Yöntem makalesi

Fotokonversiyon Kullanarak Akciğer Metastazlarından Tümör Hücresi Yayılımının İzlenmesi

DOI:

10.3791/65732

⸱

7 Temmuz 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 2Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 4Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 5Montefiore Einstein Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 6Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 7Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 8Department of Cancer and Cellular Biology, Lewis Katz School of Medicine, Fox Chase Cancer Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer metastazlarından tümör hücresi yayılımını incelemek için, akciğer metastazlarının seçici fotokonversiyonu için cerrahi bir protokol ve ardından üçüncül organlarda redissemine tümör hücrelerinin tanımlanması için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metastaz - kanserin sistemik yayılımı - kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir. Metastaz genellikle primer tümörden gelen hücrelerin metastazları yaydığı ve tohumladığı tek yönlü bir süreç olarak düşünülse de, mevcut metastazlardaki tümör hücreleri de "metastazdan metastaz" veya "metastazdan metastaza tohumlama" olarak bilinen bir süreçte üçüncül bölgelerde yenidenyayılabilir ve yeni lezyonlara yol açabilir. Metastazdan metastaza tohumlama, metastatik yükü artırabilir ve hastanın yaşam kalitesini ve sağkalımını azaltabilir. Bu nedenle, bu fenomenin arkasındaki süreçleri anlamak, metastatik kanserli hastalar için tedavi stratejilerini geliştirmek için çok önemlidir.

Kısmen lojistik ve teknolojik sınırlamalar nedeniyle metastazdan metastaza tohumlama hakkında çok az şey bilinmektedir. Metastaz-metastaz tohumlama üzerine yapılan çalışmalar, öncelikle, metastaz-metastaz tohumlama olaylarının tam zamanlamasını veya bunları neyin teşvik ettiğini veya önlediğini inceleyen araştırmacılar için pratik olmayabilecek sıralama yöntemlerine dayanmaktadır. Bu, metastazdan metastaza tohumlama çalışmasını kolaylaştıran metodolojilerin eksikliğini vurgulamaktadır. Bunu ele almak için, akciğer metastazlarının seçici fotokonversiyonu için bir murin cerrahi protokolü geliştirdik ve burada açıkladık, akciğerden üçüncül bölgelere yeniden yayılan tümör hücrelerinin spesifik işaretlenmesine ve kader takibine izin verdik. Bildiğimiz kadarıyla, genomik analiz gerektirmeyen akciğerlerden tümör hücresi yeniden yayılımını ve metastazdan metastaza tohumlamayı incelemek için tek yöntem budur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metastaz, kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir1. Metastatik kanser, primer tümörden gelen hücreler vücuda yayıldığında ve uzak organlarda klinik olarak saptanabilir tümörlere çoğaldığında ortaya çıkar 2,3.

Metastaz genellikle tümör hücrelerinin primer tümörden yayıldığı ve uzak organları kolonize ettiği tek yönlü bir süreç olarak düşünülse de4, artan klinik ve deneysel kanıtlar daha karmaşık, çok yönlü bir sürecin oyunda olduğunu göstermektedir. Dolaşımdaki tümör hücrelerinin primer tümörü yeniden tohumlayabildiği gösterilmiştir (eğer hala yerindeyse)5,6,7,8,9 ve mevcut metastatik odaklardan gelen tümör hücreleri üçüncül bölgelere gidebilir ve yeni lezyonlara yol açabilir 10,11,12,13. Gerçekten de, son genomik analizlerden elde edilen kanıtlar, bazı metastatik lezyonların primer tümörden değil, diğer metastazlardan kaynaklandığını göstermektedir - "metastazlardan metastaz" veya "metastazdan metastaza tohumlama" olarak bilinen bir fenomen14,15,16. Metastazdan metastaza tohumlama, primer tümör çıkarıldıktan sonra bile hastalık sürecini devam ettirebilir, metastatik yükü artırabilir ve hastanın yaşam kalitesini ve sağkalımını azaltabilir. Bu nedenle, metastazdan metastaza tohumlamanın arkasındaki süreçleri anlamak, metastatik hastalığı olan hastalar için tedavi stratejilerini geliştirmek için çok önemlidir.

