Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İki Cinsiyette Multipl Sklerozun Modellenmesi: MOG35-55 ile İndüklenen Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit

3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65778

⸱

13 Ekim 2023

 ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit, multipl sklerozun en yaygın kullanılan murin modellerinden biridir. Mevcut protokolde, her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareleri, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi ile aşılanır ve bu da esas olarak kuyruk ve uzuvların artan parezi ile sonuçlanır. Burada EAE indüksiyonu ve değerlendirme protokolünü tartışıyoruz.

Özet

Multipl Skleroz (MS), merkezi sinir sistemini (MSS) etkileyen kronik otoimmün inflamatuar bir hastalıktır. Cinsiyetlerde farklı prevalans, erkeklerden daha fazla kadını etkileme ve erkeklerde kadınlardan daha agresif formlar gösteren farklı sonuçlar ile karakterizedir. Ayrıca MS, klinik yönleri, radyolojik ve patolojik özellikleri açısından oldukça heterojendir. Bu nedenle, patolojinin mümkün olduğunca çok yönünün araştırılmasına izin veren deneysel hayvan modellerinden yararlanmak gerekir. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), farelerde en çok kullanılan MS modellerinden birini temsil eder ve bağışıklık sisteminin aktivasyonundan CNS hasarına kadar farklı hastalık özelliklerini modeller. Burada, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptid 35-55 (MOG35-55) bağışıklaması kullanılarak hem erkek hem de dişi C57BL / 6J farelerinde EAE'nin indüksiyonu için bir protokol tanımlanmıştır, bu da hastalığın kronik bir formunun gelişmesine yol açar. Ayrıca, bu farelerin bağışıklamadan sonraki 28 gün boyunca günlük klinik skor ve motor performanslarının değerlendirilmesini de rapor ediyoruz (28 dpi). Son olarak, hastalığa bağlı hasarın birincil bölgesi olarak omuriliğe odaklanarak CNS düzeyinde bazı temel histolojik analizleri gösteriyoruz.

Giriş

Multipl Skleroz (MS), merkezi sinir sistemini (MSS) etkileyen kronik otoimmün inflamatuar bir hastalıktır. İnflamatuar hücrelerin perivasküler infiltrasyonu, demiyelinizasyon, aksonal kayıp ve gliozis1 varlığını gösterir. Etiyolojisi tam olarak bilinmemektedir ve klinik yönleri, radyografik ve patolojik özellikleri hastalıkta dikkate değer heterojenliği düşündürmektedir2.

Etiyolojisinin bilinmemesi ve karmaşıklığı nedeniyle, şu anda hiçbir hayvan modeli, insan MS'de görüntülenen tüm klinik ve radyolojik özellikleri özetlememektedir 3,4. Bununla birlikte, MS 3,4'ün farklı yönlerini incelemek için çeşitli hayvan modelleri kullanılmaktadır. Bu modellerde, hastalığın başlaması tipik olarak son derece yapaydır ve klinik belirtilerin başlama süresi insanlar ve fareler arasında farklıdır. Örneğin, insanlarda, hastalığın altında yatan patofizyolojik süreçler, klinik belirtilerin başlamasından yıllar önce tespit edilmez. Tersine, deneyciler MSindüksiyonundan sonraki haftalar hatta günler içinde hayvan modellerinde semptomları tespit edebilirler 4.

Üç temel hayvan modeli, MS'in karakteristiği olan demiyelinizasyon özelliklerini üretir: virüs kaynaklı olanlar (örneğin, Theiler'in murin ensefalomiyelit virüsü), toksik ajanlar tarafından indüklenenler (örneğin, cuprizone, lizolesitin) ve deneysel otoimmün ensefalomiyelitin (EAE) farklı varyantları5. Her model, hastalığın bazı spesifik yönlerini incelemeye yardımcı olur, ancak hiçbiri MS6'nın tüm özelliklerini kopyalamaz. Bu nedenle, belirli deneysel ihtiyaçları ve ele alınacak bilimsel soruları göz önünde bulundurarak doğru modeli seçmek çok önemlidir.

Miyelin türevi antijenlere karşı bağışıklama prosedürleri sayesinde, EAE, duyarlı farelerde CNS bileşenlerine otoimmün bir yanıtı tetikleyerek indüklenir. Çok çeşitli immünopatolojik ve nöropatolojik mekanizmalar arasındaki etkileşim, aşılanmış farelerde MS'in temel patolojik özelliklerinin (yani inflamasyon, demiyelinizasyon, aksonal kayıp ve gliozis) gelişmesine neden olur 7,8. Fareler, aşılamadan sonraki ikinci hafta civarında klinik semptomlar göstermeye başlar ve genellikle kuyruktan uzuv ve ön ayağa artan felç gösterir. Klinik skor (yani, hastalıkla ilişkili eksikliklerin birikiminin ölçülmesi) genellikle 5 puanlık bir ölçek7 kullanılarak değerlendirilir.

