Fare Oosit Çekirdeğinin Hücre İskeleti Tabanlı Ajitasyonunun Uzamsal Ölçeklerde Yakalanması

Özet

Bu protokol, hücre iskeletinin nükleer şekil ve fare oosit sistemindeki iç zarsız organeller üzerindeki fiziksel etkisini belgelemek için deneysel bir çerçeve sağlar. Çerçeve, diğer hücre türlerinde ve bağlamlarında kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Özet

Kadın infertilitesinin nedenlerini anlamada en büyük zorluk, oosit adı verilen dişi germ hücrelerinin gelişimini yöneten mekanizmaları aydınlatmaktır. Gelişimleri, embriyogenezi başlatmak için oositi sperm ile füzyona hazırlayan iki kritik aşama olan hücre büyümesi ve müteakip bölünmeler ile işaretlenir. Büyüme sırasında, oositler sitoplazmalarını çekirdeği hücre merkezinde konumlandırmak için yeniden düzenlerler, bu da farelerde ve insanlarda başarılı oosit gelişimini ve dolayısıyla embriyojenik potansiyellerini öngören bir olaydır. Fare oositlerinde, bu sitoplazmik yeniden düzenlemenin, aktivitesi çekirdeğe giren, yeniden konumlandıran ve nüfuz eden mekanik kuvvetler üreten hücre iskeleti tarafından yönlendirildiği gösterilmiştir. Sonuç olarak, bu sitoplazmik-nükleoplazmik kuvvet iletimi, biyomoleküler kondensatlar olarak bilinen nükleer RNA işleme organellerinin dinamiklerini ayarlar. Bu protokol, fare oositlerinde uzamsal ölçekler boyunca hücre iskeletinin çekirdek üzerindeki etkisini yüksek zamansal çözünürlükle belgelemek için deneysel bir çerçeve sağlar. i) oosit sitoplazmasındaki hücre iskeleti aktivitesini, ii) oosit çekirdeğinin hücre iskeleti bazlı ajitasyonunu ve iii) oosit nükleoplazmasındaki biyomoleküler kondensat dinamikleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için gerekli görüntüleme ve görüntü analizi adımlarını ve araçlarını detaylandırır. Oosit biyolojisinin ötesinde, burada detaylandırılan yöntemler, ölçekler arasında nükleer dinamiklerin hücre iskeletine dayalı ayarını benzer şekilde ele almak için somatik hücrelerde kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Giriş

Nükleer konumlandırma, çoklu hücresel ve gelişimsel işlevler için gereklidir 1,2,3,4,5. Oosit adı verilen memeli dişi germ hücreleri, boyut olarak asimetrik bir bölünmeye uğramasına rağmen, çekirdeği hücre merkezinde konumlandırmak için sitoplazmalarını yeniden şekillendirir, bu da sonraki kromozomun merkezden uzaklaşmasına^{dayanır 6} (Şekil 1). Çekirdeğin bu merkezlenmesi, farelerde ve insanlarda başarılı oosit gelişimini ^7,8 ve dolayısıyla embriyojenik potansiyellerini öngörür (Şekil 1).

Fare oositlerinde sitoplazmik yeniden şekillenme, esas olarak aktomiyosin hücre iskeleti⁹ tarafından yönlendirilir (Şekil 2). Aktivitesi, çekirdeği¹⁰ çalkalayan, yeniden konumlandıran ve nüfuz eden mekanik kuvvetler üretir (Şekil 2). Sonuç olarak, bu sitoplazmik-nükleoplazmik kuvvet iletimi, çekirdekte biyomoleküler kondensatlar ^{12,13,14,15,16} olarak bilinen birkaç zarsız organelden biri olan nükleer benekler¹¹ olarak adlandırılan nükleer haberci RNA işleme organellerinin dinamiklerini ayarlar (Şekil 2).

Canlı görüntüleme, nükleer ajitasyonun işlevsel etkilerini deşifre etmede belirleyici olmuştur. Saatler boyunca nükleer göç filmlerinin yanı sıra aktin ağının ve toplu sitoplazmanın yüksek zamansal çözünürlüklü filmleri, farklı zaman ölçeklerini birbirine bağlayan nükleer konumlandırma için teorik bir modelin detaylandırılmasına büyük ölçüde katkıda bulundu⁹. Ayrıca, sitoplazmanın, nükleer anahatların ve kromatin ve nükleer kondensatlar gibi nükleer bileşenlerin yüksek zamansal çözünürlüklü filmleri, hücre içindeki farklı uzay-zamansal ölçekler arasında köprü kurarak, fare oositlerinde çekirdeğin hücre iskeleti tabanlı ajitasyonunun RNA işleme ve gen ekspresyonu üzerindeki rolünü vurguladı^10,11. Toplamda, canlı görüntülemeye dayanan böyle bir ölçek geçiş yaklaşımı, çekirdeğin hücre iskeleti ajitasyonunu oositlerin gelişimsel başarısına bağlayan ilk mantığı sağladı.

