ve zaman boyunca belirli frekans bantlarındaki gücü kontrol ederek izlerin beklenen bir EEG sinyaliyle eşleştiğinden emin olun. Hayvanlarda müdahalelere başlamadan önce bir başlangıç dönemi kaydedin.
7. Hayvanları ve EEG izlerini periyodik olarak kontrol edin. Bir kayıt kablosunun sıçan kafasındaki elektrot konektöründen ayrılması nadir değildir. Böyle bir durumda, sıçan kafasındaki elektrodu tekrar bir kayıt kablosuna bağlayın ve net bir EEG sinyali olup olmadığını kontrol edin.
8. Piyasada bulunan yazılımı kullanarak EEG sinyalini manuel veya otomatik olarak analiz edin. Manuel olarak analiz ediyorsanız, nöbet benzeri aktiviteleri belirlemek için EEG kaydı ile tarayın. Yazılım kullanılacaksa, bir nöbet olayının genlik, frekans ve elektriksel aktivite süresi gibi temel parametrelerini yapılandırın.
   NOT: Tek nöbet, taban çizgisinden 3 kat daha yüksek genliğe, 5 Hz'e eşit veya daha yüksek frekansa ve en az 5 s²² süreye sahip bir elektriksel aktivite ile karakterize edilebilir.
9. Kullanılan yöntem ne olursa olsun, EEG ile eş zamanlı olarak toplanan senkronize video kaydını kontrol ederek olası konvülsif nöbetleri doğrulayın.

7. Epileptik sıçanlarda telemetri video-EEG ve nöbet aktivitesinin analizi

NOT: Bu bölüm, standart koşullar altında tek evli, serbestçe hareket eden sıçanlarda radyotelemetri EEG sinyallerini kaydetmek için deneysel prosedürü açıklar. Protokol, ticari olarak temin edilebilen bir telemetri sistemine dayanmaktadır. Bununla birlikte, birkaç telemetri sistemi işlevsel ve teknik özelliklerinde biraz farklılık gösterir. Sistem, laboratuvar gereksinimlerine ve araştırma hedeflerine bağlı olarak seçilmelidir.

1. Hayvan ev kafesini sinyal alıcısının üzerine yerleştirin. Sinyal alıcısını veri toplama sistemine bağlayın ve bunu toplama yazılımı olan bir bilgisayara bağlayın.
2. Sıçan kanadına yerleştirilen telemetrenin yakınına bir mıknatıs yerleştirerek radyofrekans telemetri implantını açın. Bir radyo cihazı kullanarak sinyali test edin. Telemetreleri test etmek için evrensel bir radyo cihazı kullanın ve net bir bip sesi duyun, telemetrenin etkinleştirildiğini gösterirken, cızırtılı bir ses devre dışı bırakılmış bir telemetreyi gösterir.
   NOT: Kayıtların süresi tanımlanmadan önce radyo frekansı verici pilinin ömrü dikkate alınmalıdır.
3. Toplama yazılımını kurun ve EEG ve video verilerini aynı anda almak için telemetri sinyalini ve video sistemini senkronize edin. İmplante edilen her vericiye bir sinyal alıcısı atayın ve vericinin kalibrasyon değerlerini ayarlayın. Örnekleme hızını 1000 Hz'e, gürültü algılamayı -500 mV ile +500 mV arasında ve entegrasyon aralığını 100 ms'ye ayarlayın. Alçak ve yüksek geçiren filtreler kullanmayın.
4. Telemetri ve video kayıtlarını başlatın. Epileptik benzeri aktiviteyi elde etmeden önce uzun süreli temel kayıt yapın. EEG sinyalini adım 6.8 ve 6.9'da açıklandığı gibi analiz edin.

8. Kuyruk damarından kan alma prosedürü

NOT. Vakumlu kan alma sistemi bir kelebek iğneden (23 G x 3/4 x 12 (0.8 mm x 19 mm x 305 mm) oluşur. Kan alma tekniği tek operatör tarafından kolaylıkla yapılabilir ve işlem yaklaşık 5 dakika sürer.