Protein veya peptit ile aktif bağışıklama veya ensefalojenik T hücrelerinin pasif transferi, farklı genetik geçmişe sahip farelerde (örneğin, SJL / J, C57BL / 6 ve obez olmayan diyabetik (NOD) fareler) EAE'yi indüklemek için kullanılabilir. Miyelin proteolipid proteini (PLP), miyelin bazik proteini (MBP) ve miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG), immünojenlerin genellikle üretildiği kendi kendine CNS proteinlerinin örnekleridir. Özellikle, PLP'nin immünodominant epitopu (PLP139-151) ile aşılanan SJL/J fareleri, nükseden-düzelen (RR) bir hastalık seyri geliştirirken, immünodominant MOG35-55 peptidi ile aşılanan C57BL/6J fareleri, kronik bir yapıya sahip EAE gösterir1. MS progresyonu hakkında çok az bilgi verilmesi, B hücrelerinin hastalıktaki rolü, içten dışa mekanizmalar veya remiyelinizasyonun incelenmesindeki zorluklar gibi bazı sınırlamalara rağmen, EAE modelleri otoimmün ve nöroinflamatuar süreçlerin anlaşılmasına büyük katkı sağlamış, MS alanındaki bilgiyi arttırmış ve böylece bu hastalık için yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesine olanak sağlamıştır4, 6.

Bu çalışmada, aktif EAE'nin belirli bir formuna, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi 35-55 (MOG35-55) ile indüklenen form 9,10,11,12'ye odaklandık. MOG35-55 ile indüklenen EAE, kronik bir MS formunu modeller. Bağışıklamadan sonra, fareler bağışıklamadan sonraki ilk hafta içinde asemptomatik bir aşamaya girer, daha sonra hastalık tipik olarak aşılamadan sonraki ikinci hafta içinde ortaya çıkarken, bağışıklamadan sonraki üçüncü ve dördüncü haftalar arasında hastalık kronikleşir ve biriken açıklardan tam iyileşme olasılığı yoktur 7,8,13. İlginç bir şekilde, literatürde bulunan çalışmaların çoğunda insidans, hastalık başlangıcı, seyri veya ilerlemesi açısından erkekler ve kadınlar arasında hiçbir fark gözlenmemiştir14, daha az çalışma erkeklerde ve kadınlarda hastalığı karşılaştırsa bile.

Buna karşılık, insanlarda, bu parametrelerin güçlü bir şekilde cinsel olarak dimorfik olduğu bilinmektedir2. MS erkeklerden daha fazla kadını etkiler; Bununla birlikte, erkekler genellikle hastalığın daha agresif bir formunu geliştirir2. Bu kanıt, gonadal hormonların15 önemli ve karmaşık bir rolünü ortaya koymuştur; Bununla birlikte, seks hormonlarının patolojideki rolü ve etki mekanizması belirsizliğini korumaktadır. Ayrıca, hayvan modellerinden elde edilen veriler, hem östrojenlerin hem de androjenlerin patolojinin farklı yolları üzerinde cinsiyete özgü bir şekilde olumlu etkiler gösterdiği fikrini desteklemektedir16,17.

Bazı çalışmalar ayrıca progesteronun nöroprotektif, promiyelinizan ve antienflamatuar etkilerini göstermektedir18 ve MS hastalarında kanıtlar az olmasına rağmen18, nöroaktif steroidler (yani, pregnenolon, tetrahidroprogesteron ve dihidroprogesteron gibi sinir sistemi tarafından de novo sentezlenmiş steroidler) de patolojik seyrietkileyebilir 19. Toplu olarak, bu veriler hem periferik hem de CNS içinde üretilen seks hormonlarının hastalık başlangıcında ve ilerlemesinde önemli ve cinsiyete özgü bir role sahip olduğu fikrini desteklemektedir. Bu nedenle, bu çalışmada, hem erkek hem de dişi hayvanlardan ayrı verilerin toplanmasını teşvik ediyoruz.

