Ultra Kısa Kendi Kendine Birleşen Peptit Matrisinde SW1222 Hücre Hattından Kolorektal Kanser Organoidlerinin İmalatı ve Karakterizasyonu

Son yıllarda, kendi kendine birleşen peptitler (SAP'ler), doku mühendisliği uygulamaları için umut verici biyomalzemeler olarak ortaya çıkmıştır. SAP'ler, nanoliflerin kendiliğinden oluşumu, biyouyumluluk, biyolojik olarak parçalanabilirlik ve immünojenisite olmama gibi benzersiz özelliklere sahiptir ve bu da onları iskele geliştirme için çekici adaylar haline getirir¹. SAP'ler daha önce çeşitli hücre tipleri ile birlikte kullanılmıştır ve özellikle, bildirilen ultra kısa SAP'ler, 30'dan fazla geçişi kapsayan ve minimum kromozomal anormallik insidansı ile uzun süreler boyunca pluripotentliklerini korurken kök hücrelerin kapsüllenmesini kolaylaştırmıştır ^2,3,4. Bu nedenle, SAP'lerin organoid kültürde kullanımları için uyarlanması rasyonel bir sonraki adımı oluşturmuştur.

Organoidler, tek pluripotent hücrelerden ortaya çıkan karmaşık üç boyutlu yapılardır. Bu yapılar, daha sonra embriyonik ve doku büyümesinin gelişimsel süreçlerini in vitro⁵ çoğaltmak için kendi kendini organize eden çeşitli hücre tiplerine yol açar. Bu yenilikçi çerçeve, in vivo organların karakteristik genetik, fenotipik ve davranışsal özelliklerini verimli bir şekilde koruyarak in vitro araştırmalar için zorlu bir araç haline gelmiştir⁶. Bununla birlikte, organoid bazlı bulguların tezgahtan başucuna geçişindeki temel bir engel, tekrarlanabilirlik ihtiyacıdır⁷. Sonuçlardaki bu varyasyon, öncelikle, otantik doku mimarisinin olmaması ve organoid modellerde karşılaşılan doğal karmaşıklık ile birleşen, insan pluripotent kök hücrelerini özel hücre soylarına tam olarak ayırt etmenin zorluğuna atfedilir. Kök hücre ve organoid bazlı çalışmaların⁸ popülaritesindeki artış göz önüne alındığında, dinamik mekanik özelliklere ve integrin benzeri yapışma bölgelerine veya kontrollü bozunabilirliğe sahip iskelelere sahip biyomalzemelere yönelik artan bir talep olmuştur ^7,9. Bu özellikler, biyoişlevselleştirilmiş SAP'lerin stratejik kullanımı yoluyla etkili bir şekilde ayarlanabilir.

SAP'ler, iyi tanımlanmış yapılar halinde kendiliğinden organize olma yeteneğine sahip kısa amino asit dizileridir¹⁰. Bu peptitler genellikle, hidrojen bağı, elektrostatik etkileşimler ve hidrofobik etkiler^11,12 dahil olmak üzere kovalent olmayan etkileşimler yoluyla kendi kendine montajlarını sağlayan alternatif hidrofobik ve hidrofilik kalıntılar içerir. Bu peptitlerin kendi kendine toplanma süreci, öncelikle sistemin serbest enerjisini en aza indirme ihtiyacından kaynaklanmaktadır. Sulu bir ortamdayken, hidrofobik kalıntılar suya maruz kalmalarını en aza indirmek için bir araya toplanma eğilimindeyken, hidrofilik kalıntılar çevredeki su molekülleri ile etkileşime girer. Bu fenomen çeşitli nanoyapıların oluşumuna yol açar. Bu durumda, ultra kısa kendi kendine birleşen peptitler, peptit dizisine ve çevresel koşullara bağlı özelliklere sahip nanolifler oluşturur 2,12,13,14,15,16. Bu peptitler, tek tek peptit ipliklerinin birbirine paralel veya antiparalel hizalandığı ve hidrojen bağları ile stabilize edildiği β dönüşlü bir konformasyonu benimser (Şekil 1). Pozitif iyonların varlığı, nanolif oluşumuna yol açan kendi kendine birleşme işlemlerini hızlandırır.