Protokol, sitoplazmik kuvvetlerin (esas olarak F-aktin ve kısmen mikrotübüller tarafından üretilen) çekirdeğe ve fare oositlerindeki iç bileşenlerine iletimini incelemek için kullanılan görüntüleme ve görüntü analizi boru hattını sağlar. Bu deneylerin sonucu, sitoplazmik aktif hareketler, nükleer anahattın dalgalanmaları ve tek bir nükleer biyomoleküler kondensatların hareketi ve yüzey dalgalanmaları arasındaki bağlantıyı kuran iki yeni çalışmada^10,11 gösterildiği gibi, sitoplazmadaki hücre iskeletinden nükleer iç kısma kadar uzamsal ölçeklerdeki kuvvetlerin sürekliliğini yakalamaktır: nükleer benekler. Aynı yaklaşım, sitoplazmik kuvvetlerin değişmesi beklenen diğer model sistemlere de uygulanabilir, örneğin malign kanser hücreleri^{bağlamında 17}.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Avrupa Topluluğu'nun yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Fransa Tarım Bakanlığı (yetki No. 75-1170) ve Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; GDO anlaşma numarası DUO-5291). Fareler, 22-24 °C ortam sıcaklığı ve %40-50 nem oranı ile 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsünde hayvan tesisine yerleştirildi. Burada kullanılan fareler arasında dişi OF1 (Oncins France 1, 8 ila 12 haftalık) ve dişi C57BL / 6 (10 ila 14 haftalık) bulunur.

1. Oosit toplama ve hazırlama

1. ¹⁸ ve^19'da tarif edildiği gibi 8 ila 14 haftalık farelerden oosit toplayın.
   1. Kısaca, ilk önce^{farelerden 18'de} olduğu gibi yumurtalıkları, oositlerde mayozun yeniden başlamasını önleyen 1 μM Milrinone¹⁹ ile desteklenmiş önceden ısıtılmış (37 °C) M2 + Sığır Serum Albümini (BSA) ortamına çıkarın.
   2. Antral foliküllerden büyüyen oositleri serbest bırakmak için yumurtalık foliküllerini cerrahi iğnelerle delin (oosit büyümesinin sonu²⁰).
   3. Deneyler için gereken büyüklükteki oositleri (büyüyen ve/veya tamamen büyümüş oositler) oosit toplama için özel bir mikropipet ile toplayın, yıkamadan ve mineral yağ altında taze ortamlı bulaşıklara taşımadan önce.
2. Yukarı ve aşağı pipetleyerek oositleri antral foliküler hücrelerden mekanik olarak ayırın ve sonraki deneysel adımlara geçmeden önce inkübatörde 37 ° C'de 1 saat stabilize olmaya bırakın.
   NOT: Yumurtalar tüm deney aşamalarında 37 °C'de tutulur. Bu protokol için, tam olarak büyümüş olan en büyük oositler toplandı.

2. Oosit mikroenjeksiyonu

NOT: Sitoplazmadaki hücre iskeleti tabanlı aktiviteyi yakalamak için parlak alan canlı görüntüleme kullanılır. Bu nedenle floresan belirteçlerin mikroenjeksiyonu gerekli değildir ve protokol 3. adımda devam ettirilebilir. Nükleer taslağı görüntülemek için, N-terminalinde YFP etiketini ve C-terminali ^21,22'de bir CFP etiketini gösteren bir prob olan Rango kullanıldı. 488 nm'de oositlerde görüntülendiğinde, nükleolus²³ hariç tüm çekirdeği etiketler ve çok keskin bir nükleer taslak gösterir. Nükleer benekleri görselleştirmek için, nükleer beneklerin^11'in bir belirteci olan SRSF2-GFP (NM_011358) kullanıldı. Aynı besiyeri oosit toplama, mikroenjeksiyon, tamamlayıcı RNA translasyonu ve canlı hücre görüntüleme için kullanılır.

1. Rango plazmidini SfiI veya SRSF2-GFP plazmidini AgeI kısıtlama enzimleri ile doğrusallaştırın.
2. Kapaklı tamamlayıcı RNA'ları (cRNA) promotöre göre uygun in vitro transkripsiyon kiti (Rango için T3 ve SRSF2-GFP için T7) ile sentezleyin ve daha önce açıklandığı gibi bir kolon saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın²⁴.
   NOT: cRNA stabilitesini artırmak için bir poliadenilasyon kiti kullanan poliadenilat SRSF2-GFP RNA. Plazmit omurgasındaki farklılıklar nedeniyle iki farklı promotör kullanılır.
3. Bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak cRNA konsantrasyonlarını ölçün.
4. Rango cRNA'yı 1000 ng/μL'ye ve SRSF2-GFP cRNA'yı_dH2O'da600 ng/μL'ye seyreltin.
5. Mikroenjeksiyondan önce cRNA alikotunu 4 °C'de en az 60 dakika 25.000 x g'da santrifüjleyin.
6. 11,25'te tarif edildiği gibi YFP-Rango veya SRSF2-GFP'yi kodlayan cRNA'ları bir mikroenjektör kullanarak 37 °C M2+ BSA+Milrinon ortamında oositlerin sitoplazmasına enjekte edin.
7. Oositleri cRNA translasyonu için 37 ° C'de kültür ortamında en az 2 saat inkübe edin.
8. Oositleri, kapağı cam tabanı mineral yağ ile kaplanmış 35 mm'lik bir doku kültürü kabı üzerinde küçük (5 μL) kültür ortamı damlacıkları halinde biriktirin. Komşu oositlerin foto ağartılmasını önlemek için damlacık başına bir oosit yerleştirin.

3. Canlı hücre görüntüleme

NOT: Canlı fare oositleri, Plan-APO 40x/1.25 NA yağa daldırma objektifi, motorlu bir tarama güvertesi, bir inkübasyon odası (37 °C), bir filtre tekerleğine bağlı bir CCD kamera ve bir dönen disk ile donatılmış ters konfokal bir mikroskopla incelendi. Yüksek zamansal çözünürlüklü görüntüler, akış alma modunda Metamorph (bundan böyle görüntüleme yazılımı olarak anılacaktır) kullanılarak elde edilir.