Potansiyel olarak ciddi klinik etkilere rağmen, kısmen lojistik ve teknolojik sınırlamalar nedeniyle metastazdan metastaza tohumlama hakkında çok az şey bilinmektedir. İnsan çalışmaları, klinik örneklerin yetersizliği ile sınırlıdır. Metastatik lezyonların klinik rezeksiyonu ve biyopsisi, tek yayılmış tümör hücrelerinin gizlenebileceği görünüşte sağlıklı organların biyopsisi gibi nadirdir. Bu, insan çalışmalarının tipik olarak yalnızca birincil tümörleri hala yerinde olan veya daha önce rezeke edilmiş ancak araştırmacılar için hala mevcut olan bireylerden alınan otopsi örnekleri kullanılarak mümkün olduğu anlamına gelir. Bu tür örnekler mevcut olduğunda, kanser ilerlemesinin soy analizleri, dizileme yöntemleri14 kullanılarak yapılmalıdır. Bununla birlikte, eşleşen primer tümörlerin ve metastazların toplu dizilimi, kapsamlı soy takibi için gereken duyarlılığa sahip değildir. Örneğin, bir lezyonun toplu dizilimi, eşleşen lezyonlarının hiçbirinde tespit edilemeyen bir alt klonu ortaya çıkarabilir. Bu durumda, bu alt klonun kökeni belirlenemez. Primer tümörde veya başka bir metastazda tespit sınırının altında bir frekansta mevcut olabilir veya bulunduğu metastatik lezyonun ilk kolonizasyonundan sonra ortaya çıkmış olabilir. Tek hücreli dizileme, artan hassasiyet sağlar, ancak yüksek maliyeti, bu tekniğin büyük ölçekli uygulamasını sınırlar. Bu çalışmaların retrospektif doğası, aynı zamanda geçici metastatik olaylar ve farklı zaman noktalarındaki hastalık manzarası hakkında sınırlı bilgi sağladıkları anlamına gelir.

Hayvan modellerinde, son teknolojik gelişmeler artık yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle ileriye dönük filogenetik haritalamayaizin vermektedir 17,18,19,20. Bu teknikler, CRISPR / Cas9 genom düzenlemesini, zamanla biriken kalıtsal mutasyonlar olan evrimleşen bir barkodla hücreleri tasarlamak için kullanır. Dizileme üzerine, her hücrenin soyu, 17,18,19,20 barkodunun mutasyon profiline göre izlenebilir. Gerçekten de, bu tür bir teknoloji zaten metastaz-metastaz tohumlamasını haritalamak için kullanılıyor. Yakın tarihli bir makalede, Zhang ve ark. kemik metastazlarındaki meme ve prostat kanseri hücrelerinin kemikten yeniden yayıldığını ve birden fazla organda ikincil metastazları tohumladığını göstermiştir21.

Bu yeni yöntemler, kanser ilerlemesinin ayrıntılı, yüksek çözünürlüklü filogenetik haritalarını oluşturmak için büyük bir potansiyele sahip olsa da, metastaz-metastaz tohumlama olaylarının kesin zamanlamasını ve bunları neyin teşvik ettiğini veya önlediğini inceleyenler için oldukça pratik değildir. Bu bilgi boşluklarını doldurmak, metastatik kanser anlayışımızı ve tedavimizi geliştirmek için çok önemlidir, ancak bu tür çalışmaları kolaylaştıracak teknolojilerde gözle görülür bir eksiklik vardır. Bu ihtiyacı karşılamak için, yakın zamanda tümör hücrelerini metastatik bir bölgede (akciğer) fotokonversiyon yoluyla spesifik olarak işaretlememize ve daha sonra onları üçüncül organlarda yeniden tanımlamamıza izin veren yeni bir teknik geliştirdik ve burada sunuyoruz. Bu tekniği kullanarak, yakın zamanda meme kanseri hücrelerinin akciğer metastazlarından yeniden yayıldığını ve üçüncül organları tohumladığını gösterdik13. Bu teknik aynı zamanda dar bir pencere içinde yeniden yayılma olaylarının zamanlamasını belirlemek ve yeniden döllenmiş tümör hücrelerini ölçmek için kullanılabilir, bu da redisseminasyon hücrelerinin organotropizminin ve yeniden yayılmayı neyin teşvik ettiğini/önlediğini araştırmayı kolaylaştırır.