Peptit nanofiberlerin, önemli miktarda suyu hapsetmek için doğuştan gelen bir yeteneğe sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu özellik, daha sonra hücresel çoğalma ve büyümeye elverişli biyouyumlu ve biyolojik olarak parçalanabilen üç boyutlu bir alan olarak ortaya çıkan bir hidrojelin oluşumunu kolaylaştırır. Bu kendi kendine birleşen peptit nanofiberler, doğal hücre dışı matris (ECM) ortamına özgü topografik özellikleri karmaşık bir şekilde taklit eder¹. Bu benzerlik, hücrelere fizyolojik yaşam alanlarını taklit eden bir ortam sağlar ve optimal hücresel aktiviteleri daha da teşvik eder¹⁷. Ayrıca, bu peptitlerin doğasında bulunan çok yönlülük, önemli ölçüde ayarlanabilirliğe izin verir⁴. Bu tür bir uyarlanabilirlik, matrisin sertlik, jelleşme kinetiği ve gözeneklilik gibi özelliklerinde değişiklikler yapılmasını sağlar. Bu adaptasyonlar, peptit dizisinde yapılan modifikasyonlar yoluyla elde edilir. Sonuç olarak, kendiliğinden birleşen peptitler (SAP'ler), çağdaş biyomateryal biliminde çok önemli bileşenler olarak ortaya çıkmış ve doku rejenerasyonu ve hücresel kültür için yaygın olarak iskele olarak kullanılmıştır^13,17.

Kendi kendine birleşen peptitlerin kritik avantajlarından biri, moleküler düzeyde kolayca sentezlenebilme ve modifiye edilebilme yetenekleridir. Bu avantaj, spesifik fonksiyonel grupların veya biyoaktif motiflerin peptit dizisine dahil edilmesine izin vererek, özel özelliklere ve işlevlere sahip peptitlerin tasarımını mümkün kılar 18,19,20 (Şekil 1B). Örneğin, biyo-işlevselleştirilmiş SAP'ler, ECM'yi taklit etmek ve RGD peptidi^19,21 kullanılarak farklılaşmayı teşvik etmek için tasarlanabilir. Peptit Ben-IKVAV'ın ayrıca ligand'a özgü motiety²² nedeniyle nöronal spesifik belirteçlerin ekspresyonunu önemli ölçüde arttırdığı bildirilmiştir. Bu peptitler ayrıca, hücre sağkalımını artırmak için integrin bağlayıcı peptitler gibi biyoaktif molekülleri gösterecek şekilde tasarlanabilir²³. Son olarak, yapılarına IKVAV ve YIGSR motiflerini dahil ederek anjiyogenezi teşvik etmek için diğer biyofonksiyonelleştirilmiş SAP'ler geliştirilmiştir²⁴.

Daha önceki bir yayında bildirilen biyoişlevselleştirilmiş SAP'ler, kendi kendine montajın, biyoişlevselleştirilmiş SAP'nin türetildiği saf peptit dahil edilerek daha da modifiye edilebileceğini göstermektedir²⁵. Bu SAP karışımları, biyokimyasal aktivitelerine ve fizikokimyasal özelliklerine göre değişen çok çeşitli SAP formülasyonları da sağlayabilir. Örneğin, amfifilik peptit IIFK, IKVAV motifinin dahil edilmesiyle örneklenen, çeşitli motiflerle biyoişlevselleştirmeye dayanabilen ultra kısa bir SAP'dir (Şekil 1B). Her iki peptit de hem tek başına hem de kombine olarak nanolifler oluşturabilir. Her formülasyon, farklı fiziksel özelliklere sahip hidrojellerle sonuçlanır (Şekil 2)

Bununla birlikte, SAP'lerin biyoişlevselleştirilmesinden elde edilen çok çeşitli potansiyel permütasyonlar ve alternatifler nedeniyle, organoid testi için hızlı ve uygun maliyetli bir seçenek sunmaya ihtiyaç vardır. Bu tür yoğun ve uygun maliyetli organoid değerlendirmesi için bir aday, insan kolorektal adenokarsinomundan^{türetilen SW1222} hücre hattıdır ^26,27. SW1222 hücreleri, organoidlere benzeyen 3 boyutlu yapılar halinde toplanmalarını sağlayan özelliklere sahiptir, bu da onları doku gelişimi ve rejeneratif tıp uygulamalarını incelemek için ideal bir model haline getirir. SW1222 hücrelerinin, LGR5 geni^27'nin içsel aşırı ekspresyonu nedeniyle organoid üretme yeteneğine sahip olduğu tespit edilmiştir. Bireysel LGR5 ⁺ kök hücrelerinden organoidlerin yaratılması, SW1222 hücrelerinin bir kolorektal kanser organoidinin morfolojik özelliklerini elde etme eğiliminin yanı sıra daha önce ikna edici bir şekilde sergilenmiştir²⁸.

Bu yöntem makalesinde, SW1222 hücreleri kullanılarak çeşitli biyofonksiyonel peptitlerin hücre yapışması ve lümen oluşumu üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve karakterize etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz (Şekil 3). Adım adım prosedürler ve görüntüleme analiz yöntemleri sağlayarak, organoidlerin biyofabrikasyonu ve organoid kültürü için basit SAP matrislerinin değerlendirilmesi hakkında değerli bilgiler sunmayı umuyoruz.

1. Tampon ve çözelti hazırlama

NOT: Belirtilen tüm konsantrasyonlar nihai konsantrasyonlardır.