Histopatolojik açıdan bakıldığında, omuriliğin beyaz cevheri, mononükleer inflamatuar infiltrasyon ve demiyelinizasyonunmultifokal, birleşik bölgeleri ile karakterize edilen bu modelde CNS hasarının ana bölgesi olarak hizmet eder 8. Bu nedenle, C57BL/6J farelerinde MOG35-55 ile indüklenen EAE'nin indüksiyonu için bu protokolü tanımlarken, iki cinsiyetteki hastalık sonucunu dikkate alacağız ve omuriliklerle ilgili bazı histopatolojik bilgiler sağlayacağız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada hayvanların bakımı ve idaresi, 22Eylül 2010 tarihli Avrupa Birliği Konseyi Direktifine (2010/63/UE) göre gerçekleştirilmiştir; Bu çalışmada bildirilen tüm prosedürler İtalya Sağlık Bakanlığı (407/2018-PR) ve Torino Üniversitesi Etik Komitesi (Proje n° 360384) tarafından onaylanmıştır. Deneysel tasarıma, ilk olarak Kilkenny ve ark. 2010'da20. Başlamadan önce gerekli malzemelerin mevcut olduğundan emin olun (bkz. MOG35-55 emülsiyonunun hazırlanmasında kullanılan tüm cam eşyaları ve kapları bir otoklavda sterilize edin. Deneysel prosedürlerin bir özeti Şekil 1'de gösterilmektedir.

1. MOG35-55 emülsiyonunun hazırlanması

NOT: Emülsiyonu hazırlamak için MOG35-55, tamamlanmamış Freud adjuvanı (IFA), Mycobacterium Tuberculosis suşu H37Ra (MT) ve fizyolojik çözelti gereklidir (bkz.

DİKKAT: Isıyla öldürülen MT, doğuştan gelen bağışıklık tepkisini uyarabilir. Solumaktan, yutmaktan ve cilt ve gözlerle temasından kaçının, uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ve MT'yi kaputun altındaki kapalı bir hassas terazide tartın.

ÇözümKompozisyonNotlar
2 mg/mL MOG35-55 peptit çözeltisi2 mg / mL konsantrasyonda fizyolojik çözelti içinde seyreltilmiş liyofilize MOG35-55 peptidiZaten seyreltilmiş çözeltiyi -80 °C'de muhafaza edin.
5 μg/mL PT çözeltisiLiyofilize PT, 5 μg/mL konsantrasyonda fizyolojik çözelti içinde seyreltilir.Zaten seyreltilmiş çözeltiyi -80 °C'de muhafaza edin.
EmülsiyonAşılanacak her fare için gereken toplam emülsiyon hacmi 300 μL'dir ve aşağıdaki gibi bölünür:Değişiklikleri veya kontaminasyonu önlemek için, emülsiyonu aşılama günü hazırlayın.
200 μg/fare MOG35-55 , yani 100 μL MOG35-55 2 mg/mL çözelti.
50 μL fizyolojik çözelti
150 μL IFA
4 mg / mL MT, yani 1.2 mg / fare
Fizyolojik çözümSodyum klorür% 0.9 damıtılmış suda seyreltilir.

Tablo 1: Bağışıklama prosedürü için kullanılan çözeltilerin bileşimi.

  1. Çözeltiyi bir cam beherde hazırlayın, önce sıvı bileşeni ve son olarak MT'yi ekleyin.
    NOT: Aşılanacak her fare için gereken toplam emülsiyon hacmi, Tablo 1'de gösterildiği gibi bölünerek 300 μL'dir. Emülsiyon çok viskoz ve kalındır, bu nedenle hazırlama ve enjeksiyon prosedürü sırasında, özellikle birkaç fare için çözelti hazırlanırken bir miktar kayıp olabilir. Aşılanacak fare sayısını en az 1.5-2 kat fazla tahmin ederek ihtiyaç duyulan nihai emülsiyon hacmini hesaplamanızı öneririz.
  2. Beheri buza yerleştirin ve çözeltiyi emülsifiye etmeye başlamak için cam şırıngayı 18 G'lik bir iğne ile kullanın.
    NOT: Emülsiyon, örneğin iki havasız cam şırıngayı üç bir vana ile bağlayarak ve pistonları ileri geri iterekçözeltiyi karıştırarak başka stratejiler kullanılarak da hazırlanabilir 21,22.
  3. Çözeltiyi en az 15 dakika emülsifiye edin; Genellikle 30 dakikalık emülsifikasyon yeterlidir. Emülsiyonun kalitesini kontrol etmek için, suyla dolu şeffaf bir kaba bir damla emülsiyon ekleyin: damla yapısını korur ve sağlam kalırsa, emülsiyon hazırdır.
  4. Emülsiyonu doğrudan bağışıklama için kullanılacak 1 mL'lik şırıngaların içine yerleştirin ve emülsiyonun kalınlığını korumak ve değişiklik veya kontaminasyonları önlemek için bunları kullanıma kadar +4 °C'de saklayın.