1. Görüntüleme yazılımının Al penceresini açın.
2. Pozlama süresini 500 ms, kamera alanını Full Chip'te ve gruplamayı 1'de ayarlayın.
3. Al sekmesinde, gerekli kanal için aydınlatmayı ayarlayın. Sitoplazmik aktiviteyi görüntülemek için, oositleri iletilen ışıkla aydınlatın. YFP-Rango veya SRSF2-GFP ile etiketlenmiş çekirdeği görüntülemek için, oositleri 491 nm'lik bir uyarma dalga boyu ile aydınlatın.
4. Sitoplazmik karıştırma veya YFP-Rango deneyleri için, iletilen ışıkla kolayca gözlemlenebilen oosit nükleolusuna odaklanın (Şekil 3A). Tek bir uçak satın alınacak. Nükleer benek deneyleri için SRSF2-GFP damlacıklarına odaklanın (Şekil 3C).
5. Özel sekmesinde, alım hızını optimize etmek için parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın.
   Kamera deklanşörü: Pozlama için açık
   Temizle modu: ÖN SIRALAMAYI TEMİZLE
6. Görüntüleme yazılımının Akış Alma penceresini açın. Akış parametrelerini denemeye göre ayarlayın. Her iki çalışma için^{de 10,11}, aşağıda açıklanan parametreleri kullanın.
   1. Al sekmesinde aşağıdaki parametreleri ayarlayın.
      Edinme modu: RAM'e akış
      Çerçeve sayısı: 480 (görüntüleme süresini azaltmak için 240 kareye düşürülebilir)
      Kamera parametreleri: Görüntüleri kare hızında alın
      Atlanacak kare sayısı (Nb): 0
   2. Dijital Fotoğraf Makinesi Kontrol Cihazı Parametreleri sekmesinde aşağıdaki parametreleri ayarlayın.
      Kamera durumu: HALT
      Deklanşör modu: HİÇBİR ZAMAN AÇILMAZ
      Temizle modu: ÖN SIRALAMAYI TEMİZLE
      Ortalama kare sayısı: 1
      NOT 1: Akış modunda, pozlama süresi ayarlandıktan sonra, film süresi kare sayısına göre belirlenir. Örneğin, 500 ms pozlama süresi ve 480 kare, 4 dakikalık bir film oluşturur. Görüntü alımı sırasında bir önizleme görüntülenebilir.
7. Nesnenin etrafındaki ilgi alanını (ROI) ayarlayın. ROI alanını en aza indirmek, edinme süresini azaltır.
8. Filmi başlatmak için Akış Edinme penceresinde Al'a tıklayın.
9. Edinmenin sonunda filmi .tif dosyası olarak kaydedin.
   NOT: Yüksek zamansal çözünürlüklü filmler sırasında nükleer yapıları takip etmek için, nükleer problar (YFP-Rango ve SRSF2-GFP), görüntü analizinin sonraki adımları sırasında nesnelerin segmentasyonunu kolaylaştırmak için yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahip olmalıdır. Eksojen SRSF2-GFP ekspresyon profilleri, endojen nükleer benek immün boyaları ile karşılaştırılabilir olmalıdır (Şekil 3C-D). Endojen boyamaya göre SRSF2-GFP ekspresyon profillerindeki değişiklikler, yüksek dozlarda cRNA enjeksiyonu ve translasyonunu^{yansıtabilir 26} (Şekil 3C-D).

4. Görüntü analizi: Sitoplazmik karıştırma

NOT: Oositlerdeki aktin bazlı hücre iskeleti aktivitesinin yoğunluğunu yansıtan sitoplazmik karıştırma, laboratuvar^9'un önceki bir yayınından alınan ve^27'de mevcut olan bir yazılım kullanılarak görüntü korelasyon analizleri ile belirlenir. Yazılım, ardışık görüntüler arasında ne kadar piksel yoğunluğunun korunduğunu ölçer. Çıktı, 9'da olduğu gibi 1'den başlayan ve zamanla katlanarak azalan zaman içindeki görüntüler arasındaki korelasyon kaybıdır^.

1. Fiji StackReg eklentisini (Plugins>StackReg) kullanarak ham hızlandırılmış görüntüleri (Δt=0,5 sn) hizalayın. StackReg²⁸ eklentisini yüklemek için, eklentiye erişmek için BIG-EPFL güncelleme sitesi^29'u etkinleştirin.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek ~300^μm2'lik 3 ila 4 sitoplazmik bölgede parlak alan görüntü korelasyonlarını hesaplayın.
   1. Bölgeleri kırpın ve ayrı film dosyaları olarak kaydedin. Terminal penceresini açın.
   2. oocyte yazın, Boşluk Çubuğu'na basın ve ardından Enter tuşuna basın. Sinyal ve Yuva adlı bir pencere açılır. Analiz edilecek kırpılmış film dosyalarını seçin.
      NOT: Aynı anda birkaç film seçilebilir.
3. Uygulama, filmlerle aynı klasördeki dosyaları döndürür. .csv, .eps ve .xls uzantılı üç farklı dosya oluşturulur. .xls dosyası, bir bölge için bağıntı grafiklerini çizmek için verileri içerir. Bir hücre içindeki farklı bölgelerden ortalama korelasyon değerleri.
4. Görsel netlik amacıyla, ^11'deki gibi ters çevrilmiş üstel benzeri bir eğri elde etmek için her bir zaman noktasının değerini 1'den çıkararak nihai korelasyon değerlerini dönüştürün.

5. Görüntü analizi: Sitoplazmik vektör haritaları

NOT: Fare oosit sitoplazmik vektör haritaları, daha önce Fiji 32'de fare oositlerinde³¹ sitoplazmik akışları tespit etmek için uygulanan ve^33'te mevcut olan Uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (STICS) eklentisi ³⁰ tarafından oluşturulmuştur. Haritalar, 9 ve^11'de olduğu gibi sitoplazmik akış hızının büyüklüğünü ve yönünü gösterir.