1. Tam Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium'unu (IMDM) hazırlamak için sırasıyla% 10 ve% 1'lik bir nihai konsantrasyonda fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin ekleyin. Karanlıkta 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
2. Geçirgenlik tamponunu hazırlamak için MgCl₂ (3 mM), sükroz (300 mM) ve Triton X-100'ü (% 0.5) fosfat tampon salin (PBS) içinde karıştırın. Bu solüsyonu 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.
3. Bir bloke edici tampon hazırlamak için sığır serum albümini (BSA,% 1), glisin (0.3 M) ve Tween-20'yi (% 0.1) PBS'de birleştirin. Bu solüsyonu 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.
4. Steril koşullar altında 10x ila 2x PBS'yi ultra saf suyla seyreltin. Bu çözeltiyi 6 aydan fazla oda sıcaklığında saklayın.
5. 3 mg peptit tozunu ultraviyole ışık altında 30 dakika sterilize edin. Bir girdap karıştırıcı kullanarak çözmek için 500 μL ultra saf su ekleyin.
   NOT: Nihai konsantrasyon hedef konsantrasyonun iki katı olmalıdır, yani 6x konsantrasyon 1x konsantrasyon 3 mg / mL olacağından 3 mg / mL.

2. Peptitte SW1222'den kolorektal kanser organoid üretimi

1. Bir alikotu gece boyunca 4 °C'de çözdürün ve bodrum matrisi kontrolünü hazırlamak için gerekene kadar buzda tutun.
2. 24 oyuklu bir plakada her bir oyuğun ortasına 10 μL'lik bir damla 2x peptit çözeltisi yerleştirin. Plakanın oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmesine izin verin. Alternatif olarak, 6 oyuklu bir plakada oyuk başına 8-10 damlacık biriktirin.
   NOT: Konfokal ve elektron mikroskobunda kullanılması amaçlanan numuneler, steril bir lamel üzerine ekilirse manipüle etmek için daha erişilebilirdir.
3. 10 μL 2x PBS ekleyin. PBS çözeltisini ucu kullanarak hafifçe karıştırın. Jellerin en az 20 dakika stabilize olmasına izin verin ve damlacıkların neredeyse sağlam kalmasını sağlayın.
   NOT: PBS ilavesinin ve nazik karıştırmanın amacı, damlacığın bütünlüğünü korumak ve hidrojelin bir tabaka halinde yayılmasını önlemektir.
4. SW1222 hücrelerini% 0.125 tripsin-EDTA çözeltisi (5 mL) kullanarak ayırın. Hücreleri tripsin ile 37 ° C'de şişeden ayrılana kadar 5-10 dakika inkübe edin. Hücre topaklanmasını önlemek için şişeye dokunmaktan kaçının.
5. Tripsini etkisiz hale getirmek için 5 mL tam ortam ekleyin. 30 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak hücre süspansiyonunu filtreleyin. Alternatif olarak, agregaları parçalamak için 25 G iğneli bir şırınga kullanın.
6. 0.4 × 10⁶ hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve 10 μL'lik bir mikropipet kullanarak her peptit damlacığına 2 μL hücre süspansiyonu enjekte edin.
7. Damlacıkları 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra her bir oyuğa 0.5 mL takviye edilmiş ortam ekleyin.
8. Beklerken, ana stoğu (partiye bağlı olarak 8-12 mg/mL) takviye edilen ortamı kullanarak 3 mg/mL'lik bir nihai konsantrasyona seyrelterek bazal membran matris kontrolünü hazırlayın. Bu çözeltiye hücreler ekleyin (25 μL başına 800 hücre).
   NOT: Bazal membran manipülasyonu her zaman buz üzerinde yapılmalıdır. Hidrojele dokunmadan önce uçlar buz gibi soğuk PBS'de durulanmalıdır. Aksi takdirde, uçların içinde polimerizasyon meydana gelecektir.
9. Her kuyucukta 20 μL bazal membran çözeltisi damlacıkları levha. 37 °C'de 20 dakika inkübe ederek damlacıkların jelleşmesine izin verin. Malzeme jelleştikten sonra 0,5 mL tam ortam ekleyin.
10. Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin. Hücrelerin 4. gün gibi erken bir tarihte lümen oluşumu sinyallerini organize ettiğini ve gösterdiğini gözlemleyin.
11. Organoid büyümesini değerlendirmek için 1. gün, 4. gün ve 7. günde parlak alandaki hücreleri görüntüleyin.