2. Hayvan seçimi ve bağışıklama

  1. Hayvan seçimi
    1. Optimal vücut ağırlığı ~20 g olan 8-10 haftalıkken her iki cinsiyetten yetişkin C57BL/6J fareleri seçin. Farklı deney grupları için yaş ve cinsiyete uygun fareler seçtiğinizden emin olun, çünkü hastalığa yatkınlık yaş ve cinsiyete göre değişebilir.
      NOT: Fareler, bağışıklama gününde karşılaştırılabilir vücut ağırlığına sahip olmalıdır, çünkü mevcut prosedür belirli bir vücut ağırlığı aralığı (17-25 g) için optimize edilmiştir.
    2. Standart koşullarda sosyal izolasyonu önlemek için eşcinsel hayvanları gruplar halinde (n = 4-5/kafes) 45 cm x 25 cm x 15 cm polipropilen fare kafeslerinde 22 ± 2 °C'de, 12:12 aydınlık/karanlık döngüsünün altında (ışıklar 08:00'de yanar) barındırın. Yiyecek ve su ad libitum sağlayın.
      NOT: Sonuç olarak, aşılanmış hayvanlarda hastalık seyrinin potansiyel değişkenliğini daha da sınırlamak için, yeterince sayıda deney grubu oluşturmayı da öneriyoruz. Bağışıklamanın zamanlamasını EAE sonucundaki varyasyonu belirleyen bir durum olarak tanımlayan çalışmalarda 8,23 vardır. Bu nedenle, bağışıklamanın tüm hayvanlarda yaklaşık olarak aynı saatte, tercihen günlük aydınlık/karanlık döngüsününaydınlık saatlerinde yapılmasını öneriyoruz 23. Stresi sınırlamak için, hayvanları aşılama gününden önce manipüle etmek ve örneğin kulak kırpma veya etiket gibi günlük değerlendirme için kolayca tanımlamak için işaretlemek tercih edilir.
  2. Bağışıklama prosedürü
    NOT: Hayvanlar için stresi en aza indirmek ve bağışıklamayı optimize etmek için prosedürün deneyimli bir araştırmacı tarafından yapıldığından emin olun. Bağışıklamaya başlamadan önce kurum hayvan bakım ve etik kurul yönergelerine uygun anestezi yöntemini seçiniz. Laboratuvarımızda izofluran ile kısa süreli anestezi kullanılmaktadır.
    1. Fareyi uyuşturun: anestezi indüksiyonu için% 4 izofluran ve anestezi bakımı için% 1.5-2 izofluran. Anestezinin etkili olmasını bekleyin ve anestezi seviyesini değerlendirmek için arka ve ön ayak parmağı tutamını kullanın. Fare anestezi altındayken gözlerin kuruluğunu önlemek için veteriner onaylı bir göz merhemi kullanın.
    2. Lateral kaudal damarda PT intravenöz enjeksiyonu: damarları görüntülemek için farenin kuyruğunu vazodilatör görevi gören bir etanol çözeltisiyle hafifçe takın. Kuyruğun iki yan damarından birine odaklanın ve 30 G'lik bir iğne ile donatılmış 0,5 mL'lik bir şırınga kullanarak 500 ng PT enjekte edin (yani, 5 μg/mL konsantrasyonda fizyolojik çözelti içinde seyreltilmiş 100 μL PT).
    3. MOG35-55 emülsiyonunun deri altı enjeksiyonu: 26 G iğneli 1 mL şırıngayı kullanarak, önceden hazırlanmış emülsiyonun üç deri altı enjeksiyonunu gerçekleştirin: ikisi yanların rostral kısmının altında ve biri kuyruğun tabanında. Her bölgeye enjekte edilen emülsiyon hacmi 100 μL'dir ve her fareye enjekte edilen toplam 300 μL emülsiyon hacmi vardır.
      NOT: Bağışıklama günü, aşılamadan sonraki 0. gün (dpi) olarak kaydedilir; 48 saat sonra (ör., 2 dpi'de), daha önce yapılana eşit başka bir intravenöz PT enjeksiyonu yapmak gerekir. Enjeksiyonu anestezi olmadan, bir fare tutucu kullanarak yapmak mümkündür. Burada açıklanan prosedür, hayvanların olası rahatsızlıklarını ve hareketlerini veya hem fareler hem de araştırmacılar için riskleri önlemek için bağışıklama prosedürü sırasında farelerin uyuşturulmasını ve sürdürülmesini amaçlamaktadır. Bu nedenle herhangi bir cerrahi işlem söz konusu değildir. Bununla birlikte, deneysel süreçleri optimize etmek için, bu adımlar sırasında uygun steril koşulların sağlanması ve bu işlemlerden sonra farenin durumunun izlenmesi önemlidir.
    4. Farenin enjeksiyonlardan kurtulduğunu doğrulamak için, işlemlerden sonra temiz bir kafese koyun ve sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar bekleyin. Fare tamamen iyileştikten sonra, diğer hayvanlarla birlikte ev kafesine geri koyun.