1. Parlak alanlı zaman atlamalı görüntüleri (Δt=0,5 sn) 32 bit formatına dönüştürün.
2. StackReg > Eklentiler'de Fiji StackReg eklentisiyle görüntüleri yeniden hizalayın ve Katı Gövde dönüşümü'nü seçin.
3. Eklenti yığını ile hareketli ortalama jru v2'yi çıkarın (STICS eklenti paketinin Detrend araçlarında), filmin zaman ortalamalı görüntüsünü çıkararak filmdeki sabit yapılardan kurtulun. Onay kutuları Statik Ortalama ve Çıktı Alt Yığınını Çıkarın, Uzamsal Ortalamayı Koru'yu seçin ve dönemi 5'e ayarlayın.
4. Eklentinin sınır etkilerinden kaçınmak için korteks hariç oosit etrafına bir ROI çizin.
5. 32 piksel alt bölge boyutu, 16 piksel adım boyutu, 3 STICS zamansal kaydırması 3, X ve Y ofsetleri 0, hız çarpanı 8, büyüklük eşiği 0 ve Vektör Uzunluğunu Normalleştir, Merkez Vektörler, Çıkış Hızları ve Film Maskesi Kullan onay kutuları ile STICS map jru V2 eklentisini (ICS araçlarında) başlatın.
   NOT: Eklenti, sitoplazmik akışları, 9 ve^11'de olduğu gibi akış genliklerini gösteren renklerle vektörler olarak görüntüleyen .tif formatında oositin bir haritasını ve ölçülen akış hızlarını içeren bir excel dosyasını oluşturur.

6. Görüntü analizi: Nükleer anahat dalgalanmaları

NOT: Nükleer membran ajitasyonunu yansıtan nükleer anahat dalgalanmaları, YFP-Rango ile etiketlenmiş çekirdek filmlerinden belirlenebilir (Şekil 4A, C). Nükleer anahat dalgalanmaları için görüntü analizi, Fiji ve StackReg (StackReg eklentisine erişmek için BIG-EPFL güncelleme sitesi^29'u etkinleştirin), PureDenoise³⁴ ve Ovocyte_nucleus. eklentilerin yüklenmesini gerektirir. StackReg eklentisi, olası küresel hareketi düzeltmek için görüntü kaydı gerçekleştirir. PureDenoise eklentisi, karışık Poisson-Gauss gürültüsü tarafından bozulan çok boyutlu görüntülerin gürültüsünü ortadan kaldırır ve nükleer taslağı yumuşatır. Ovocyte_nucleus eklentisi sinyali eşikler ve ikili bir çekirdek maskesi oluşturmak için çekirdekçiklere karşılık gelen deliği doldurur, StackRreg ile yeniden hizalar ve tüm θ açıları için (θ° 0°'den 360°'ye 1°'lik artışla) çekirdek maskesinin merkezinden maskenin çevresine r mesafesini hesaplar, Şekil 4'teki gibi. Bu eklentiler için tüm kodlar ^35'te bulunabilir.

1. Fiji'de, CIRB > Verlhac > Eklentiler menüsünde Ovocyte Nucleus Shape'i seçin.
2. İletişim kutusunda, aşağıdaki seçimi gerçekleştirin.
   1. Analiz edilecek filmleri içeren klasörü seçin.
   2. θ açısını (1° ile 360° arasında bir değer seçilebilir ve optimum anahat çözünürlüğü için 1° değeri kullanılmıştır), kırpma kenar boşluklarını (tüm çekirdeği korumak için 5 μm önerilir) seçin.
   3. XY kalibrasyonunu ve zaman aralığını seçin. Tamam'a tıklayın.
      NOT: Sonuçlar, orijinal filmleri içeren klasördeki bir çıkış klasöründe .xls dosyalar olarak sağlanır. Bu dosya, her t zamanı ve her θ açısı için ölçülen tüm yarıçapları r görüntüler. Çıktı dosyasının bir örneği Ek Tablo 1'de verilmiştir. Out klasörü ayrıca çekirdek maskesinin bir filmini de içerir.
3. Bir elektronik tablo kullanarak, tanımlanan her θ açısı için tüm t zaman noktaları üzerinden ortalama yarıçap R'yi hesaplayın. Bu, zaman içinde ortalama şeklin çizilmesine izin verir (Şekil 4B). Ek Tablo 2'deki örneğe bakın.
4. Her t ve θ için, zaman içindeki ortalama yarıçap R'yi r yarıçapından çıkarın. Varyans (r-R)² nükleer zarf dalgalanmalarının bir ölçüsüdür.
5. Tüm zaman noktaları t ve tüm açılar θ için dalgalanmaların ortalamasını her çekirdek için ve sonunda tek bir koşuldan tüm çekirdekler için hesaplayın.
   NOT: Bozulmuş bir hücre iskeleti durumunda olduğu gibi çekirdeklerin şekli önemli ölçüde değiştiğinde, YFP-Rango ile etiketlenmiş çekirdekler,^10'da olduğu gibi nükleer anahat dalgalanmalarının analizine geçmeden önce, pürüzsüz kısmı yukarı ve istilayı aşağı yönlendirmek için Fiji'de döndürülür.

7. Görüntü analizi: Nükleer benek hareketleri (difüzyon dinamikleri)

NOT: Nükleer benek hareketi analizi, bu organellerin dinamiklerini (tahrikli, dağınık veya sınırlı) izlerinden çıkarmaya izin verir.