3. Canlılık ve çoğalma

1. Canlılık testi için üç siyah kuyu plakası ve proliferasyon testi için üç siyah kuyu plakası hazırlayın. Oyuk başına 25 μL 2x peptit çözeltisi ekleyin ve aynı hacimde 2x PBS kullanarak jelleştirin. Hücreleri yukarıda açıklandığı gibi tohumlayın.
2. Proliferasyon plakasında boşluk olarak kullanılacak her peptit hidrojel formülasyonu için üç kuyucuk hazırlayın. Bunların üzerine hücre tohumlamayın.
3. Ortamı canlılık kuyusu plakasından çıkarın ve 1x PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
4. Calcein-ve etidyum homodimerini, memeli hücreleri için canlılık / sitotoksisite Kitinden (Malzeme Tablosuna bakınız) aynı ışık korumalı konik tüpe 8 μM'ye seyreltin. Bu çözeltinin 2 mL'sini ışık korumalı bir konik tüpte 2 mL PBS'ye hazırlamak için, 4 μL Calcein-stok çözeltisi ve 8 μL Etidyum homodimer-1 stok çözeltisi ekleyin.
5. Adım 3.4'te hazırlanan kalsiyum/etidyum homodimer çözeltisini 96 oyuklu plakaya ekleyin. Kuyucuk başına 100 μL ekleyin. Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
6. 1x PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın. Floresan mikroskobu altında 4x objektif kullanırken en az üç alan (orta, üst, alt, alt) veya 10x ve 20x objektif kullanırken en az beş alan (orta, sol üst, sağ üst, sol alt, sağ alt) görüntüleyin.
7. 90 μL'lik bir nihai hacim sağlamak için ortamı proliferasyon kuyusu plakasından çıkarın.
8. %10'luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 10 μL Alamar Blue çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
9. Işıktan koruyun ve 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 2-4 saat inkübe edin
10. Floresan (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) veya absorbansı (570 nm) ölçmek için bir kuyu plakası okuyucu kullanın. Boşluklar için elde edilen değerlerin ortalamasını alın ve bunları hücre içeren her bir kuyucuktan elde edilen değerlerden çıkarın.
11. Her koşulun sinyalinin ortalamasını alarak ve ilgili boşluklarının ortalamasını çıkararak proliferasyon değerlerini hesaplayın. Zamana karşı bağıl absorbans/floresan sinyalinin indekslenmiş bir kutu grafiği oluşturarak grafikler oluşturun.

4. Hücrelerin matrise yapışma deneyi

1. İki bağımsız 96 oyuklu plakada 100 μL peptit hidrojel hazırlayın.
2. Her oyuğa 20.000 hücre tohumlayın ve 100 μL ortam ekleyin. Plakaları 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 90 dakika inkübe edin.
3. İnkübasyondan sonra, sadece bir plaka alın ve 20-30 saniye boyunca bir P200 mikropipet kullanarak ortamı dikkatlice yeniden süspanse edin. Ucu jelden uzak tutarak hidrojeli bozmamaya dikkat edin. Alternatif olarak, hidrojel mekanik özellikleri buna izin veriyorsa (G' > 8.000 Pa), hareketli bir girdap kullanarak kuyu plakasının dört tarafına hafifçe vurun.
   NOT: Ortamın yeniden askıya alınması (veya girdapla kuyucuk plakasına vurulması), hem bağlanmamış hücreleri hem de matrisin yüzeyine zayıf yapışma olan hücreleri çıkaracaktır. Hücresel bağlanma 90 dakika içinde gerçekleşecektir, ancak bu bağlanmanın gücü spesifik peptit hidrojellerine ve bunların yapışkan ve bağlayıcı özelliklerine bağlı olarak değişecektir. Kolorektal organoid büyümesinin, sertlik değerleri 2.000 Pa'nın altında olan matrislerde tercih edildiği bilinmektedir. Bu nedenle, bu protokolde sunulan hidrojeller yumuşak ve kırılgan olduğundan, hafif mekanik stres kullanmaya özen gösteriyoruz.
4. Her iki kuyucuk plakasından 100 μL ortamı çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
5. 1 μg / mL DAPI çözeltisi hazırlayın. Tüm kuyucuklara 100 μL DAPI çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
6. Bir floresan mikroskobu altında temsili bir dizi alanı görüntüleyin. Piksel/mesafe oranını sabit tutmak için tüm görüntülerin aynı amaç kullanılarak elde edildiğinden emin olun.
   NOT: 10x hedef için dokuz alanı veya 20x hedef için 15 alanı görüntüleyin.
7. Floresan görüntülerini görüntü analiz yazılımına (örn. ImageJ) yükleyin ve tüm görüntülerdeki parçacıkları analiz edin.
   1. Image (Görüntü) menüsünden Type (Tür) seçeneğini belirleyin ve 8 bit'e tıklayın.
   2. Görüntü menüsünden Ayarla'yı seçin ve Parlaklık/Kontrast'a tıklayın. Otomatik düğmesine tıklayın | Uygula'yı tıklayın.
   3. Image (Görüntü) menüsünden Adjust (Ayarla) seçeneğini seçin ve Threshold (Eşik) üzerine tıklayın. Otomatik düğmesine tıklayın ve pencereyi kapatın.
   4. Analiz menüsünden, Parçacıkları Analiz Et'e tıklayın. Özetleme seçeneğini işaretleyin ve Tamam'ı tıklayın.
   5. Özet penceresinde, Dosya menüsünün üzerine gelin ve özet değerleri kaydetmek için Kaydet'e tıklayın.
8. Tüm görüntülerin sonuçlarını standart istatistik yazılımına aktarın.
9. Stresten önce ve sonra hücrelerin kapladığı alanın yüzdesini hesaplayın. Her koşula karşı alan yüzdesinin dizinlenmiş bir kutu grafiğini oluşturun.