3. EAE takibi

  1. Vücut ağırlığı ve gıda alımı
    1. Elektronik bir hassas terazi kullanarak hayvanların vücut ağırlığını (BW) günlük olarak izleyin, çünkü BW'deki azalma hastalığın ilerlemesinin bir göstergesidir.
      NOT: Bu azalma, kurumsal ve etik kurulun hayvan bakımı yönergelerine göre belirli bir yüzdeyi geçmemelidir. Genellikle, bir hayvan başlangıçtaki vücut ağırlığının %20'sinden fazlasını kaybederse (yani, 0 dpi'de kaydedilen ağırlık), insancıl son noktanın uygulaması olarak feda edilmelidir. Ötenazi yöntemleri, inhalasyon için derin geri dönüşümsüz anestezi (örneğin,% 5 izofluran) ve ardından dekapitasyon içerir.
    2. Yiyecek alımını (FI) izleyin - bir hayvan tarafından bir günde yenen yiyecek (g∙day-1∙hayvan-1), belirli bir kaptaki yiyecek miktarını haftada en az bir kez tartın ve iki ardışık ölçüm arasında geçen günler için yenen yiyecek miktarını ve kafeste bulunan hayvan sayısını bölün.
      NOT: Bu ölçüm, ortalama gıda alımının tahmin edilmesini sağlar. Uzuvların felç olmasını içeren klinik hastalık belirtilerinin ortaya çıkması ve birikmesi nedeniyle, hayvanlar arka bacakları üzerinde sıkıca duramadıklarında ve yiyecek kabına veya su şişesine ulaşamadıklarında kafesin zeminine biraz sulanmış yiyecek koymanızı öneririz. Takip süresi boyunca gıda alımını mümkün olduğunca hassas bir şekilde değerlendirmek için, fareler için ıslatmadan önce bu yiyeceğin kuru ağırlığını da ölçtük.
  2. EAE sırasında kızgınlık döngüsünün değerlendirilmesi
    1. McLean ve ark.24 tarafından tarif edildiği gibi vajinal sitoloji yaymalarını değerlendirerek östrus döngüsünü en az iki döngü için kontrol edin. Vajinal smear örneklerinde üç birincil hücre tipinin (çekirdekli epitel hücreleri, kornifiye skuamöz epitel hücreleri ve lökositler) varlığına göre östrus döngüsünün fazını aşağıdaki gibi sınıflandırın:
      1. Yuvarlak, iyi biçimlendirilmiş çekirdekli epitel hücrelerinin kümelerinin neredeyse münhasır varlığına dayanarak proöstrus olarak sınıflandırın.
      2. Kornifiye skuamöz epitel hücrelerinin yoğun şekilde paketlenmiş kümelerinin baskın varlığına dayanarak kızgınlık olarak sınıflandırın.
      3. Küçük, koyu boyanmış lökositlerin baskın varlığına ve kornifiye skuamöz epitel hücrelerinin küçük varlığına dayanarak metestrus olarak sınıflandırın.
      4. Küçük, koyu boyanmış lökositlerin ve nadir kornifiye skuamöz epitel hücrelerinin varlığına ve çekirdekli epitel hücrelerinin olası görünümüne dayanarak diestrus olarak sınıflandırın.
        NOT: Her iki cinsiyette de hastalığı değerlendirirken, kadınlarda kızgınlık döngüsüne bağlı değişkenliği kontrol etmek önemlidir. Özellikle aşılamadan sonraki birinci ve ikinci hafta arasında (yani EAE'nin akut fazı sırasında) östrus döngüsünün değerlendirilmesine odaklanmanızı öneririz. Bağışıklama prosedürünün bu faz25 içinde kızgınlık döngüsünde en belirgin değişikliklere neden olduğu daha önce gösterilmiştir. Ayrıca, hayvan yüksek bir klinik skora (özellikle >3) ulaştığında smear yapılmasının, posterior parezi ve arka ayaklardaki ton eksikliği nedeniyle zor olduğunu düşünmek önemlidir.
  3. Klinik skor
    1. Kör bir araştırmacının hayvanların klinik puanını günlük olarak değerlendirmesini sağlayın. Racke 7 tarafından tarif edildiği gibi hastalık seyri26'yı değerlendirmek için her hayvana 0'dan 5'e kadar derecelendirilmiş bir puan atayın (bakınız Tablo 2).
      NOT: Vücut ağırlığındaki azalmaya benzer şekilde, kurumsal ve etik komitenin hayvan bakımı yönergelerine göre, klinik puanlardaki artış için insancıl bir son nokta da gereklidir. Genel olarak, bir hayvan artık kendini özerk olarak besleyemiyorsa (bu genellikle kullandığımız ölçeğe göre bir hayvan en az 4 puana ulaştığında ortaya çıkar), insancıl son noktanın uygulaması olarak feda edilmelidir.
  4. Rotarod testi ile motor performans değerlendirmesi
    NOT: EAE ilerlemesinin değerlendirilmesi genellikle tam eğitimli kör bir araştırmacı tarafından yapılan klinik puanın günlük olarak atanmasıyla gerçekleştirilir. Bununla birlikte, hastalığın ilerlemesinin daha nicel ve objektif bir değerlendirmesi ile onu kuşatmak faydalı olabilir. Daha önceki bir çalışmada26, aşılanmış hayvanların motor performansını ölçmek için rotarod testi kullanılmıştır. Van den Berg ve ark.27 tarafından tanımlandığı gibi, hastalık seyrinin daha nicel ve kesin bir klinik değerlendirmesine sahip olmak için, motor performansın rotarod testi ile değerlendirilmesi klinik puan değerlendirmesini destekleyebilir. Ayrıntılı bir açıklama için van den Berg ve ark.27'ye bakınız.
    1. Farelerin her gün 1 dpi'den fedakarlığa kadar (yani 28 dpi) rotarod seanslarına girmesine izin verin. Her seans, çubuk hızının doğrusal olarak 4 ila 40 rpm'ye çıkarılması gereken tek bir 300 s seansından oluşur.
    2. Hayvanın puanını kaydedin. Fare dengesini koruyamadığında ve cihazdan düştüğünde yere düşer ve bir sensörü tetikler ve zaman(lar) kaydedilir. Böylece performans, düşme gecikmesi (s) olarak puanlanır.