1. Esas olarak X-Y ekseninde hareket eden SRSF2-GFP damlacıklarını eksprese eden oositlerin akış modu görüntülerini seçin.
2. Fiji'de histogram eşleştirme yöntemi kullanılarak SRSF2-GFP eksprese eden oositlerin hızlandırılmış görüntülerinin ağartılması için düzeltme (Resim > Çamaşır Suyu Düzeltmesi > Ayarlayın).
3. Fiji StackReg eklentisi ile görüntüleri yeniden hizalayın.
4. Fiji Manuel İzleme eklentisini (İzleme >> Manuel İzleme Eklentileri) kullanarak SRSF2-GFP damlacık merkezlerini takip edin. İzlemeyi başlatmak için Takip Ekle'ye basın ve bittiğinde Takibi Sonlandır'a basın. Merkezleme düzeltmesini etkinleştirmeyin.
5. ^11'de olduğu gibi zamansal Ortalama Kare Yer Değiştirmeleri (MSD) hesaplamalarına devam etmek için parçaları bir elektronik tablo dosyasına kopyalayın ve her 20 sn damlacık yörüngesinden zamansal MSD'leri hesaplayın.
6. Difüzyon üssü alfayı (α) tahmin etmek için R yazılımını kullanarak Nelder-Mead yöntemiyle eğrileri (msd(t) = beta x t^α) sığdırın.
7. Difüzyonun anormal olması beklendiğinden farklı koşulları karşılaştırabilmek için etkin difüzyon katsayısını ölçün (α< 1).
8. Temporal MSD eğrisinin 40 ilk noktasındaki (20 s) doğrusal bir uyumdan (alfa=1) etkin difüzyon katsayısı D_eff'yi hesaplayın ve damlacık boyutuna göre normalleştirin (μm cinsinden D_eff ²/s x μm cinsinden 3/2 πr).

8. Görüntü analizi: Nükleer benek yüzeyi dalgalanmaları

NOT: Zaman içinde nükleer benek kontur evrimi, bu organellere aktif kuvvet iletiminin bir okuması, Fiji'de kullanılmak üzere özel olarak oluşturulmuş bir eklenti olan Radioak³⁶ ile ölçüldü ve^37'de mevcut. Eklenti, seçim merkezinin etrafındaki tüm açılar için belirli bir seçimin yarıçap değerlerini çıkarır. Zaman içindeki şekil değişimi, yarıçapın değeri her açı için ortalama değerine göre karşılaştırılarak ölçüldü. Eklenti, şekil dalgalanmalarını ölçmeye izin verir ve bu dinamikleri görselleştirmek için bir seçenek sunar. Yüklemek için Radioak_.jar dosyasını indirin ve Fiji'nin eklentiler klasörüne yerleştirin. Fiji'yi yeniden başlatın. Bu eklenti, yukarıdaki nükleer anahat dalgalanmalarını analiz etmek ve karşılaştırılabilir bir boru hattı uygulamak için kullanılan eklentinin güncellenmiş bir sürümüdür.

1. SRSF2-GFP damlacıklarının akış filmlerinde, benzer boyutlarda (yarıçap ~2,5 μm) daha büyük damlacıklar seçin.
   NOT: Damlacıklar çok küçükse, yetersiz çözünürlük anormal yüzey dalgalanması ölçümlerine yol açacaktır.
2. Damlacığın etrafına bir dikdörtgen çizerek 15 sn'ye (Δt= 0,5 sn) yayılan damlacıkların hızlandırılmış görüntülerini kırpın ve Görüntü > Kırp'ı seçin (Şekil 5).
3. StackReg > Eklentiler'de Fiji StackReg eklentisiyle görüntüleri yeniden hizalayın ve Katı Gövde dönüşümü'nü seçin.
4. İşlem altındaki Fiji Düzgünleştir seçeneğini kullanarak damlacık etrafındaki gürültüyü gidermek için görüntüyü düzgünleştirin.
5. Fiji'de İkili İşlem altında Maskeye Dönüştür seçeneğini kullanarak ikili damlacık maskesi > oluşturun. Varsayılan yöntemi ve arka plan için Koyu kullanın (Şekil 5).
6. Fiji'de Analiz altında Parçacıkları Analiz Et seçeneğini kullanarak oluşturulan ikili damlacık maskesini analiz edin, Sonuçları Temizle ve Yöneticiye Ekle seçeneklerini seçin ve ilgi alanlarını (ROI'ler) RoiManager'a (Daha Fazla > Kaydet) Radioak tarafından okunacak zip formatında kaydedin. ROI'ler, her filmin Radioak tarafından bulunabilmesi için_UnetCortex.zip filmlerin aynı klasöründeki konturlar adlı bir klasöre, imagename adlı dosyalara kaydedilmelidir.
7. CIRB > Radioak > Fiji Eklentileri'nde, yalnızca bir filmi işlemek için Yarıçap Al'ı veya aynı klasördeki tüm filmleri analiz etmek için Bir Klasör Yap'ı seçin.
   NOT: Açı numarasını ve ölçeği seçmek için bir pencere açılır. Radioak, 0°'den 360°'ye (360 giriş) 1°'lik açı artışlarıyla fırlatıldı ve yarıçap değerleri çıkarıldı.
8. Analiz edilecek filmi veya filmleri içeren klasörü seçin. Sonuçlar, orijinal filmleri içeren klasördeki bir radyoakres dizininde .xls dosyaları (her film için bir tane) olarak sağlanır. Her dosya, her t (dilim olarak) ve her açı (radyan cinsinden) için ölçülen tüm yarıçapları r (ölçek parametresi doldurulmuşsa μm cinsinden) görüntüler; Şekil 5; Ek Tablo 3'teki .xls çıktı örneğine bakınız).
9. Elektronik tabloda, tanımlanan her açı için tüm t zaman noktaları üzerinden ortalama yarıçap R'yi hesaplayın ( Ek Tablo 4'teki örneğe bakın). Bu, zaman içinde ortalama şeklin çizilmesine izin verir.
10. Varyansı (r-R)² damlacık yüzeyi dalgalanmalarının ölçüsüne karşılık gelen^μm2 cinsinden çizin.