5. Peptit hidrojeldeki organoidlerin immün boyaması

1. Adım 2.1-2.10'da açıklandığı gibi 4 gün boyunca 20 μL peptit hidrojel damlacıkları içinde 800 hücre tohumlayın.
2. 4. günde, ortamı çıkarın ve her bir kuyuyu 1x PBS kullanarak 2x yıkayın.
3. 400 μL% 4 formaldehit çözeltisi ekleyin. Kuyu plakasını oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
4. Formaldehit çözeltisini bir P1000 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
5. 1 mL geçirgenlik tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
6. Geçirgenlik tamponunu bir P1000 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
7. 0,5 mL bloke edici tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
8. Engelleme tamponunu bir P1000 ile çıkarın ve 1x PBS ile yıkayın.
9. Bloke edici tampondaki birincil antikoru üreticinin talimatlarına göre seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu). İki kuyucuğa 200 μL ekleyin.
10. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
11. Boyama solüsyonunu bir P200 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
12. İkincil antikoru, üreticinin talimatlarına göre bloke edici tamponda seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu). İkincil antikor çözeltisine 1:40 oranında falloidin konjugatını ekleyin.
13. Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında en fazla 3 saat inkübe edin. Boyama solüsyonunu bir P200 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
14. Bloke edici tamponda 1 μg / mL'lik bir DAPI çözeltisi hazırlayın. Her kuyucuğa 300 μL DAPI çözeltisi ekleyin.
15. Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
16. Boyama solüsyonunu bir P200 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
17. Işıktan koruyun ve 4 °C'de 7 güne kadar saklayın.

6. Matriksteki organoidlerin görüntülenmesi ve görüntü analizi

1. Lekeli numuneleri 10x'te bir epifloresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Sadece phalloidin ve DAPI kanallarını kullanın.
2. Cellopose yazılımını açın ve bir görüntü yüklemek için ctrl + L tuşlarına basın. Yazılım, seçilen görüntünün konumundaki tüm dosyalara erişebileceğinden, tüm floresan görüntüleri herhangi bir alt klasör olmadan tam konuma kaydettiğinizden emin olun.
3. Segmentasyon paneline kolonilerin ortalama çapını yazın ve ENTER'ı tıklatın.
4. Kolon organoidleri için özel bir model seçin ve Modeli Çalıştır düğmesine tıklayın.
   NOT: Burada, Cellpose2.0 29,30'da sıfırdan iki model kullanmanızı öneririz.
5. Maskeleri .npy dosyası olarak kaydetmek için ctrl + s tuşlarına basın.
6. Klasörün görüntüleri arasında hareket etmek için klavye oklarını kullanın ve klasördeki tüm görüntülerde iki nokta üst üste organoidleri modelini çalıştırın.
7. Klasörün bir kopyasını alın ve kolon organoid lümeni için bir model kullanarak 6.2-6.6 adımlarını tekrarlayın.
8. ImageJ'yi açın ve Eklenti | Makrolar | Koşmak... Cellpose Github sitesinde bulunan imagej_roi_converter.py dosyasını çalıştırmak için ve bir pencerenin görünmesini bekleyin.
9. İki nokta üst üste organoid klasöründen ilk dosyayı seçin ve Aç'a tıklayın.
10. İlk dosyaya karşılık gelen seg.npy dosyasını seçin ve Aç'a tıklayın.
    NOT: ImageJ, maskeleri ilgi alanlarına dönüştürecek ve bunları karşılık gelen floresan görüntülerle örtüştürecektir.
11. ROI Yöneticisi penceresinde Tümünü Seç'e tıklayın ve Ölç'e tıklayın.
12. Dosya | Farklı kaydet... tıklayın ve sonuçları kaydedin.
    NOT: Bu, alandaki her koloninin tüm şekil özelliklerini içeren bir .csv dosyasıyla sonuçlanacaktır.
13. Kolon organoid lümen klasöründeki aynı görüntü için 6.8-6.12 arasındaki adımları tekrarlayın.
14. OriginPro'yu yükleyin ve İçe Aktarma Sihirbazı'nı açmak için ctrl + 3 tuşlarına basın. Üç nokta düğmesine tıklayın ve aynı görüntü için organoid ve lümen şekil özelliklerine karşılık gelen her iki .csv dosyasını da seçin.
15. Her lümen ölçümünün ilgili koloni ile eşleştirildiğinden emin olmak için lümen şekli özelliklerinden elde edilen sonuçları kopyalayıp koloni sonuçlarının yanındaki bir sütuna yapıştırın.
16. Yeni bir sütunda, içerdiği koloninin göreli lümen alanını elde etmek için lümen ve koloni alanlarını bölün.
17. Her koloninin daireselliğine ve lümen alanına karşılık gelen sütunu seçin. Arsa Üzerine Tıklayın | Temel 2D | Dağılım.
18. Çizim penceresine sağ tıklayın ve Çizim ayrıntıları'nı seçin. Centroid(PRO) sekmesine tıklayın ve Alt Küme için Merkez Noktasını Göster, Veri Noktalarına Bağlan ve Elipsi Göster seçeneklerini işaretleyin.