Tümör hücrelerini işaretlemek ve izlemek için daha önce bir floresan proteini diğeriyle kalıcı olarak değiştiren fotokonversiyon ve lokal olarak indüklenebilir cre/lox sistemleri kullanılmış olsa da 11,22,23, bildiğimiz kadarıyla, tümör hücrelerinin uzay-zamansal işaretlenmesi için hiçbir yaklaşım, en yaygın 14 kanserden herhangi biri teşhisi konan kadın ve erkekler arasında en yaygın metastaz bölgelerinden biri olan akciğeri hedef alacak şekilde optimize edilmemiştir24. Herhangi bir kanser hücresi tipi ve akciğer metastazı üretimi için herhangi bir protokol prosedürümüzle birlikte kullanılabilir, bu da onu metastaz araştırmacıları için geniş ölçüde yararlı kılar. Akciğer metastazı oluşturmak için kullanılan tüm kanser hücreleri, fotokontabible veya foto-değiştirilebilir bir proteini ifade etmelidir ve araştırmacılar, özel ihtiyaçlarına ve kaynaklarına göre hangi proteini kullanacaklarını seçebilirler. Bu çalışmada, histon H2B'ye etiketlenmiş fotokonvertibl yeşilden kırmızıya floresan protein Dendra2'yi (6DT1-Dendra2 hücreleri)25 stabil bir şekilde eksprese eden 6DT1 meme kanseri hücrelerini kullandık. 5.0 × 104 6DT1-Dendra2 hücrelerini dişi Rag2-/- farelerin dördüncü meme yağ yastığına enjekte ettik. Primer tümörler enjeksiyondan 12 ila 16 gün sonra palpe edilebilir ve deney süresince rezeke edilmedi. Tümör hücre enjeksiyonundan 19-26 gün sonra spontan akciğer metastazları gelişti. Fotokonversiyon ameliyatları, tümör hücresi enjeksiyonundan 26 ila 29 gün sonra yapıldı. Fareler, akciğer metastaz yükü nedeniyle ameliyattan 72 saat sonra sakrifiye edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler, Albert Einstein Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından önceden onay da dahil olmak üzere, omurgalı hayvanların kullanımına ilişkin yönergelere ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Ameliyattan önce, farelerde akciğer metastazları, fotokonvertibl / foto-değiştirilebilir bir protein eksprese eden kanser hücreleri kullanılarak üretilecektir; Akciğer metastazı oluşumu için çeşitli protokoller yayınlanmıştır 26,27,28.

1. Ameliyata hazırlık

  1. Fare hazırlığı (epilasyon ve entübasyon), ameliyat ve iyileşme için farklı çalışma alanları hazırlayın.
  2. Tüm cerrahi aletleri bir otoklavda sterilize edin.
    NOT: Bu ameliyat için yalnızca uçlu bir teknik kullanıldığından, sonraki prosedürler için aletleri yeniden sterilize etmek için bir sıcak boncuk sterilizatörü kullanılabilir.
  3. Isıtmalı cerrahi platformu açın ve 37-40 °C'ye ulaşmasına ve stabilize olmasına izin verin.
  4. % 5 izofluran ile anesteziyi indükleyin ve ardından izofluranı% 3'e düşürün. Anestezi yeterliliğini değerlendirmek için prosedür boyunca periyodik olarak ayak parmağı sıkışma testleri yapın.
  5. Anestezi uygulanmış fareyi sağ lateral dekübit pozisyonuna getirin. Bölgeye tüy dökücü krem uygulayarak sol üst göğüs/yan gövdedeki tüyleri alın (bkz. Şekil 1A). Bir parça gazlı bez veya kağıt havluyu suyla nemlendirin ve saçı ve tüy dökücü kremi silin. Cerrahi alandan tüm tüyler alınana kadar gerektiği kadar tekrarlayın.
    NOT: Cilde zarar verebileceğinden tüy dökücü kremi fare üzerinde 20 saniyeden fazla bırakmayın.
  6. 2-0 ipek dikişle 22 G'lik bir kateterin tabanının ~3 mm yukarısına çift düğüm atın. 2 inç uzunluğunda kuyruklar bırakın.
  7. Fareyi daha önce tarif edildiği gibi bu kateter ile entübe edin29,30. Başarılı entübasyonu onaylamak için, kateterin ucuna bir şişirme ampulü takın ve hafifçe sıkın.
    NOT: Başarılı bir şekilde entübe edilen fareler, ampul sıkışması ile iki taraflı göğüs yükselmesi yaşayacaktır.
  8. Entübasyon kateterini yerinde tutmak için 2-0 ipek sütürü farenin burnunun etrafına çift düğümle sıkıca sabitleyin.