Sonuçlar

Şekil 3'teki görüntü panelleri, tipik bir tam büyümüş oosit örneklerini göstermektedir (Şekil 3A), tamamen büyümüş bir oositteki nükleoplazma YFP-Rango'yu ifade eder (Şekil 3B), tam büyümüş bir oositteki nükleoplazma doğru (sol panel; Şekil 3C) veya aşırı (sağ panel; Şekil 3C) SRSF2-GFP cRNA dozu ve SC35 antikoru kullanılarak tamamen büyümüş bir oositte nükleer beneklerin immün boyanması (Şekil 3D). SRSF2-GFP cRNA'nın mikroenjekte edilecek doğru dozu, SRSF2-GFP'nin ekspresyon profilleri ile nükleer beneklerin endojen profilleri arasındaki görsel karşılaştırmalara dayalı olarak tanımlandı.

Oositlerdeki sitoplazmik karıştırma kuvvetleri, STICS vektör haritaları ve görüntü korelasyon analizi (bkz.⁹ ve¹¹) kullanılarak laboratuvardan yapılan önceki çalışmalarda gösterildiği gibi, hem genetik (örneğin, FMN2-mutant fare) hem de kimyasal (örneğin, Cytochalasin D) hücre iskeleti bozulmaları ile azaltılabilir. Kontrol oositlerinin STICS haritaları, yüksek akış hızlarını gösteren renklerle çok sayıda vektör gösterirken, bozulmuş hücre iskeleti kuvvetlerine sahip oosit haritaları, düşük akış hızlarını gösteren renklerle daha az vektör gösterir. Benzer şekilde, kontrol oositlerinde görüntü korelasyonu, hücre iskeleti kuvvetleri bozulmuş oositlere kıyasla çok hızlı kaybolur. Bu, hücre iskeleti kuvvetleri⁹ bozulmuş oositlere kıyasla kontrol oositleri için eğrinin daha hızlı azalması veya eğri ters çevrildiğinde daha hızlı bir artış¹¹ ile korelasyon eğrilerinde gözlemlenebilir.

Hücre iskeleti kuvvetleri, çekirdeği ve iç organellerini, özellikle nükleer benekler^10,11 gibi nükleer yoğunlaşmaları çalkalar. Şekil 4A'da, kontrol oositlerinin çekirdeği, nükleer prob YFP-Rango kullanılarak görülebilen önemli periferik dalgalanmalara maruz kalmaktadır. Hücre iskeleti kuvvetleri bozulmuş oositlerde çekirdek şekli zaman içinde stabildir (Şekil 4C). Nükleer anahat dalgalanmalarının analizi, ajitasyonu kesin olarak ölçmek için anahtardır. Çekirdek sentroidinden çevresine olan mesafenin varyansını belirleyerek, (r-R)² (Şekil 4B), dalgalanmalar ölçülebilir, bu da nükleer ajitasyonun kontrol oositlerinde bozulmuş hücre iskeleti kuvvetlerine sahip oositlere göre 6 kat daha yüksek olduğunu gösterir¹⁰. Şekil 5A-B'de, nükleer benekler (SRSF2-GFP⁺ damlacıkları), yüksek zamansal çözünürlükte sitoplazmik kuvvetlerin kontrol ve bozulmuş bağlamlarında gösterilmiştir. Kontrollerde, damlacık yüzeyi, Radioak³² eklentisi kullanılarak görselleştirilebilen ve ölçülebilen, bozulmuş sitoplazmik kuvvetlere sahip oositlerdeki damlacık yüzeylerinden önemli ölçüde daha fazla dalgalanır. Görsel olarak, yeşil ve kırmızı renkler (Şekil 5A-B'nin alt görüntülerinde görülen Radioak çıktısı), eklentinin ardışık görüntüler arasında yüzey değişikliklerini algıladığı açıları gösterir ve beyaz, yüzey değişikliklerinin eksikliğini gösterir.