İlk olarak, 24 oyuklu bir plakada büyütülen hücreleri 7 gün boyunca parlak alan görüntüleme kullanarak değerlendirdik. Şekil 4'te görüldüğü gibi, hafta boyunca organoidlere bir araya gelen küçük hücre kümelerini belirledik. Kontrollü bir tarama yöntemi, hücrelerin ve organoidlerin farklı günler arasındaki hareketliliğini takip edebilir. Genel olarak, tüm hafta boyunca hücrelerin morfolojisinin evrimine baktık. SW1222'den türetilmiş organoidler yuvarlak bir morfolojiye ve hafif bir görünüme sahip olmalıdır. Daha koyu bir görünüm, 7. gün Peptit P'de kültürlenen bazı kolonilerde görüldüğü gibi, istenmeyen daha yüksek bir hücre yoğunluğunu gösterir (Şekil 4).

Şekil 5 , sırasıyla ölü ve canlı hücrelerin miktarına ve metabolik aktiviteye işaret eden hücre canlılığı (Şekil 5A) ve proliferasyon testlerinin (Şekil 5B) sonuçlarını göstermektedir. Burada, kalsein ve etidyum homodimer bazlı bir canlılık testi kullandık ve bu hücrelerin Matrigel'de kültürlendiğinde 7. güne kadar küçük bir ölü hücre popülasyonu gösterdiğini fark ettik. Bu fenomen aynı zamanda tüm peptit bazlı hidrojellerde de mevcuttu, ancak 2D kültürde değildi. Proliferasyon sonuçları, 1. gün ile 7. gün arasında metabolik aktivitede toplam bir artış gösterdi. Ayrıca, çeşitli koşullar için 4. gün ile 7. gün arasında aktivitede hafif düşüşler bulduk. Bu gözlem, canlılık testinde görülen ölü hücre popülasyonundaki artışla ilişkilidir (Şekil 5A).

Hücreler arasındaki etkileşimin ve peptit hidrojellerin biyofonksiyonelleştirilmesinin bir ön değerlendirmesi için, hücre ayrılmasını indüklemek için mekanik strese dayalı bir yapışma testi gerçekleştirdik. Şekil 6'da görülebileceği gibi, biyofonksiyonel peptit P2'nin farklı konsantrasyonlarının kullanılması, ayrılma işleminden önce ve sonra tutulan hücre sayısını önemli ölçüde etkilemiştir. Burada, pozitif kontrol olarak sadece peptit P2'nin biyofonksiyonel motifini içeren bir peptit kullandık. Ayrıca biyofonksiyonel olmayan peptit P'yi negatif kontrol olarak kullandık. Grafikte görülebileceği gibi, peptit P'ye ekilen hücreler, nispeten düşük bir başlangıç yapışmasının yanı sıra düşük bir tutma değerine sahipti. Ayrıca, biyofonksiyonel peptit P2'nin oranındaki değişiklik, stresten sonra tutulan hücre miktarı ile ilişkilendirildi. Bu nedenle, bu tahlili kullanarak, P2 peptidinin, biyofonksiyonel motif tarafından yönlendirilebilen veya yönlendirilmeyen, ancak karışımda bulunan biyofonksiyonel peptit miktarı ile ilişkili olan hücre yapışmasını etkilediği sonucuna varabiliriz.

Daha sonra, fabrikasyon organoidlerdeki matrislerin etkisini araştırdık. Koloninin daireselliğini ve lümenin nispi boyutunu, 4 gün boyunca kültürlenen hücre iskeleti lekeli örneklerin şekil analizini yaparak koloninin boyutuna göre değerlendirdik. Veri noktaları, x ve y eksenleri boyunca belirli bir dağılıma sahipti ve her koşul, dairesellik ve göreceli lümen alanı için belirli bir değere sahip bir merkeze sahipti. Şekil 7 , 2D olarak kültürlenen hücrelerin koloni daireselliğinde çok yüksek bir varyasyona sahip olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, Matrigel'de kültürlenen hücreler, lümenin nispi boyutu için daha geniş bir dağılıma sahipti.

İlginç bir şekilde, peptit içeren tüm hidrojeller için sentroid değerler çok benzer bir konuma sahipti. Ancak, veri noktaları arasındaki mesafe farklı dağılım profilleri gösterdi. Örneğin, P3 peptidi, üç peptit hidrojel arasında daha küçük bir dağılıma sahipken, biyofonksiyonel olmayan peptit P'den gelen veri noktalarının daha büyük bir dağılıma sahip olduğu görülmüştür. Bu veriler, hem P1 hem de P3 içeren hidrojellerin organoid kültür için optimize edilme potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir.