DereceKlinik belirtiTarif
0SağlıklıGözlenen klinik belirti yok. Hayvan normal bir ton ve kuyruğun hareketini gösterir. Takılmadan yürür.
0.5Engelli kapıHayvan ızgarada yürürken tökezler.
1Gevşek kuyrukHayvan kuyruğun temeli tarafından alındığında, kuyruk sarkar (gevşek kuyruk).
1.5Gevşek kuyruk ve bozulmuş kapıHayvan gevşek bir kuyruk gösterir ve ızgarada yürürken tökezler.
2AtaksiHayvan, sırt üstü çevrildikten sonra ayağa kalkmakta güçlük çeker.
2.5Ataksi ve arka bacak pareziHayvan, sırt üstü çevrildikten sonra ayağa kalkamaz ve arka ayaklarından birinin tonunu kaybeder.
3Arka ayakların felciHayvan her iki arka ayağın tonunu kaybeder.
3.5Arka ayakların felci ve / veya ön ayakların pareziHayvan hem arka ayakların hem de kısmen ön ayakların tonunu kaybeder. Aslında, ön ayakların kavrayışında bir güç kaybı gösterir.
4Tetra pareziHayvan, uzuvlarının tonunu tamamen kaybeder.
4.5Tetra parezi ve vücut ısısında azalmaHayvan uzuvlarının tonunu tamamen kaybeder ve vücut ısısında bir düşüş gösterir (soğuktur).
5Ölmek ya da ölmekHayvan ölüyor (herhangi bir uyarana cevap vermiyor) veya ölüyor.

Tablo 2: EAE progresyonunu değerlendirmek için kullanılan klinik skorlama sistemi.