1. Kelebek iğnesini ve hortumunu, çekme işleminden kısa bir süre önce damıtılmış suda %1_K2EDTA ile kaplayın, yani 1 mL şırınga kullanarak_K2EDTA çözeltisini çekin ve sistemden çıkarın. Aspirasyon olmadan damla damla kan toplamak için iğnenin hemen arkasındaki hortumu kesin (Şekil 1A).
2. Sıçanı bir indüksiyon odasına yerleştirin ve izofluran ile uyuşturun (havada% 1.4; 1.2 mL / dak). Stereotaksik çerçeveye geçin ve bir yüz maskesi ile anesteziyi koruyun. Isıtma yastığını, kuyruğunun bir kısmını ped ile doğrudan temas halinde tutarak hayvanın altına koyun.
3. Yanal kuyruk damarı üstte tutulacak şekilde hayvanın sırtını yavaşça yana doğru hareket ettirin.
4. Yan damarı genişletmek için kuyruğu 2 dakika ılık suya (42 °C) batırın. Damarı daha görünür hale getirmek için kuyruğu %70 etanol ile silin. Normal bir akkor ampul kullanarak kuyruğa ılık ışık koyun.
5. 21G kelebek iğneyi 5 mm derinlikte ve 20° açıyla yanal kuyruk damarına sokun. Antikoagülan olarak 5 mg_K2EDTAiçeren 500 μL'lik bir vakumlu toplama tüpünde kan toplayın (Şekil 1B, C).
6. İğneyi çıkarın ve delinme bölgesine baskı uygulayarak kan akışını durdurun. Fareyi ev kafesine geri koyun.
7. Kandaki antikoagülanı karıştırmak için tüpü yavaşça 10x ters çevirin. Toplama tüplerini yerleştirmek için buzun içine yaklaşık 1,5 cm derinliğinde delikler açın. Numuneyi nazikçe ve dikey olarak buzun üzerine koyun.
8. Plazmayı ayırmak için kan örneğini soğutmalı bir santrifüjde (4 °C) 1300 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. Bu işlemi en fazla 1 saat içinde gerçekleştirin.
9. Kırmızı ve beyaz kan hücresi tabakasından kaçınarak yaklaşık 200 μL plazma alın. Çekilen plazmayı 0.2 mL steril mikrotüpe koyun. Gerekirse, santrifüjlemeden sonra 4 °C'de 1 saate kadar saklayın.
10. Kalite kontrol için 5 μL numuneyi bir kenara koyun. Numuneyi analize kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Bazı araştırmacılar²⁸ tarafından önerilse bile vakumu kullanmayın veya daha fazla kan elde etmek için adım 8.5'te açıklanan prosedürler sırasında kuyruğu sağmayın, çünkü sonraki sncRNA kantifikasyon analizleri için numune kalitesini düşürür (ayrıntılar için lütfen Temsili Sonuçlara bakın). Sıçanlarda, bir seferde çekilebilecek maksimum kan miktarının toplam kan hacminin% <10'u (yani, 250-300 g sıçanda yaklaşık 1.6-1.9 mL) ve 1 ayda toplam kan hacminin% <15'i (yaklaşık 2.64 mL)^{olduğunu unutmayın 29}. Bu protokolde, tek bir hayvanda beş defaya kadar tek seferde maksimum 500 μL kan alınması kullanılır^30,31.

9. BOS toplama prosedürü

NOT. Tek bir operatör tarafından kolayca uygulanabilen teknik, yaklaşık 2-4 dakika sürer. BOS'un toplanması için kullanılan malzemeler düşük maliyetli, tek kullanımlık vakumlu kelebek iğneler ve ekstraksiyon tüpleridir. Bu protokolde, vakumu oluşturmak için steril bir şırıngaya bağlı kelebek kanatlı bir infüzyon seti kullanılır (Şekil 2A).