Son olarak, apikal belirteçler ZO-1 ve ezrin için boyanmış bir örnek üzerinde immünositokimya kullanarak spesifik belirteçlerin ekspresyonunu değerlendirdik. Bu belirteçler, her bir organoid içindeki hücrelerin polarizasyonunun değerlendirilmesine izin verdi. Ayrıca hücre-hücre bağlantılarını görselleştirmek için pan kaderin belirteçlerini ve lümeni görselleştirmek için hücre iskeletine özgü bir belirteç (falloidin) değerlendirdik. Şekil 8A , biyofonksiyonel olmayan peptit P, biyofonksiyonelleştirilmiş peptit P1 ve Matrigel'de 4. ve 7. günde bulunan organoidleri göstermektedir. ZO-1 ve ezrin belirteçleri, organoidin apikal ve bazolateral membranları içinde lokalize edilmelidir; Uygun hücre polarizasyonu, her iki molekülün ekspresyonunu 4. güne kadar lümen alanının yakınında, aksi takdirde görünmez olarak gözlemlememize izin verecektir. Gerçekten de, Şekil 8'de görüldüğü gibi, ZO-1 ve ezrin belirteçleri, Matrigel'de kültürlenen organoidlerin apikal zarlarında bulunuyordu. İlginç bir şekilde, ezrin belirteçleri, biyofonksiyonel olmayan peptit P'de zar zor görülebiliyordu. Bundan, hücrelerin verimsiz polarizasyonunun, bu moleküllerin peptit P'de düşük bir ekspresyonu ile sonuçlandığı sonucuna varıyoruz.

Ayrıca, çekirdeklerin dağılımı peptit hidrojellerinde düzensiz olma eğilimindeyken, Matrigel'e gömülü organoidler tek, asimetrik bir çekirdek tabakası oluşturdu. Bu tanım, kolorektal bir organoid için ideal morfolojiyle eşleşir; bununla birlikte, peptit hidrojellerinde çekirdeğin oryantasyonu tamamen asimetrik olmasa da, çok katmanlı çekirdeğe sahip daha yoğun koloniler esas olarak biyofonksiyonel olmayan peptit P'de bulundu. Buna karşılık, hücre-hücre bağlantıları apikal ve bazolateral membranlara dik olarak lokalize edilmelidir (Şekil 8B). Bu işaretleyici, koloni içinde bulunan tüm hücrelerin kenarlarını gözlemlememizi sağladı. Matrigel'de büyütüldüğünde, hücreler 7. güne kadar neredeyse mükemmel bir radyal pan-kaderin (hücre-hücre bağlantıları) dağılımına sahipti. Buna karşılık, peptit P'dekiler gibi polarize olmayan koloniler, düzensiz bir hücre düzenlemesi ve bazal ve apikal zarın yakınında hücre-hücre bağlantılarının ekspresyonu sundu.