Şekil 1: Geç fare oogenezi ve erken embriyogenezin gösterimi. Geç oosit büyümesinde meydana gelen çekirdek merkezlenmesinin, oosit bölünmesi sırasında meydana gelen kromozom merkezlenmesinin ve embriyogenezin erken aşamalarının (1 hücreli ve 2 hücreli aşamalar) gösterimi. Dişi genomlar (oosit çekirdeği ve dişi pronükleus) pembe, erkek pronükleus mavi renktedir. Embriyo çekirdekleri (ebeveyn genomlarının füzyonundan sonra) mordur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Büyüyen fare oositlerinde ölçekler arasında sitoplazmik ve nükleer yeniden şekillenmenin gösterimi. Bu şekil^{, 9,10,11'den} elde edilen temel bulguları özetlemektedir. Sitoplazmanın aktomiyosin bazlı yeniden modellenmesi, nükleer ajitasyon ve uzay-zamansal ölçeklerde fonksiyonel nükleer biyomoleküler kondensat yeniden şekillenmesinin gösterimi. Nükleer beneklerin ölçek geçişli yeniden şekillenmesi, işlevleriyle ilişkili biyomoleküler reaksiyonları geliştirir (yani, pre-mRNA'nın eklenmesi). Bu protokolün, nükleer ajitasyonun yalnızca uzamsal ölçeklerde değerlendirilmesine izin verdiğini, ancak zamansal ölçeklerde değerlendirilmesine izin vermediğini unutmayın, çünkü tüm görüntüleme, görüntü çerçeveleri arasında 0,5 s'lik aynı zamansal çözünürlükle yapılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Tamamen büyümüş oosit ve nükleoplazmanın örnek görüntüleri. (A) Nükleolusu çevreleyen kromatini (camgöbeği) gösteren tamamen büyümüş bir oositin parlak alan görüntüsü. Noktalı beyaz bir daire çekirdeğin ana hatlarını çizer. (B) YFP-Rango eksprese eden canlı oosit çekirdeği; Nükleolde floresan bulunmadığına dikkat edin. (C) Doğru dozlarda cRNA (sol panel) veya yüksek dozlarda cRNA (sağ panel) mikroenjeksiyonundan sonra SRSF2-GFP eksprese eden canlı oosit çekirdeği örneği; Soldaki yoğunlaştırılmış (damlacık) ve çözünmüş fazlara ve sağdaki durumda bulunmadıklarına dikkat edin. (D) Sabit bir oositte nükleer benek immün boyama; C'dekiyle karşılaştırılabilir endojen ekspresyon profiline dikkat edin (sol panel). Ölçek çubukları = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kontrol ve bozulmuş nükleer anahat dalgalanmalarının eklenti çıktıları. (A) YFP-Rango'yu (üstte) ve Ovocyte_nucleus eklentisi tarafından oluşturulan karşılık gelen ikili maskeyi (altta) eksprese eden bir kontrol oosit çekirdeğinin hızlandırılmış hızı. (B) Nükleer anahat dalgalanmaları ilkesi, ölçümleri zaman içinde ve belirli bir yönde yapar. Yönler, 0° ila 360° arasında 1°'lik artışlarla θ dönme açısı ile tanımlanır. t=0 s (sarı) ve t=135 s (mor) olmak üzere iki temsili şekil temsil edilir. Mavi şekil, zaman içindeki ortalama şekle karşılık gelir. (C) Hem F-aktin (FMN2-mutant fare) hem de mikrotübüllerin (Nokodazol tedavisi;^10'da olduğu gibi) bozulması nedeniyle hücre iskeleti kuvvetlerinin azaldığı bir oositteki bir çekirdeğin nükleer anahat dalgalanmaları. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Kontrol ve bozulmuş damlacık yüzey dalgalanmalarının eklenti çıktıları. (A) Çerçeve başına 500 ms'de görüntülenen ve Buz Arama Tablosunda (LUT) (üstte) gösterilen bir kontrol SRSF2-GFP nükleer damlacığının kırpılması; Fiji tarafından üretilen aynı damlacığın ikili maskesi (ortada); ve Radioak eklentisi, damlacığın (altta) yüzey dalgalanmalarının analizinden sonra, eklentinin ardışık görüntüler ile beyaz arasında yüzey değişikliklerini tespit ettiği yeşil ve kırmızı gösterge açılarıyla, yüzey değişikliklerinin eksikliğini gösterir. (B) Hem F-aktin hem de mikrotübüllerin bozulması nedeniyle hücre iskeleti kuvvetlerinin azaldığı oositlerde bir nükleer damlacığın yüzey dalgalanmaları (^11'de olduğu gibi). Ölçek çubukları = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Ovocyte_nucleus eklenti analizi çıktısı örneği. Şekil 4A'da gösterilenle aynı çekirdek analiz edildi. Teta (θ) derece cinsinden açıdır ve t1 ila t600, zaman içinde dönüştürülebilen çerçeve numarasına karşılık gelir. Yarıçaplar μm cinsindendir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: Nükleer anahat dalgalanmalarını hesaplamak için kullanılan örnek elektronik tablo. Şekil 4A'da gösterilenle aynı çekirdek analiz edildi. Teta (θ) derece cinsinden açıdır ve t1 ila t600, zaman içinde dönüştürülebilen çerçeve numarasına karşılık gelir. Sekme Ham ve ortalama: Yarıçaplar μm cinsindendir. Sekme r-R: r-R mesafeleri μm cinsindendir. Tablo (r-R)²: Dalgalanma değerleri μm² cinsindendir. x ve y sekmeleri, Ham ve ortalama sekmesindeki yarıçapların Kartezyen koordinatlarına karşılık gelir. Ortalama şekil sekmesinde çekirdeğin zaman içindeki ortalama şeklini çizmeye izin verirler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 3: Radioak eklenti analiz çıktısı örneği. Şekil 5A'da gösterilenle aynı damlacık analiz edildi. Farklı zaman noktalarında ve açılarda ölçülen yarıçaplar gösterilir. Yarıçaplar μm cinsindendir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 4: Nükleer damlacık yüzey dalgalanmalarını hesaplamak için kullanılan örnek elektronik tablo. Şekil 5A'da gösterilenle aynı damlacık analiz edildi. Teta (θ) derece cinsinden açıdır ve t1 ila t600, zaman içinde dönüştürülebilen çerçeve numarasına karşılık gelir. Sekme Ham ve ortalama: Yarıçaplar μm cinsindendir. Sekme r-R: r-R mesafeleri μm cinsindendir. Tablo (r-R)²: Dalgalanma değerleri μm² cinsindendir. x ve y sekmeleri, Ham ve ortalama sekmesindeki yarıçapların Kartezyen koordinatlarına karşılık gelir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokoldeki temel adımlar, oositlerin hayatta kalmalarını veya normal işlevlerini^{etkilemeden uygun mikroenjeksiyonunu içerir 9,10,11} ve ayrıca nükleer benekler gibi ilgili yapıların doğru görselleştirilmesine izin verecek önceden tanımlanmış miktarlarda cRNA'nın mikroenjekte edilmesini içerir.