1. 23G kelebek iğneyi, çekme sırasında cisterna magna'ya 7 mm'den daha derine nüfuz etmesini önlemek için çıplak iğnenin ucu 7 mm açıkta kalacak şekilde plastik manşon korumasını keserek hazırlayın (Şekil 2B).
2. Polimer boru ile donatılmış kelebek iğneyi 1 mL'lik bir şırıngaya bağlayın.
3. Sıçanı bir indüksiyon odasına yerleştirin ve izofluran ile uyuşturun (havada% 1.4; 1.2 mL / dak). İzofluran akışını stereotaksik çerçeveye geçirin ve bir yüz maskesi ile verilen anesteziyi koruyun. Sıçanın arka başındaki ve boynundaki kürkü bir usturayla çıkarın.
4. Sıçanın kafasını kulak çubuklarıyla sabitleyin. Stereotaksik çerçevenin burun çubuğunu aşağı doğru hareket ettirerek hayvanın başını dikey olarak yaklaşık 45° aşağı indirin (Şekil 2C). Hayvanın arka kafasını inceleyin ve oksipital çıkıntı ile atlas omurgası arasında eşkenar dörtgen yönüyle hafif basık bir yüzey bulun.
5. Daha görünür hale getirmek ve dezenfekte etmek için bu yüzeyi% 70 etanol ile ovalayın.
6. Kelebek iğneyi, iğnenin plastik manşon korumasını boyutlandırarak kesilerek hareket engellenene kadar BOS toplama için eşkenar dörtgen şeklindeki bastırılmış yüzeyin ortasına dikey olarak cisterna magna'ya sokun (Şekil 2D). BOS'un iğneden yavaşça akmasına izin vermek için 1 mL şırınga pistonunu yavaşça geri çekin.
7. Yaklaşık 100 μL BOS'u polimer boruya toplayın (Şekil 2D). Kan veya diğer görünür kontaminasyonlardan kaçının. Polimer boruyu kelebek iğneye çok yakın sıkıştırın ve boruyu bu noktada kesin.
8. Berrak (kirlenmemiş) numuneyi şırıngaya çekin. Toplama borusuna görünür kontaminasyon girerse, kontamine numuneyi atın.
9. Numuneyi steril 0,2 mL mikrotüpe boşaltın ve 1 saate kadar buz üzerinde saklayın.
10. Hayvanın kafasındaki BOS çekilme bölgesini dezenfekte edin. Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve kafesine geri koyun.
11. Kalite kontrol için numunenin 2 μL'sini bir kenara koyun. Daha fazla analiz için numunenin geri kalanını -80 °C'de saklayın.
    NOT: Sıçanlarda, tekrar tekrar birden fazla BOS çekilmesi gerçekleştirilirse, her koleksiyonda çekilmesi önerilen hacim 100 μL'dir³². Bu protokolde, tek bir hayvanda 15 günde 5x maksimum geri çekilme ile tek seferde maksimum 100 μL BOS yapıldı.

10. Numunenin kalitesinin spektrofotometri analizi

NOT: BOS ve plazma numunelerinin uygun şekilde toplanmasından sonra, numuneler spektrofotometre analizleri için hazırdır ve herhangi bir özel işlem gerektirmez. Numunelerde hemoliz riskini değerlendirmek için 414 nm'de UV spektrofotometrisi ile hemoglobin absorbansını ölçün. Sıçan örneklerinde 0.25'lik bir kesme absorbans değeri kullanın. Bu sınırın seçimi, sonraki qPCR analizine ve sncRNA'ların miktar tayini için özel gereksinimlerine bağlı olabilir.

1. UV spektrofotometresini açın. PLASMA veya CSF için 414 nm'lik tek bir dalga boyunda absorbans ölçümü için yöntemi seçin. Sonrakine tıkla.
2. 1 mm'lik küveti arıtılmış suyla durulayın. Küvet ölçüm noktasına 5 μL %70 etanol koyun. Bir kağıt havluyla kurulayın ve tüy bırakmayan kağıt mendille ovalayın. Tamamen şeffaf olup olmadığını kontrol edin.
3. 1 mm'lik küvetin içine 1,5 μL arıtılmış su koyup kapatınız. Küveti spektrofotometrenin ölçüm odasına yerleştirin ve Boş düğmesine tıklayarak boş numune emilimini ölçün. 414 nm'deki absorbans değerinin 0.000 olduğunu kontrol edin.
4. Küveti bir kağıt havluyla kurulayın ve tüy bırakmayan kağıt mendille temizleyin. Tamamen şeffaf olup olmadığını kontrol edin.
5. 1.5 μL numuneyi 1 mm'lik küvete koyun ve kapatın. Küveti spektrofotometrenin ölçüm odasına yerleştirin. Numune düğmesine tıklayarak numuneyi ölçün. Numunenin absorbansını 414 nm'de kontrol edin ve açıklama ekleyin.
6. Mevcut tüm örneklerde hemoglobin emilimini ölçmeye devam edin. Alternatif olarak Boş ve Numune düğmelerine tıklayarak boş numuneyi herhangi bir plazma veya BOS numunesinden önce ölçün.
7. Numuneleri -80 °C'de A414 nm < 0.25 ile koruyun ve A414 nm 0.25 > ise numuneleri atın.
8. 1 mm'lik küveti sırayla arıtılmış su ve %70 etanol ile durulayın. Küveti kurutun.
9. Tozlanmasını önlemek için boş küveti ölçüm odasına kapatın. Spektrofotometreyi kapatın.