2. Akciğeri açığa çıkarmak için ameliyat

NOT: Cerrahi alanın kontaminasyonunu önlemek için fotokonversiyon dahil ameliyatın tüm adımlarını (Şekil 1) bir başlık veya laminer akış kabininde gerçekleştirin.

  1. Ellerinizi antiseptik sabunla yıkayın ve yeni steril eldivenler giyin.
    NOT: Bu ameliyat için sadece uçlu bir teknik kullanıldığından, steril olmayan eldivenler de kullanılabilir. Steril olmayan eldivenlerin alkol bazlı bir dezenfektanla sterilize edilmesi önerilir.
  2. 0.1 mg / kg'lık bir buprenorfin dozu (0.03 mg / mL) hazırlayın ve analjezi için deri altına enjekte edin.
    NOT: Lokal ağrı blokerleri ve steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar da dahil olmak üzere multimodal analjezi, ilgilenilen biyolojiye müdahale etmesi beklenmiyorsa, buprenorfin ile birlikte kullanılmalıdır.
  3. Kornea hasarını önlemek için her iki fare gözüne de oftalmik merhem sürün.
  4. Fareyi ısıtılmış cerrahi platform üzerinde sağ lateral dekübit pozisyonuna yerleştirin.
  5. Ventilatörü entübasyon kateterine bağlayın. Kateteri sabit tutmaya dikkat edin, çünkü hafif hareketler bile kateter yerleşimini bozabilir ve yetersiz havalandırmaya neden olabilir.
  6. Stabil, ventilatör kontrollü, iki taraflı göğüs yükselme ve düşüşünü gözlemleyin.
  7. Uzuvları etiketleme bandı ile cerrahi platforma sabitleyin. Farenin sırtına başka bir bant parçası yerleştirerek ve sırt derisini ve kürkü cerrahi platforma sabitleyerek cerrahi alanı stabilize edin (Şekil 1A).
  8. Sterilize edilmiş cerrahi aletleri açın.
  9. Ameliyat bölgesini sterilize etmek için farenin cildine klorheksidin solüsyonu uygulayın.
  10. Sternumun ~7 mm solundaki ve subkostal kenarın ~7 mm yukarısındaki alanı tanımlayın. Cildi forseps ile bu bölgenin üzerine kaldırın ve sadece cildi kesmeye özen göstererek keskin mikro diseksiyon makası kullanarak ~10 mm'lik dairesel bir kesi yapın.
  11. Göğüs kafesi üzerindeki yumuşak dokuyu çıkarın (Şekil 1B). Her iki uçtaki büyük damarları bir koter kalemi ile koterize edin.
    NOT: Derideki 10 mm'lik dairesel insizyonun altındaki tüm yumuşak dokuların eksize edilmesinin yanı sıra, çevreden bazı ek kas dışı yumuşak dokuların çıkarılması prosedürün sonraki adımlarını kolaylaştırır.
  12. Bir elinizle, 6. veya 7. kaburgayı yükseltmek için forseps kullanın. Öte yandan, göğüs duvarına paralel açılı, yuvarlak kenarı aşağı bakacak şekilde künt mikro diseksiyon makasının tek bir bıçağını kullanın ve göğüs boşluğuna girmek için 6. veya 7. interkostal kası dikkatlice delin (Şekil 1C). Makası gerektiği gibi hafifçe döndürün ve akciğer dokusuna dokunmamaya ve kaburgaları kesmemeye dikkat ederek interkostal boşlukta ~10 mm'lik bir kesi yapmak için kesin.
  13. Akciğer ve göğüs duvarı arasındaki boşluğu artırmak için basınçlı havayı interkostal insizyona doğru hassas bir şekilde boşaltın. Uygun akış gücünü bulmak için havayı önce kişinin bileğinden veya elinden boşaltın ve nozulu herhangi bir kalıntıdan arındırın, ardından akciğer hasarını önlemek için insizyonda kısa aralıklarla boşaltın.
  14. Bir elinizle, 6. veya 7. kaburgayı yükseltmek için forseps kullanın. Diğer elinizle ekartörü kapalı tutun ve interkostal insizyona yerleştirin. Ekartör bıçaklarını, akciğerin kendisine dokunmamaya dikkat ederek göğüs duvarına paralel olacak şekilde yönlendirin (Şekil 1D).
  15. Ekartör yerine oturduktan sonra, kolu yavaşça serbest bırakın ve ekartörün akciğeri açmasına ve açığa çıkarmasına izin verin (Şekil 1E). Şekil 2A , çıplak gözle nasıl göründükleri de dahil olmak üzere, fotokonversiyondan önce maruz kalan akciğer metastazlarının temsili görüntülerini ve geniş alan aydınlatması kullanılırken FITC (yeşil, fotokonversiyon yapılmamış) ve TRITC (kırmızı, foto dönüştürülmüş) floresan kanallarını göstermektedir.