4. Spinal kord düzeyinde EAE'nin neden olduğu histopatolojik bulguların değerlendirilmesi

NOT: Burada, histopatolojik analiz yapmak için hayvanları kurban etme ve omurilikleri toplama prosedürünü kısaca bildiriyoruz; Ayrıntılı bir açıklama için bu referanslarabakın 10,26,28,29.

  1. Fiksasyon ve doku örneklemesi
    NOT: Ayrıntılı bir açıklama için bu referanslarabakın 10,26.
    1. Hastalığın kronik fazında hayvanları 28 dpi'de kurban edin.
      1. Fareleri derin geri dönüşümsüz anestezi ile uyuşturun (intraperitoneal Zolazepam ve Tiletamin enjeksiyonu 80 mg / kg / Ksilazin 10 mg / kg).
      2. Fareleri bir tuzlu su çözeltisi ve ardından% 4'lük bir paraformaldehit (PFA) çözeltisi ile transkardiyal olarak perfüze edin.
        NOT: PFA kullanırken dikkat edin: toksik olduğundan, uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak solumaktan, yutmaktan ve cilt ve gözlerle temasından kaçının. Tozu tartın, çözeltiyi hazırlayın ve perfüzyonu kaputun altında gerçekleştirin.
    2. Omurilikleri omurgadançıkarın 30.
    3. Omurilikleri 24 saat boyunca% 4'lük bir PFA çözeltisinde saklayın.
    4. 0.01 M tuzlu fosfat tamponunda (PBS) birkaç yıkama gerçekleştirin.
    5. Omurilikleri parafin bloklarınagömün 30.
  2. Histolojik prosedürler
    NOT: Ayrıntılı bir açıklama için Montarolo ve ark.10'a bakın.
    1. 10 μm kalınlığındaki enine omurilik bölümlerini kesmek için bir mikrotom kullanın ve bunları jelatin kaplı slaytlarda toplayın. Kesit düzlemini, fare omurilik atlasının enine kesitlerine karşılık gelen çizimlerle eşleşecek şekilde yönlendirin31.
    2. Bölümlerin deparafinizasyonunu gerçekleştirin32.
    3. Bölümü Hematoksilen ve Eozin32 ile boyayın.
    4. Bölümleri kurutun32.
    5. Bölümleri bir montaj ortamı ile örtün ve kimyasal bir başlık altında oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
      NOT: Hematoksilen-Eozin boyama, hastalığın bir belirtisi olarak değerlendirilen perivasküler inflamatuar infiltratların (PvII'ler)266 varlığının saptanmasına izin verir28.
  3. Omurilik kesitlerinin kantitatif analizi
    1. 20x objektif29 ile bir dijital kameraya bağlı bir optik mikroskop ile lekeli bölümlerin görüntülerini elde edin.
    2. mm2 başına sızma sayısı olarak ifade edilen PvII sayısını elde etmek için elde edilen görüntüyü analiz edin.
      NOT: Elde edilen görüntülerin analizi için görüntü analiz yazılımlarından yararlanmakta fayda vardır. Bu çalışmada sunulan nöropatolojik bulgular, tüm omurilik seviyelerini temsil eden fare başına omuriliğin 10 tam kesitinde (n = 8 / grup) ölçülmüştür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bağışıklama sonrası EAE takibi
Bu, aşağıda açıklandığı gibi değerlendirildi.