Sitoplazmik ve (intra)-nükleer dinamikler arasındaki bağlantıyı kurmak, hücre iskeletinin çekirdeği veya içini nasıl çalkaladığını incelerken çok önemlidir. Bu protokol, küçük değişikliklerle, sitoplazmik karıştırma yoğunluklarını nükleer YFP-Rango veya SRSF2-GFP damlacık dinamikleri (^11'de olduğu gibi) ile ilişkilendirerek buna izin verir. Devam etmek için, oositler, nükleer anahat veya damlacık dinamiklerini yakalamak için 491 nm'lik bir lazerle hemen 120 saniye filme alınmadan önce, sitoplazmik karıştırmayı yakalamak için parlak alan modunda 120 saniye boyunca filme alınmalıdır. Nükleer SRSF2-GFP damlacıkları durumunda, korelasyon, etkili difüzyon katsayılarını (bu protokoldeki 7. adıma bakın) görüntü korelasyon analizleri kullanılarak elde edilen sitoplazmik karıştırmanın ters çevrilmiş maksimum yoğunluk değerleriyle karşılaştırarak basitçe değerlendirilebilir (bu protokoldeki 4. adıma bakın). Bir diğer önemli nokta, damlacık yüzey dalgalanmalarının analizi için seçilen kondensatların boyutudur. Boyut yüzey dalgalanmalarının yoğunluğunu modüle ettiğinden, yanlılığı önlemek için karşılaştırmalı analizler için benzer çaptaki damlacıklar seçilmelidir.

Bu protokol için bazı sınırlamalar vardır. Nükleer anahat dalgalanmalarının analizleri, YFP-Rango veya NLS-GFP gibi tam nükleer içi boyamaya dayanır. Nükleer benekler üzerindeki analizler için, aşırı miktarda SRSF2-GFP cRNA'nın mikroenjeksiyonu, daha önce başkaları tarafından gözden geçirildiği gibi, bu kondens belirtecinin faz ayırma özelliklerinde belirgin değişikliklere yol açabilir (Şekil 3C)²⁶. Bu nedenle, eksojen protein ekspresyon profillerinin endojen olanlarla karşılaştırılabilir olduğunu doğrulamak çok önemlidir. Ayrıca, nispeten küçük damlacıklar (<2 μm yarıçap), burada tanımlanan araçlarla uzamsal çözünürlüğün sınırlamaları nedeniyle yüzey dalgalanma analizi boru hatlarından hariç tutulmalıdır. Bu çözünürlük sorunu genellikle, örneğin oosit çekirdeğindeki veya somatik hücrelerin önemli ölçüde daha küçük çekirdeğindeki daha küçük kondensatların yüzey dalgalanmalarını araştırmak için gerekli olabilecek daha kararlı mikroskopların kullanılmasıyla çözülebilir.

Genel olarak, bu protokol, fare oosit çekirdeğinin ölçekler boyunca aktin ve mikrotübül hücre iskeleti bazlı ajitasyonunun yakalanmasına izin verir. Spesifik olarak, sitoplazmanın hücre iskeleti tabanlı mobilizasyonunun, nükleer anahat dalgalanmalarının, sıvı benzeri nükleer benek yer değiştirmeleri ve yüzey dalgalanmalarının belgelenmesine izin verir. Diğer hücre tiplerinde yapılan bazı çalışmalar, bu konuların^{bazılarını} 38,39,40 bireysel uzamsal ölçeklerde değişen karmaşıklıktaki farklı protokoller aracılığıyla ele alsa da, bu basit protokol, söz konusu hücresel dinamikleri ilk kez tek bir iş hattında birden fazla ölçekte ele almak için gerekli araçları sağlar. Ayrıca, bu yaklaşımdan elde edilen veriler,^10,11'de olduğu gibi biyofiziksel modelleme ile tamamlandığında, aşağıdakilerin minimal invaziv bir değerlendirmesini mümkün kılar: i) nükleer mekanikteki değişiklikler¹⁰; ii) sitoplazmadaki hücre iskeleti bazlı aktif kuvvetlerin çekirdek^11'deki kondensatlara iletilmesi; ve iii) bu aktif enerjinin farklı hücresel bölmelere yayılması^10,11. Daha da önemlisi, bu protokol çok yönlüdür, çünkü yalnızca nükleolus²³ gibi diğer nükleer kondensatlara değil, aynı zamanda hem hücre iskeleti hem de nükleer kondensat davranışlarındaki değişikliklerin belgelendiği kanser hücreleri gibi diğer hücre tiplerine de uyarlanabilir^17,41.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 eğirme diski	Yokogawa
DMI6000B mikroskobu	Leica
Femtojet mikroenjektör	Eppendorf
Fiji
Filtre tekerleği	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Hassas Aletler	FD35-100
Metamorph yazılımı	Evrensel Görüntüleme,		versiyon 7.7.9.0
Mineral yağ	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 ve C57BL/6 fareler	Charles River Laboratories
Poli(A) Atık kiti	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD kamera	QImaging
RNAeasy kiti	Qiagen	74104
SC35 antikoru	Abcam	ab11826	Nükleer benek antikoru; fare IgG1 anti-SRSF2 / SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plazmid ve nbsp;	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Mikropipeti		Oosit toplama için uzmanlaşmış
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Termostatik oda	Ömrü Görüntüleme Hizmeti
Windows Excel	Windows