3. Akciğer metastazı fotokonversiyonu

NOT: Aşağıdaki adımlarla ilgili ayrıntılar ve varyasyonlar Tartışma'da bulunabilir.

  1. Kurumayı önlemek için açıkta kalan akciğer dokusuna 37 °C'ye ısıtılmış 2-3 damla steril PBS uygulayın.
  2. Farenin üzerine küçük bir kesik ile bir parça steril alüminyum folyo yerleştirin. Kesikiyi doğrudan açıkta kalan akciğer dokusunun üzerine yerleştirin ve yalnızca açıkta kalan akciğerin fotodönüşümünü sağlamak için göğüs kafesinin yalnızca açık kısmını ve çevredeki yumuşak doku ve cildi birkaç milimetre açığa çıkaracak şekilde boyutlandırın.
  3. Fare ve alüminyum folyonun üzerine kesikli bir kutu yerleştirin. Kesikin doğrudan açıkta kalan akciğerin üzerinde olduğundan emin olun.
  4. Fotodönüştürme lambasını doğrudan kutudaki oyuğun üzerine yerleştirin (Şekil 1F).
  5. Fotokonversiyon lambasını açın ve açıkta kalan akciğer dokusunun 6 dakika boyunca sürekli aydınlatılmasına izin verin.
    NOT: Ventilatördeki fizyolojik izleme programlarını kullanarak farenin yaşamsal belirtilerini izleyin.
  6. Foto dönüştürmeden sonra lambayı kapatın ve lambayı, kutuyu ve alüminyum folyo maskesini fareden çıkarın.