Vücut ağırlığı ve gıda alımı
İki yönlü varyans analizi (ANOVA) (bağımsız değişkenler olarak cinsiyet ve zaman), özellikle indüksiyondan sonraki ikinci hafta içinde, her iki cinsiyetten EAE hayvanlarının BW'sinde bir azalma olduğunu göstermektedir (F(1,57) = 4.952, p < 0.001; Şekil 2A). Bununla birlikte, BW'deki cinsel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tanımladığımız MOG35-55 kaynaklı EAE protokolü, C57BL / 6J farelerinde kronik bir MS formunun gelişmesine yol açtı 7,8,13. Bu temsili sonuçlarda, bağışıklama prosedürüne tabi tutulan her iki cinsiyetten hayvanların hastalığın kronik bir formunu geliştirdiğini bildirdik (yani, hastalık başlangıcından sonra tam olarak iyileşmezler, açıklar biriktirirler ve kronik fazda en az 1.5'lik bir CS'yi korurlar).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların hiçbirinin bu makalenin araştırılması, yazarlığı ve/veya yayınlanması ile ilgili olarak beyan edeceği herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR projesi Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 ve 2023-2027 tarafından Sinirbilim Bölümü Rita Levi Montalcini'ye; Cavalieri-Ottolenghi Vakfı, Orbassano, İtalya. BB, INFRA-P, Piedmont Bölgesi (n.378-35) (2022-2023) ve PRIN 2020 - 20203AMKTW üyesiydi. Desteği için Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus'a (FORB) teşekkür ederiz. Yayın ücretleri, Distretto Rotaract 2031'in ve özellikle Rotaract Club Torino Nord-Est'in bağışlarıyla desteklenmiştir. Elaine Miller'a makalemizin redaksiyonu için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
18 G x 1 ve frak12; “ Cam şırınga için 1,2 x 40 mm iğne TerumoTER-HYP-18G-112-PIN
Optik mikroskoba bağlı dijital kameraNIKON DS-U1 dijital kamera
Elektronik hassas teraziMerckMod. Kern-440-47N, çözünürlük 0.1 g
Eosin YSigma-AldrichHT110216
Cam şırınga pipeti " Ultra Asept" 10 mlSacco Sistemi 
Züccaciye (yani, emülsiyonu hazırlamak için becker)VWR213-1170, 213-1172
Hematoksilen (Mayer' s)Kullanmadan önce Sigma-AldrichMHS32Filtresi. 
Görüntü analiz yazılımıFiji
Incomplete Freund' s adjuvan (IFA)Sigma-AldrichF5506+4 & derece C. 
IsofluraneWellona PharmaBu ilaç inhalasyon anestezik olarak kullanılır.
Erkek ve dişi C57BL/6J farelerJackson Laboratuvarı, EnvigoYaş 8-10 hafta, optimal vücut ağırlığı ~ 20 g.
MicrotomeLeica HistoCore BIOCUT R
Montaj Ortamı Merck107961
Fare RotarodUgo Basile #47600
Mycobacterium tüberküloz (MT), suş H37Ra Difco Laboratuvarlar A.Ş.  231141+4 &� C'de saklayın.
Miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi 35-55 (MOG < alt > 35-55 < / alt >)EspikemEPK1-80 ° C'de saklayın; C fizyolojik çözelti içinde seyreltilmiş (2 mg / mL); Mümkün olduğunca değişiklik veya kontaminasyondan kaçınmak için aşılama gününde hazırlayın.
Optik mikroskopNIKON eclipse 90i
Paraformaldehit (PFA)Sigma-Aldrich158127+4 &°C'de saklayın; C bir kez fosfat tamponu içinde seyreltilir (% 4);
Boğmaca toksini (PT)Duotech PT.181-80 ° C'de saklayın; C seyreltilmiş (konsantrasyon 5 & mikro; g/mL) fizyolojik çözelti içinde 
Fizyolojik çözelti (sodyum klorür% 0.9 çözelti)B. EurospitalA 032182038+4 &°C'de saklayın; C bir kez açıldı.
Tuzlu fosfat tamponu (PBS)Thermo ScientificJ61196.
Görüntü alımı için AP Yazılımı  NIS-Element AR 2.10
Şırıngalar U-100 0.5 mL, 30 G x 5/16" (0.30 x 8 mm) sabit iğnede  NiproSYMS-0.5U100-3008B-EC
Şırıngalar U-100 1 mL, 26G x ½ ile; ” (0.45 x 12.7 mm) iğnedePIC20,71,26,03,00,354
Gözler için veteriner merhemiLacrilube, Lacrigel Europhta
XylazineRompunBu ilaç karışımı enjekte edilebilir anestezik ve yatıştırıcı olarak kullanılır.
Zolazepam ve TiletaminZoletil  100Bu ilaç enjekte edilebilir anestezik, yatıştırıcı, kas gevşetici ve analjezik olarak kullanılır
L003465

Kaynaklar

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185(2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), Zurich, Switzerland. 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , Chapter 9, Unit 9.7 (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791(2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831(2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151(2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058(2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It's complicated. Front Immunol. 13, 1059833(2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412(2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778(2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389(2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4(2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida--a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Chapter 16 - Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. , Academic Press. 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084(2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50(2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924(2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 2/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

Etiketler

Multipl Skleroz ModeliMOG 35-55 İmmünizasyonuMS'de Cinsiyet FarklılıklarıC57BL/6J FareleriKlinik Skor DeğerlendirmesiRotarod TestiNöroinflamatuar SüreçlerOmurilik HistolojisiDemiyelinizan Hastalık
İki Cinsiyette Multipl Sklerozun Modellenmesi: MOG35-55 ile İndüklenen Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.