Tümü SE'den 1 ay sonra elektrot implante edilen 9 kontrol ve 18 kronik epileptik sıçanda gerçekleştirilen farklı BOS ve kan alma işlemlerinin sonuçları başarı oranı açısından bildirilmiştir. İmplantasyondan sonra, tüm sıçanlar 1 ay boyunca video-EEG izlendi, bu süre zarfında BOS artı kan, deneyin son iki haftasında her 3 günde bir 5 kez çekildi (yani, 52, 55, 58, 61 ve 64. günlerde; dpSE sonrası). Farklı hayvanlarda çoklu geri çekilmeden elde edilen veriler, çift başlı implant donanımlı sıçanlarda (BOS çekilmesi için kanüllü) BOS toplamanın başarı oranını, sadece bağlı veya telemetri elektrotları implante edilmiş hayvanlarda BOS toplamanın başarı oranı (cisterna magna ponksiyonu ile gerçekleştirilir) ile karşılaştırmak için kullanıldı (Tablo 1). Farklı hayvanlarda, vakumlu kan alma veya kuyruk sağımının plazma örneklerinin kalitesi üzerindeki etkisi değerlendirildi (Tablo 2). Bu amaçla, serbest hemoglobin tespiti için 414 nm'de UV spektrofotometri analizi kullanılmıştır. İstatistiksel analizler için ticari yazılımlar kullanıldı ve Kruskal-Wallis veya post-hoc Tukey'in çoklu karşılaştırma testleri ile tek yönlü varyans analizi kullanıldı (p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi). Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilir.

Kanüllü ve delinmiş sıçanlarda çoklu BOS örneklemesinin başarı oranı
BOS, 3 sıçan grubunda 2 hafta içinde 5 kez örneklenmiştir: (i) kanüllü ve bağlı elektrot implante edilmiş sıçanlar (CT hayvan grubu); bunlarda, BOS çekilmesi, anestezi uygulanmadığında ve video-EEG altında serbestçe hareket ettiğinde kukla kılavuz kanül ve PTFE boru eklemi yoluyla 1 mL şırıngaya gerçekleştirildi; (ii) delinmiş (adım 9) ve gergin elektrot implante edilmiş sıçanlar (PT grubu); (iii) delinmiş ve telemetri elektrotu implante edilmiş sıçanlar (PTe grubu). Grup başına toplam 9 hayvan (6 epileptik ve 3 kontrol sıçanı) kullanıldı. 5 kattan fazla başarılı koleksiyon sayısı değerlendirildi. Başarı oranı delinmiş sıçanlarda benzerdi: bağlı sıçanlarda% 86.7 ± %5.8 ve telemetri elektrot implante edilmiş hayvanlarda% 88.9 ±% 4.8. Bunun yerine, kanüllü sıçanlarda, önemli ölçüde farklı olmasa bile oran azalmıştır (% 71.1 ±% 8.9, Tablo 1). Bu tür sonuçlar, hayvanların kafalarındaki kanülün tekrarlanan BOS örneklemesine müdahale edebileceğini ve uzunlamasına çalışmaları tehlikeye atabileceğini göstermektedir. Delme tekniği, elektrotlarla implante edilmiş hayvanlarda çoklu BOS çekilmesi için daha uygundur.

Vakum ve kuyruk sağımının plazma toplama yöntemi üzerindeki etkisi
SE sonrası 52, 55, 58, 61 ve 64. günlerde 9 sıçandan (6 epileptik ve 3 kontrol sıçan) 5x kan alındı ve plazma kalitesi hemoliz açısından görsel olarak ve 414 nm'de UV spektrofotometrisi ile değerlendirildi. Her sıçanda ilk numuneyi elde etmek için, 1 mL'lik bir şırıngaya bağlı 21G kelebek iğne ile vakumla geri çekme kullanıldı. İkinci numunede, kuyruk aynı anda sağılırken damla çekme ve 21G kelebek iğne sistemi kullanıldı. 3.-5. numuneyi almak için, kuyruğu sağmadan damla çekme prosedürü (9. adımda açıklanmıştır) kullanıldı.