4. Göğüs duvarını kapatma prosedürü

  1. Akciğeri göğüs duvarından ayırmak için 2.13 adımını tekrarlayın.
  2. Ekartör kolunu dikkatlice tutun ve bıçakları kapatmak için sıkın.
  3. Akciğer dokusuna dokunmamaya dikkat ederek kapalı ekartörü interkostal boşluktan dışarı doğru hareket ettirin.
  4. 5-0 ipek sütür kullanarak, interkostal insizyonu, insizyonun her iki tarafındaki kaburgayı içeren basit bir sürekli sütür deseni ile kapatın (Şekil 1G). Yara kenarlarının pozisyonel olduğundan emin olmak ve göğüs duvarının bütünlüğünü yeniden sağlamak için dikişi sıkıca çekin (Şekil 1H). İnterkostal kasları yırtabileceğinden dikişi aşırı sıkmamaya dikkat edin.
  5. Dikişin iki ucunu birbirine 4 kez düğümleyerek dikişi sabitleyin. Dikiş kuyruklarını düğüme mümkün olduğunca yakın kesin.
  6. Cildi cerrahi zımbalarla kapatın.
  7. 28 G iğne takılı 1 mL insülin şırıngası ile göğüs boşluğundaki fazla havayı alın. Ksifoid sürecini dokunsal olarak bulun ve diyaframdan göğüs boşluğuna girmek için sol omuza doğru ilerleyerek iğneyi hemen altına sokun. Şırıngayı ~ 1 mL'ye geri çekin; İğneyi fareden çıkarın ve havayı şırıngadan boşaltın. Bu işlemi 3-4 kez tekrarlayın.
    NOT: İç organları delmemeye dikkat edin. Ayrıca, daha büyük hacimli bir şırınga kullanmak ve tüm havayı bir kerede çıkarmaya çalışmak yerine 1 mL'lik bir şırınga kullanmak ve prosedürü 3-4 kez tekrarlamak önemlidir. Daha büyük hacimli bir şırınganın kullanılması, göğüs boşluğunda çok fazla vakuma neden olabilir ve akciğer dokusunun şişmesine ve hasarına neden olabilir.
  8. İzofluranı kapatın.
  9. Fare uyanma belirtileri gösterene kadar %100 oksijenle ventilasyona devam edin.
  10. Fare uyanma belirtileri gösterdiğinde, entübasyon kateterini ventilatörden ayırın, burnun etrafındaki dikişi kesin ve fareyi ekstübe edin.
  11. Fareyi banttan çıkarın ve bir ısı lambasının ~2 fit altına yerleştirilmiş temiz bir kafese aktarın. Tamamen iyileşene kadar izleyin. Fare solunum güçlüğü veya hareket kabiliyeti eksikliği belirtileri gösteriyorsa, 5 dakika boyunca% 5 izofluran ile uyuşturun, ayak parmağı sıkıştığında refleks kaybı gözlemleyerek yeterli anesteziyi sağlayın ve servikal çıkık yoluyla ötenazi yapın.
  12. Fare anesteziden tamamen uyandığında ve hareket etmeye başladığında, 0.1 mg / kg doz daha buprenorfin hazırlayın ve postoperatif analjezi için deri altına enjekte edin.
  13. Ameliyattan sonra farelerin ayrı ayrı yerleştirildiğinden emin olun. İçme suyunda antibiyotik sağlayın (enrofloksasin, son konsantrasyon 0.4 mg / mL).
  14. Ameliyatı takip eden 3 gün içinde, fareyi günde iki kez sıkıntı belirtileri açısından kontrol edin. Ağrı yönetimi için her 4-6 saatte bir deri altına 0.1 mg/kg buprenorfin (0.03 mg/mL) uygulayın. Enfeksiyon, hareketsizlik veya nefes alma güçlüğü belirtileri gösteriyorsa fareye ötenazi yapın. Üçüncü günden sonra fareler günde bir kez kontrol edilebilir.

5. Doku temizleme kullanılarak fotokonvertif hücrelerin numune işleme ve tespiti

  1. Fotokonversiyon ameliyatından sonra 3 ila 5 gün (veya istenen süre) arasında, fareyi %5 izofluran ile uyuşturun, indüksiyondan sonra izofluranı %5'ten %2.5'e düşürün, ayak parmağı sıkıştığında refleks kaybını gözlemleyerek yeterli anesteziyi sağlayın ve 10 mL oda sıcaklığında PBS ile bir terminal transkardiyal perfüzyon gerçekleştirin, ardından daha önce tarif edildiği gibi 4 ° C'ye soğutulmuş 10 mL %4 paraformaldehit uygulayın31.
  2. İlgilenilen organları toplayın ve daha önce açıklandığı gibi optik olarak temizleyin31.
  3. Temizlenmiş dokuları daha önce tarif edildiği gibi bir ışık tabakası mikroskobu ile görüntüleyin31. Alternatif olarak, temizlenmiş dokuları bir cam alt tabağa yerleştirin ve bir konfokal, dönen disk veya çoklu foton mikroskobu kullanarak yeşil (foto dönüştürülmemiş) ve kırmızı (foto dönüştürülmüş) hücreleri görselleştirmek için FITC ve TRITC kanallarında görüntüleyin.