Şekil 1: Nanolifleri oluşturan ultra kısa kendiliğinden birleşen peptitler. (A) Alifatik ultra kısa peptitler için kendi kendine birleştirme işleminin tasviri. (B) IKVAV ligandı ile biyofonksiyonelleştirilmiş ultra kısa SAP IIFK'nın kimyasal yapısı. Bu rakam Loo ve ark.4'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Peptitlerin yapısı ve özellikleri. (A) Ana peptit IIFK'nın ve biyofonksiyonel peptit P2'nin kimyasal yapıları gösterilmiştir. (B) Ters çevrilmiş flakon testi sonuçları, kritik jelleşme konsantrasyonunu ve jelleşme süresi farklılıklarını ortaya çıkarır. P2, ana peptit IIFK'den daha yüksek bir CGC'ye sahip yarı saydam bir jel oluşturur. Özellikle, IIFK: P2 (1: 1) karışımı, tek başına her iki peptitten daha yüksek bir CGC ve daha uzun jelleşme süresi sergiler. (C) Taramalı elektron mikrografları, IIFK, P2 ve IIFK:P2 (1:1) karışımının yapısal özellikleri hakkında görsel bilgiler sağlar. (D) Atomik kuvvet mikroskobu yükseklik topografya görüntüleri, jelleşmiş peptitleri 8 mM'lik bir konsantrasyonda göstererek, yüzey özelliklerinin ayrıntılı bir görünümünü sunar. (E) Dairesel dikroizm spektroskopisi, IIFK:P2 karışımının çeşitli konsantrasyonlardaki konformasyonel değişikliklerini ortaya çıkararak ikincil yapı değişikliklerine ışık tutar. (F) Reolojik analizler, jelleşmiş peptitlerin farklı konsantrasyonlardaki sertliğini ölçer ve mekanik özellikleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Bu rakam Perez-Pedroza ve ark.25'ten alınmıştır. Ölçek çubukları = 1 μm (C), 200 nm (D). Kısaltma: CGC = kritik jelleşme konsantrasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Peptit hidrojellerde canlılık, yapışma, organoid oluşturma kapasitesi ve immünoboyama ile organoid üretimi ve karakterizasyonu için peptit hazırlama ve hücre tohumlamayı gösteren diyagram. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Matrigel kontrolü ile karşılaştırıldığında P ve P1 olarak etiketlenmiş peptit hidrojeller içinde yetiştirilen SW1222 hücrelerinden yakalanan parlak alan mikroskobu görüntüleri. İlginç bir şekilde, peptit hidrojellerinde kültürlenen organoidler, yedinci güne kadar ağırlıklı olarak küresel bir morfoloji gösterir. Buna karşılık, Matrigel içinde yer alanlar, SAP'deki organoid kültürünün karanlık gövdesine (siyah ok uçları) kıyasla, parlak gövdeleri tarafından söylenebilecek daha düşük bir hücre yoğunluğu sergiliyor gibi görünmektedir. Bununla birlikte, bitişik koloniler arasında belirgin bir kümelenme sergilerler. Ayrıca, Matrigel ortamındaki hücrelerin göç kapasitesinin nispeten azaldığı ortaya çıkmaktadır. Ölçek çubukları = 650 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Çeşitli konsantrasyonlarda biyofonksiyonelleştirilmiş SAP'de SW1222 hücrelerinin canlılık ve proliferasyon deneyleri. (A) Biyofonksiyonel peptit P1 ve P2'de kültürlenen hücrelerin Matrigel ve 2D ile karşılaştırıldığında canlılık değerlendirmesi. (B) Biyofonksiyonel olmayan peptit P1 ve biyofonksiyonel peptit P2'de hücre kültürünün Matrigel ve 2D kontrollere kıyasla proliferasyon değerlendirmesi. Burada, canlı/ölü tahlili için Matrigel'de büyüyen hücrelerinkine benzer bir davranış görüyoruz. Ölü hücrelerde (sarı ok uçları) hafif bir artış, başta Matrigel olmak üzere çeşitli koşullarda bulunur. Proliferasyon için, eğilimler peptidin türüne ve konsantrasyonuna bağlı olarak değişir, ancak genel olarak olumlu bir eğilim vardır. Ölçek çubukları = 250 μm. Bu rakam Perez-Pedroza ve ark.25'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Peptitin ayrılan hücre sayısı üzerindeki etkileri. (A) Mekanik stresten önce ve sonra DAPI ile boyanmış hücrelerin floresan görüntüleri. Burada peptit P, modifiye peptit P2 ve IKVAV motifini kullanıyoruz. (B) Hücre yapışmasındaki değişiklik, ImageJ'de kapsanan alan ölçülerek belirlendi. Karşılaştırmalı analiz, biyofonksiyonelleştirilmiş peptit P2'nin, biyofonksiyonel olmayan peptit P'ye kıyasla daha yüksek bir tutma kapasitesine sahip olduğunu ortaya koydu. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakam Perez-Pedroza ve ark.25'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Lümenin göreceli alanının daireselliğe karşı centroid hesaplaması ile organoid oluşturma kapasitesinin değerlendirilmesi. Verilerin merkezi ve dağılımı tedaviler arasında farklılık gösterdi. Beklendiği gibi, en kötü performans gösteren durum, geniş bir dairesellik değerleri aralığında genişleyen ve lümenin en düşük göreceli alanına sahip olan 2D ölçümlerdi. Matrigel sadece en yüksek daireselliğe değil, aynı zamanda en büyük lümene de sahipti. Peptit koşulları her iki değerde de biraz değişmiştir, ancak P3 koşulu verilerin en ihmal edilebilir varyasyonunu elinde tutmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Çeşitli belirteçler için organoidlerin 4. ve 7. günlerde konfokal mikroskopi görüntüleri. (A) ZO-1 (yeşil), ezrin (kırmızı) ve DAPI (mavi) belirteçleri, organoidler içindeki hücrelerin apikal dağılımını bulmak için kullanılır. Matrigel kontrolünde görüldüğü gibi, bu moleküller tipik olarak apikal ve bazolateral membranlarda lokalizedir. Biyofonksiyonel olmayan peptit P, bu moleküllerin ekspresyonunu sadece 7. günde gösterir. (B) Pan-kaderin (yeşil) antikorlarla boyanmış hücre-hücre bağlantı belirteçleri, organoidlerin bazolateral ve apikal zarlarına dik olmalıdır. Hücre çekirdeği (mavi) ve hücre iskeleti (kırmızı) karşı boyama olarak kullanılır. Biyofonksiyonel olmayan peptit P, diğer iki tedavinin (P3 ve Matrigel) aksine, bazolateral membranda hücre-hücre bağlantı ekspresyonunu indükledi. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.