Vakum kullanıldığında, görsel inceleme altında plazma pembe renkteydi ve 9 sıçan örneğinin ortalama absorbans değeri 0.647 ± 0.067 idi (Tablo 2, Şekil 3). İşlem sırasında kuyruk sağımı kullanıldığında da benzer sonuçlar elde edildi: 0.620 ± 0.043 ortalama absorbansa sahip pembe renkli plazma (Tablo 2, Şekil 3). Buna karşılık, yerçekimi özellikli damla çekme ve 21G kelebek iğne sistemi ile ortalama plazma absorbans değerleri önemli ölçüde azalmıştır (58 dpSE'de 0.226 ± 0.017; 61 dpSE'de 0.223 ± -0.09; 64 dpSE'de 0.226 ± 0.018; Tablo 2, Şekil 3) vakum veya kuyruk sağım yöntemi ile ilgili olarak. Ayrıca, damla plazma örnekleri esas olarak şeffaftı. Daha yüksek absorbans değerleri (52 ve 55 dpSE), numunelerin pembe rengiyle ilişkilidir (veriler gösterilmemiştir). Bu sonuçlar, analizler için çok yüksek kalitede numuneler elde etmek için son yöntemin en iyisi olduğunu gösterebilir.

Şekil 1: Plazma örnekleme iş akışının temel adımları. (A) Stereotaksik çerçevede kan alma ve sıçan için gerekli malzemeler, toplanmaya hazır; (B, C) Yan kuyruk damarına yerleştirilen 21G kelebek iğne ile kuyruğun büyütülmesi ve kan damlasının bir antikoagülan ile toplama tüpünün duvarlarından aşağı düşmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Beyin omurilik sıvısı (BOS) örnekleme iş akışının temel adımları. (A) Toplamadan kısa bir süre önce BOS çekilmesi ve stereotaksik çerçevede sıçan için gerekli malzemeler; (B) Cisterna magna'ya doğru penetrasyonu sağlamak için çıplak iğnenin ucu 7 mm açıkta kalacak şekilde plastik manşon korumasını keserek 23G kelebek iğne hazırlığı; (C) Sıçan kafası çekilme sırasında 45° aşağı doğru eğimlidir. (D) Cisterna magna'ya sokulan bir kelebek iğnesi ile eşkenar dörtgen bölgede büyütme. İşaretleyicinin ucuyla gösterilen, boruda yükselen BOS'a dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Plazma örneklerinin kalite değerlendirmesi. Serbest hemoglobin için 414 nm'de 5 zaman noktasında (52, 55, 58, 61 ve 64 günlük poststatus epileptikus, dpSE) 9 hayvanın plazma örneklerinde UV spektroskopisi ile farklı yöntemler kullanılarak ölçülen hemoliz derecesi: 52. gün - vakum tekniği; 55. gün - kuyruk sağım; 58-64. günlerde düşürme teknikleri kullanıldı. Damla tekniği ile elde edilen plazmada serbest hemoglobinde vakum ve kuyruk sağım yöntemlerine göre azalma anlamlıydı (*p <0.05 tek yönlü varyans analizi ve post-hoc Tukey'in çoklu karşılaştırma testine göre). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: CSF para çekme işlemlerinin başarı oranları. Üç deney hayvan grubunda tekrarlanan BOS yoksunluğunun başarı oranlarının karşılaştırılması, 5 gün boyunca başarılı geri çekilme yüzdesi olarak ifade edilir. 1 değeri, 100 μL'lik > berrak BOS'un başarılı bir şekilde çekilmesine atandı; sıfır değeri, 100 μL< ve/veya belirsiz BOS'un çekilmesine atandı. Kısaltmalar: Yok - örnekleme prosedürü sırasında kanül kaybı nedeniyle toplama olmaması (yalnızca CT hayvanları); CT - kanüllü bağlı; PT - delinmiş, bağlı; PTe - delinmiş telemetri elektrotları implante edildi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Plazma örneklerinde hemolizin değerlendirilmesi. Üç farklı kan örnekleme yöntemi kullanılarak 5 zaman noktasında hemoliz ölçümlerinin sonuçları: 52. gün - vakum tekniği; 55. gün - kuyruk sağım; 58-64. Günler Damla Teknikleri. >0.3 absorbans değerleri, numunelerin pembe rengi ile ilişkilidir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.