6. Doku ayrıştırma kullanılarak fotokonvertif hücrelerin örnek işlenmesi ve tespiti

  1. Fareyi 5 dakika boyunca% 5 izofluran ile uyuşturun, ayak parmağı sıkıştığında refleks kaybı gözlemleyerek yeterli anesteziyi sağlayın ve fotokonversiyondan 3-5 gün sonra servikal çıkık ile fedakârlık yapın.
  2. İlgilenilen organları daha önce tarif edildiği gibi toplayın ve sindirin13.
  3. Sindirilmiş dokuları kaplayın ve daha önce tarif edildiği gibi gece boyunca yapışması için bir inkübatöre yerleştirin13.
  4. Ertesi gün, daha önce açıklandığı gibi yeşil (foto dönüştürülmemiş) ve kırmızı (foto dönüştürülmüş) hücreleri görselleştirmek için FITC ve TRITC kanallarındaki kaplanmış hücreleri görüntüleyin13.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde anlatılan ameliyatın adımları Şekil 1'de gösterilmiştir. Kısacası, fare uyuşturulur ve sol göğüs kafesinden kıllar çıkarılır. Fare daha sonra entübe edilir ve havalandırılır, bu da farenin göğüs boşluğu açıkken oksijen almasını sağlar. Göğüs kafesini ortaya çıkarmak için yumuşak doku çıkarılır ve 6. veya 7. interkostal kasta bir kesi yapılır. İnterkostal yikmeye bir ekartör yerleştirilir ve komşu kaburgaları yaymak ve sol akciğeri ve bunun üzerine fotokonv...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, akciğerdeki tümör hücrelerinin selektif fototransformasyonu için bir cerrahi protokol tanımlanmıştır. Bu teknik, araştırmacıların akciğerdeki tümör hücrelerini seçici olarak işaretlemelerini ve daha sonraki bir zaman noktasında onları vücutta yeniden tanımlayarak kaderlerini izlemelerini sağlar ve akciğer metastazlarından metastaz çalışmasını kolaylaştırır. Bu protokolü kullanarak, fotokonversiyon ile ameliyat geçiren farelerin beyin, karaciğer ve fotokonversiyon olmayan sağ akciğerindeki fotokonvertör hücrele...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, mikro bilgisayarlı tomografi (S10RR029545) konusundaki yardımları için Wade Koba'ya, Analitik Görüntüleme Tesisi'nden Vera DesMarais ve Hillary Guzik'e mikroskopi konusundaki eğitimleri ve yardımları için, Einstein Montefiore Kanser Merkezi'ne, Ulusal Kanser Enstitüsü'ne (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Gruss Lipper Biyofotonik Merkezi'ne, Kanser Araştırmaları için Entegre Görüntüleme Programı'na teşekkür eder. Sir Henry Wellcome Doktora Sonrası Bursu (221647/Z/20/Z) ve METAvivor Kariyer Geliştirme Ödülü.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0-30 V, 0-3 A Güç KaynağıMPJA9616 PS
12 VDC, 1.2 A Ayarsız Fiş BeslemesiMPJA17563 PD
28 G 1 mL BD İnsülin ŞırıngasıBD329410
400 nm ışık yayan diyot dizisi lambasıLedEngin Inc.897-LZPD0UA00Fotodönüşüm lambası, özel yapım (aşağıda ayrı parçalar dahildir)
5-0 RB-1 kesme iğneli örgülü ipek sütürEthicon, Inc.774B
9 cm 2-0 ipek kravatEthicon, Inc.LA55G
Baytril 100 (enrofloksasin)Bayer (Santa Cruz Biyoteknoloji)sc-362890Rxİçme suyunda kullanılan antibiyotik
BuprenorfinHospira0409-2012-32Analjezik
Kablolar (Kablo Montajları) 2.5 JK-ST 72" ZIP CDMouser172-0250
Klorheksidin çözeltisiDurvet7-45801-10258-3Klorheksidin Dezenfektan Solüsyonu
Basınçlı hava kabıFalconDPSJB-12
Ekstra İnce Mikro Diseksiyon Makası 4" Düz Keskin/Keskin 24 mmRoboz CerrahiRS-5912Keskin Mikro Diseksiyon Makası
Fiber optik aydınlatıcıOC White CompanyFL3000Fare entübasyonu sırasında kullanılır
Gemini Koter KitiHarvard Aparatı726067Koter kalemi
Germinator 500CellPoint BilimselGER  5287-120VBoncuk Sterilizatörü
Graefe forsepsRobozRS-5135
Yüksek güçlü LED'ler - tek renkli ultraviyole 90 wattMouserLZP-D0UA00
Kızılötesi ısı lambasıBraintree ScientificHL-1
Isofluran SOL 250 mL PVLCovetrus29405Anestezik İzofluran
buharlaştırıcıSurgiVetVCT302
Kilitli Jacobson iğne tutucuKalson SurgicalT1-140
Etiketleme bandıFisher ScientificS68702
LED Aydınlatma Reflektörleri CREE MP-L SNGL LENS REFLEKTÖRÜ & LOC PINMouser928-C11395TM
Uzun pamuk uçlu aplikatörlerMedline IndustriesMDS202055
Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4 / 3.4GHz'e kadar Celeron / Bilyalı Rulman / Bakır Çekirdek / CPU Soğutma FanıCompUSA#S457-1023
Mikro Diseksiyon Makası 4" Düz Künt/KüntRoboz CerrahiRS-5980Künt Mikro Diseksiyon Makası
Murin ventilatörKent Scientific PS-02PhysioSuite
Nair Tüy Dökücü LosyonAmazonB001RVMR7KTüy dökücü krem
Personnet mini ekartörRobozRS-6504Ekartör
Fosfat Tamponlu Salin 1xFisher Scientific14190144PBS
pLenti.CAG.H2B-Dendra2.WAddgene51005Dendra2 lentivirus
PuralubeHenry Schein Hayvan Sağlığı008897Göz Kayganlaştırıcı
Kemirgen entübasyon standıBraintree ScientificRIS 100
Küçük hayvan akciğer şişirme ampulüHarvard Aparatı72-9083
SurgiSuite Fareler için Çok Fonksiyonlu Cerrahi Platform, Isınmaile Kent ScientificSURGI-M02Isıtmalı cerrahi platform
Test Uçları 48" TEST UCU MUZ - SiyahMouser565-1440-48-0
Test Uçları 48" TEST KURŞUN MUZ - KırmızıMouser565-1440-48-2
Trakeal kateter ve nbsp;Exelint International2674622 G kateter
Yara kapatma sistemi veteriner kitiClay AdamsIN015Veteriner cerrahi zımbalama kiti

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
  2. Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
  5. Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575(2019).
  6. Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
  7. Kim, M. -Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  8. Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
  9. Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
  10. Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
  11. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  12. Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100(2020).
  13. Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340(2021).
  14. Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
  15. Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
  16. Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944(2017).
  17. Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
  18. Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804(2018).
  19. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907(2016).
  20. Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499(2017).
  21. Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
  22. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  23. Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
  24. Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Medicine. 7 (11), 5534-5542 (2018).
  25. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  26. Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  27. Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  28. Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
  29. Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h-y, Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  30. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  31. Hsu, C. -W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419(2022).
  32. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  33. Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
  34. Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
  35. Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
  36. Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
  37. Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
  38. Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
  39. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
  40. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
  41. Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
  42. Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
  43. Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154(2020).
  44. Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Akci er MetastazMetastaz EkimiFotokonversiyon Tekni iT m r H cresi TakibiMetastatik KanserDendra2 EtiketlemeIn Vivo G r nt lemeCerrahi ProtokolMavi I a Maruz B rakma

İlgili makaleler